北京油鸡purH基因结构与表达特征研究

提取北京油鸡8种组织的总RNA,利用RT-PCR检测purH基因mRNA的差异表达。将purH基因完整开放阅读框定向插入pEGFP-N3,构建带有GFP报告基因重组表达载体pEGFP-purH,利用脂质体介导法将其导入北京油鸡体外培养细胞中,进行G418药物筛选和克隆化培养。结果表明：北京油鸡purH基因（GenBank 登录号：EU334506）编码区为1782 bp,编码 593 aa的多肽,转染后24 h、48 h和72 h,pEGFP-purH转染率在10.3 %～53.2 %之间,绿色荧光均匀分布于细胞质与细胞核中,随表达量的增加,绿色荧光在细胞核中聚集成团块状或颗粒状。经药物筛选和克隆化培养,获得表达pEGFP-purH融合蛋白的克隆细胞株,RT-PCR与Western blotting检测确认pEGFP-purH已整合到北京油鸡成纤维细胞基因组中,在优化的条件下,阳性细胞凋亡率、生长与增殖状况与对照组比较差异不显著（P 〉0.05）。     

北京油鸡ADSL基因的克隆、表达及其结构与功能分析

采用RT-PCR与RACE方法扩增出北京油鸡腺苷酸琥珀酸裂解酶(ADSL)基因全长cDNA序列,亚克隆和序列分析结果表明:该基因开放阅读框长为1455个碱基,编码485个氨基酸;5'端非转录调控区具有典型管家基因的特征,在临近起始密码子27号碱基发生C→T突变,该突变使得本来小是核呼吸因子2(NRF-2)结合位点的CTCC突变为NRF-2结合位点CTTC.将ADSL基因完整斤放阅读框重组至融合表达载体pGEX-4T-l中,构建成北京油鸡ADSL基因融合表达载体pOEX-ADSL,转化大肠杆菌BL21(DE3),筛选阳性克隆,IPTG诱导表达.经SDS-PAGE电泳显示重组融合蛋白在约80.5kD处有特异蛋白条带出现,与预期分子量大小一致,等电点为6.79.该蛋白的表达最随诱导时间的延长而增加,5h达最高值,达到细胞总蛋白的26.9%,且主要以不可溶的包涵体形式存在,经优化表达条件,成功地获得了可溶性的融合蛋白,经Glutathione Sepharase 4B凝胶纯化后Western blotting检测表明其为北京油鸡ADSL蛋白,为其进一步的生物学功能及其应用研究鉴定基础.     

北京油鸡α1-AGP基因结构与表达特征研究

提取北京油鸡心、肝、脾、肺、肾、脑、腿肌与胸肌等不同组织的总RNA, 利用RT-PCR方法检测a1-酸性糖蛋白基因(a1-AGP)mRNA的差异表达。将a1-AGP基因完整开放阅读框定向插入pEGFP-C1, 构建带有GFP报告基因的重组表达载体pEGFP-α1-AGP, 将其导入北京油鸡体外培养细胞中, 并进行G418药物筛选和克隆化培养。结果表明: a1-AGP基因开放阅读框长度为612 bp, 编码203个氨基酸, 在北京油鸡肝、肺、腿肌和胸肌中有表达; 转染后24、48和72 h, pEGFP- a1-AGP转染率在31.3%~47.6%之间, 绿色荧光主要集中在细胞核中, 随着表达量的增加, 绿色荧光在细胞核中聚集成团块状或颗粒状, 经药物筛选和克隆化培养, 获得表达pEGFP-a1-AGP融合蛋白的阳性克隆细胞株, 利用RT-PCR与Western blotting检测确认pEGFP-α1-AGP已整合到北京油鸡成纤维细胞的基因组中, 在优化的条件下, 阳性细胞凋亡率、形态、生长与增殖状况与对照组比较差异不显著(P >0.05)。     

不同品系肉鸡Gimap5基因的表达与功能

GTP酶免疫相关蛋白5 (GTPase immune-associated protein 5, Gimap5)参与T细胞稳态调控,在免疫和炎性反应等过程中发挥重要作用,但其在禽类中的功能与特性研究未见报道。文中以AA+肉鸡和三黄鸡为模式动物,利用RT-PCR克隆Gimap5基因全长编码序列并进行生物信息学分析,RT-qPCR技术分析Gimap5基因的组织表达分布特性及其在炎症反应中的功能特性。AA+肉鸡和三黄鸡Gimap5基因全长编码序列均为771bp,编码256个氨基酸,在不同物种间保守性较低。Gimap5蛋白N-末端AIG-1结构域和C-末端跨膜序列的α-螺旋结构分别在蛋白功能和细胞定位中可能发挥重要作用。Gimap5基因在AA+肉鸡和三黄鸡各组织中均有表达且变化规律相似,但两品系鸡之间或同一品系鸡不同组织间表达活性存在差异。在炎症反应中,Gimap5基因在血和肝脏中活性均显著下调(P<0.05),而在法氏囊中显著上调(P<0.01)。推测Gimap5是一个参与机体发育和炎症免疫反应的多功能基因,并具有炎症反应诊断标记物的潜在应用价值。     

北京油鸡MSAP毛细管电泳荧光检测技术的建立

采用毛细管电泳荧光检测技术, 对北京油鸡肌肉组织基因组进行甲基化敏感扩增片段多态性(Methylation sensitive amplified polymorphism, MSAP)检测。通过对基因组DNA用量、预扩产物稀释倍数、选择性引物浓度、Mg2+浓度、dNTPs浓度和电泳内标量等6个主要参数进行分析和优化, 建立了适合北京油鸡基因组DNA甲基化分析的MSAP毛细管电泳荧光检测技术。重复实验表明, 建立的毛细管电泳荧光标记的MSAP检测技术能够自动地、高通量地分析北京油鸡基因组的DNA甲基化状态, 也适用于其他动植物基因组的DNA甲基化研究。     

差异表达基因分析

细胞在增殖,分化及对外界刺激反应过程中,可伴随某些特殊基因的表达,利用这一特性,通过比较细胞在不同状态及不同分化阶段基因表达的差异,可以发现与细胞分化／生长相关的基因,近年来国外学者发展了几种能有效进行差异表达基因分析的技术和方法,包括差异显示PCR,代表性差异分析,抑制性消减杂交及DNA微阵列等。本文主要对目前主要技术方法作一综述。     

家蝇幼虫差异表达基因的克隆筛选与分析

目的是利用mRNA差异显示(DDRT-PCR)技术对诱导后家蝇幼虫差异表达基因进行克隆分析。取诱导和未诱导家蝇(Musca domestica vicina)三龄幼虫总RNA进行mRNA差异显示反应,产物经6％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳展开,银染分析后,回收差异显示条带。随机选取4条诱导家蝇三龄幼虫中上调表达的基因条带,进行Northern杂交验证,有2条被验证为真实带,命名为YD1和YD2。对这2条基因片段进行T-A克隆和测序,长度分别为495bp和265bp,登录NCBI运用Blastn程序进行同源性比较,发现两者与任何已知基因同源性都低于70％,提示为两个未报道的新基因,在家蝇免疫反应中可能起着一定的作用。     

北京油鸡肺间充质干细胞的分离培养及鉴定

以9-14日龄北京油鸡肺脏组织为材料,Ⅳ型胶原酶消化,percoll分离,获得肺间充质干细胞.进行免疫组化和RT-PCR鉴定,并比较3种培养体系对北京油鸡肺间充质干细胞增殖的影响.RT-PCR结果显示,细胞免疫组化签定结果CD44、CD29呈阳性,CD34呈阴性.证实所培养的细胞为北京油鸡肺间充质干细胞;比较不同扩增培养体系,结果表明,培养体系DMEM/F 12+10％FBS+2.5 ng/mL bFGF较有利于北京油鸡肺间充质干细胞的增殖.该试验成功地分离并鉴定了北京油鸡骨骼肌卫星细胞,建立了适于北京油鸡肺间充质干细胞体外扩增的培养体系.     

中外两品种鸡胸肌组织差异表达基因的研究

运用mRNA差异显示技术对北京油鸡和AA肉鸡胸肌组织基因的差异表达进行研究, 从分子水平分析导致两品种肌肉组织基因差异表达的机制。通过反向Northern dot blot技术验证共筛选出差异表达基因7条, 经与GenBank数据库进行相似性比对, S1与HMGN3基因有较高同源性; S3与ChEST294a8有很高同源性, 但功能未知; S4和S5与鸡的磷酸葡萄糖变位酶Ⅰ同源性很高; S6和S2与已有核酸数据库中的基因克隆或EST具有较高同源性, 为已知的EST, 但功能未知; 序列S7未在数据中发现同源序列, 可以确定其在AA肉鸡中特异表达,确定为新发现的EST(GenBank登录号: EU594549)。为进一步研究中外两品种鸡胸肌组织基因差异表达机制奠定了基础。     

纳豆芽胞杆菌对AA肉鸡生产性能以及免疫功能的影响

目的 探讨纳豆芽胞杆菌作为饲料添加剂对AA肉鸡生产性能和免疫功能的影响。方法 将300只1日龄的AA健康肉鸡,随机分为5组,对照组饲喂基础日粮,实验组在基础日粮中分别添加50、100、150和200 mg/kg纳豆芽胞杆菌（处理组I~IV）,检测其对AA肉鸡增重、饲料转化率、新城疫疫苗免疫后的抗体水平和免疫器官指数的影响。结果 在21 d时,处理4个组肉鸡的体重分别较对照组高0.23%、6.16%、8.29%和7.82%,其中处理组II、III与对照组相比差异有统计学意义（P＜0.05）;处理组I、IV与对照组相比差异无统计学意义（P＞0.05）;在7~28 d时处理4个组肉鸡的饲料转化率均稍高于对照组,但差异无统计学意义（P＞0.05）;当21 d时,处理组II、III的效价水平与对照组、处理组I及IV相比差异有统计学意义（P＜0.05）。处理组I~IV的胸腺、脾脏以及法氏囊三项指数均显著优于对照组,尤其是处理组II和III的免疫器官指数提升最为显著（P＜0.05）。结论 在AA肉鸡基础日粮中添加100、150 mg/kg的纳豆芽胞杆菌对于其生产性能的改善和免疫功能的提高有显著效果。     

利用基因芯片技术研究两品种鸡脂肪组织差异表达基因

应用包含9024条鸡cDNA的表达谱芯片,对从两品种鸡脂肪组织抽提及纯化的mRNA进行芯片杂交,并对基因表达谱进行分析,旨在筛选高脂肉鸡和白耳蛋鸡脂肪组织差异表达的基因,探讨造成两品种体脂性状差异的分子生物学机理。结果按差异显著阳性标准分析,共筛选出差异表达基因67条,主要涉及脂类代谢、能量代谢、细胞骨架构成、转录和剪接因子以及蛋白质合成与分解等相关基因,此外,还筛选出一些尚未在GenBank上登陆的序列,推测可能是未知的新基因,它们在鸡脂类代谢的过程所起到的作用还需进一步实验证明。     

肥胖与脂肪组织巨噬细胞的研究进展

肥胖被认为是一种慢性促炎症疾病。近年来巨噬细胞在肥胖的发生过程中起的重要作用越来越被研究者们所重视。研究发现脂肪组织巨噬细胞(ATMs)的极化和招募在肥胖的发生过程中扮演着重要角色:在肥胖的脂肪组织中,巨噬细胞M1/M2的比例出现失衡即M1促炎巨噬细胞比例上调M2抑炎巨噬细胞比例下调导致脂肪组织慢性炎症;脂肪组织的局部炎症发生时周边组织巨噬细胞招募至脂肪组织也能够促进肥胖的发展进程。本文就肥胖的发生与脂肪组织巨噬细胞的极化和招募的关系作一综述。     

A Model-Based Joint Identification of Differentially Expressed Genes and Phenotype-Associated Genes

Over the last decade, many analytical methods and tools have been developed for microarray data. The detection of differentially expressed genes (DEGs) among different treatment groups is often a primary purpose of microarray data analysis. In addition, association studies investigating the relationship between genes and a phenotype of interest such as survival time are also popular in microarray data analysis. Phenotype association analysis provides a list of phenotype-associated genes (PAGs). However, it is sometimes necessary to identify genes that are both DEGs and PAGs. We consider the joint identification of DEGs and PAGs in microarray data analyses. The first approach we used was a naïve approach that detects DEGs and PAGs separately and then identifies the genes in an intersection of the list of PAGs and DEGs. The second approach we considered was a hierarchical approach that detects DEGs first and then chooses PAGs from among the DEGs or vice versa. In this study, we propose a new model-based approach for the joint identification of DEGs and PAGs. Unlike the previous two-step approaches, the proposed method identifies genes simultaneously that are DEGs and PAGs. This method uses standard regression models but adopts different null hypothesis from ordinary regression models, which allows us to perform joint identification in one-step. The proposed model-based methods were evaluated using experimental data and simulation studies. The proposed methods were used to analyze a microarray experiment in which the main interest lies in detecting genes that are both DEGs and PAGs, where DEGs are identified between two diet groups and PAGs are associated with four phenotypes reflecting the expression of leptin, adiponectin, insulin-like growth factor 1, and insulin. Model-based approaches provided a larger number of genes, which are both DEGs and PAGs, than other methods. Simulation studies showed that they have more power than other methods. Through analysis of data from experimental microarrays and simulation studies, the proposed model-based approach was shown to provide a more powerful result than the naïve approach and the hierarchical approach. Since our approach is model-based, it is very flexible and can easily handle different types of covariates.     

脂肪组织外泌体与机体其他组织互作研究进展 *

脂肪作为机体内最大的分泌器官,可以通过释放激素,细胞因子等调节其他的组织器官.近年来研究发现,脂肪组织可以释放外泌体并通过体液循环传递信号至其他组织器官,调节其靶器官的生理功能,且针对不同的靶器官,外泌体会产生不同的作用效果.机体的稳态是各组织间相互作用的结果,外泌体的发现,为脂肪组织与其他组织互作提供了稳定的物质基础,但是,脂肪外泌体的作用依旧存在着许多未知效果.从脂肪组织外泌体的发现,鉴定,以及脂肪外泌体与肝脏,肌肉和其他组织器官的相互作用等方面进行综述,为脂肪外泌体的研究提供理论依据,以便更好地探索生命的奥秘.     

应用抑制性消减杂交技术筛选流感病毒感染宿主应答基因

从宿主系统寻找病毒感染特异性相关的生物大分子是研究病毒药物靶标和诊断标志物的新方向 .为了筛选宿主细胞中流感病毒感染特异性基因 ,采用抑制性消减杂交技术 (SSH) ,以流感病毒A 鲁防 93 9(H3N2 )感染MDCK细胞及正常MDCK细胞为材料 ,构建病毒感染特异性差减cDNA文库 ,PCR法扩增鉴定其中插入片段大小 .从差减文库中随机挑取 10 0个克隆进行测序 ,用生物信息学方法对其同源性和基因功能进行分析和预测 .结果显示 ,成功构建了流感病毒感染特异性差减cDNA文库 ,文库中cDNA片段长度在 2 5 0～ 10 0 0bp之间 .从文库中随机选取 10 0个克隆测序 ,获得了 95个有效序列 ,经blast同源性分析发现 ,大部分基因为参与宿主细胞能量代谢和蛋白质生物合成过程中的基因 ;其中 19个为无任何功能线索的新基因片段 .流感病毒感染特异性差减cDNA文库的建立和筛选出病毒感染应答候选新基因cDNA片段 ,为发现新型流感病毒药靶和诊断标志物以及病毒感染机制研究打下基础