一种简单、快速制备与转化大肠杆菌受体细胞的方法

用TSB溶液取代常规的CaCl₂溶液,制备大肠杆菌受体细胞。在菌体处于对数早期时离心收集细胞,用TSB缓冲液悬浮后,即可用于质粒DNA的转化。转化效率可达10⁷～10⁸转化子／μgDNA。     

基于网络药理学和实验验证探究糖肾宝复方治疗糖尿病肾病的作用机制

网络药理学方法结合分子生物学实验探究糖肾宝复方（Tangshenbao compound,TSB）治疗糖尿病肾病（diabetic nephropathy, DN）的作用机制。使用TCMSP、Pubchem、Swiss Target Prediction数据库,结合相关文献,得到TSB相关活性成分与靶点;通过GeneCards、DisGeNET、OMIM数据库,获得TSB治疗DN候选靶点;利用在线作图软件绘制“TSB-DN”候选靶点Venn图,并结合Cytoscape 3.7.2软件进行GO和KEGG富集分析;然后使用PyMOL、AutoDock Tools和AutoDock Vina软件完成活性成分配体与靶蛋白晶体结构对接;再通过体外培养小鼠肾小球系膜细胞Mcs进行细胞实验验证,实时荧光定量PCR检测各组细胞中STAT3、PIK3CD、PIK3R1、MAPK8及关联性靶点Ets-1 mRNA表达水平,CCK-8法检测24 h后的细胞活性。结果发现,Swiss Target Prediction数据库合并处理后共获得TSB作用靶点835个,联合GeneCards、DisGeNET、OM...     

利用甲壳素固定大肠杆菌（E.coli）细胞转化苯丙酮酸形成L—苯丙氨酸的研究

利用甲壳素作为固定化介质,能够保留83.3％的游离细胞转氨酶活性,以0.35mol/L苯丙酮酸为前体,于37℃下反应9小时,可产L-苯丙氨酸54.3g/L,其克分子转化率为94％。同时,用25％戊二醛溶液(30μl/g·cell)处理细胞1小时,再用0.3％OP溶液浸泡处理15小时,可以使固定化细胞转化率有较大的提高,Mg~(2+)对转化也有促进作用。     

固定化简单节杆菌细胞用于醋酸可的松转化的研究——固定化载体对转化作用的影响

海藻酸钙包埋简单节杆菌细施回收率达89％。将凝胶用磷酸缓冲液溶解后测定活力证明固定化过程对细胞活力没有显著影响,但转化高浓度底物时,有效活力很低。将菌种接八聚丙烯酰胺凝胶后进行培养、活化,制得了高活力的固定化细胞,可用于转化高浓度的底物。测得产物醋酸泼尼松在海藻酸钙和聚丙烯酰胺凝胶中与溶液间的分配系数分别为1．29和 O．69。作者认为产物的亲凝胶性可能是阻碍海藻酸钙凝胶包埋细胞进行转化反应的重要因素。     

啤酒酵母菌对无机硒的有机转化

利用啤酒酵母菌对无机硒(亚硒酸钠)进行有机转化。通过在培养基中加入不同浓度的无机硒溶液和不同时间加入无机硒溶液,于28℃、220 r/min摇床条件下培养5 d,离心得菌细胞,测定前样品预处理:破碎菌细胞,显微镜下计数,计算破碎率,破碎后的菌体装入透析袋于蒸馏水中透析除去无机硒。准确测定无机硒,用浓硫酸-高氯酸的消化体系消化样品后,紫外分光光度法于335 nm处测量吸光度,在标准曲线上查出硒含量,计算无机硒的转化率。啤酒酵母菌的最佳加硒时间为24 h,亚硒酸钠浓度大于12μg/mL对啤酒酵母菌转化无机硒有明显抑制作用,啤酒酵母菌对无机硒的摄入率约为62%,转化率约为53%;超生波细胞粉碎仪破碎细胞的破碎率为55%左右。结果表明,啤酒酵母菌可以转化无机硒。     

高效、快速地将外源DNA导人根癌土壤杆菌

室温下用50mmol/L CaCl₂处理根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)以制备感受态细胞．然后经O℃冰浴及28℃热击处理,成功地将Ti质粒中间载体(>10kb)导入了根癌土壤农杆菌中。转化效率每个活细胞可达10 -4～10 -5转化子或10 6转化子／μgDNA。探讨了该菌细胞生长状态、CaCl2溶液浓度、温度、液氮、热击、复苏时间以及感受态细胞于4℃或-20℃(加15％甘油)下保存时间对根癌土壤杆菌转化的影响。     

细胞培养中癌变原理的研究——Ⅱ.用胰蛋白酶-G-分带法对转化的和正常的金仓鼠乳鼠肺细胞核型的比较分析

用胰蛋白酶-G-分带法对用甲基硝基亚硝基胍(MNNG)转化的金仓鼠乳鼠肺细胞及未转化正常细胞的核型进行了比较分析。为了便于控制胰蛋白酶处理的时间,采用较稀的(0.01%)胰蛋白酶溶液,在室温和pH 8.2条件下处理1—3分钟,然后染色(两步法);或将胰蛋白酶直接加在染液中(一步法),均取得较好的结果。用MNNG 转化的金仓鼠乳鼠肺细胞BHLB-4 系,其染色体众数仍保持二倍性,但用G-分带法进行核型分析的结果表明,某些表面上看来是二倍体的分裂相,其核型实际上是不正常的,表现为某些染色体的单体性或三体性,并出现额外染色体,故称之为假二倍体核型。由此可见,在转化过程中,金仓鼠乳鼠肺细胞的核型发生了一定的改变,但除第8号染色体单体性的出现频率较高(7/20)外,未发现其他规律。     

单纯疱疹病毒Ⅱ型使人胚肺细胞转化的实验研究

用紫外线灭活的单纯疱疹病毒Ⅱ型使人胚肺细胞发生转化,获得三系转化细胞。转化细胞呈多角形,似上皮细胞。细胞形态符合瘤细胞特征。细胞染色体数目明显增多,呈超二倍体型。体外培养时,细胞长满单层后极易堆集重叠生长成锥体细胞群,提示细胞的生长接触抑制消失。用间接免疫酶试验证实转化细胞内存在HSV特异抗原。HSV抗原在第51代转化细胞内仍持续存在。     

固定化大肠杆菌细胞生产Y—氨基丁酸的研究

用海蔑酸钙包埋法将大肠杆菌细胞制成固定化细胞,与1％谷氢酸溶液进行间歇反应,连续搅拌式反应及连续柱式反应生产丫—氨基丁酸。谷氨酸溶液用0．2mol／L醋酸-醋酸钠缓冲液调至pH．4,温度37℃。间歇反应在微生物多用培养箱旋转摇床上120r／mm振荡反应,每批反映6h．100％的谷氨酸可转化为丫—氨基丁酸。连续搅扑式反应在三角瓶反应器中进行,以Gml/h的流速输入底物溶液,输出反应液,转化率达8;％。连续柱式反应在上部膨大、顶端开口的特殊柱反应器中进行,控制流速12ml／h,95％以上的谷氨酸可被转化成Y-氨基丁酸。     

用Epstein-Barr病毒转化技术建立分泌人单克隆抗体B淋巴细胞系的条件

用以去除T淋巴细胞的E—玫瑰花形成法中所用的羊红细胞(SRBC),其保鲜程度对EB病毒转化B淋巴细胞的结果有一定影响,用保存1天的SRBC者,转化细胞的抗体分泌时间较长(8～10周),并且能形成传代细胞系;用保存17天的SRBC,转化细胞的抗体分泌时间较短,未能无限传代。分离外周血单个核细胞时,保留自体粘附细胞作为饲养细胞,转化的细胞二个月的成活率可达75％,而不保留粘附细胞者,转化细胞成活率仅40％。能产生抗-HBc抗体的EBV转化细胞,自然分泌抗体时间一般不超过10周,高峰期在3周以内,第2周时最高。EB病毒感染后的转化细胞5天开始克隆,一般细胞难成活,在14天克隆的,成活率可达100％。21天开始克隆的转化细胞,免疫球蛋白自然分泌维持12周以上,而在35天开始克隆的细胞,维持分泌的时间都不超过10周。以未经γ线照射的小鼠腹腔渗出细胞作饲养细胞,可支持转化3周的细胞克隆扩增,克隆成活率可达100％,而对照组克隆成活率仅为64.7％。     

靶向沉默HIF-1α信号通路抑制百草枯中毒诱导的肺泡上皮细胞上皮间质转化

目的:探讨HIF-1α信号通路在百草枯(paraquat,PQ)诱导大鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞上皮间质转化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)中的作用机制。方法:使用20μmol/L浓度的百草枯溶剂对大鼠Ⅱ型肺泡上皮RLE-6TN细胞干预24 h,随后在倒置光学显微镜观察各组细胞形态学变化;用real-time PCR与Western blot法检测RLE-6TN细胞中HIF-1α、上皮表型标记蛋白E-cadherin及间质表型标记蛋白Vimentin的表达,Transwell侵袭实验检测各处理组细胞侵袭能力的改变;使用HIF-1α靶向si RNA抑制其表达后,进一步采用RT-PCR和Western blot检测HIF-1α、E-cadherin和Vimentin的表达水平,Transwell法检测细胞侵袭能力变化。结果:体外百草枯溶液可显著诱导大鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞RLE-6TN细胞HIF-1α表达升高和上皮间质转化的发生,同时细胞的体外侵袭能力也增强。靶向沉默HIF-1α基因后,百草枯诱导的上皮间质转化过程被逆转,同时细胞侵袭能力显著减弱。结论:百草枯通过调控HIF-1α信号通路来诱导RLE-6TN细胞上皮间质转化的发生,进而促进肺纤维化的形成。     

p53 cDNA的克隆及在CV-1细胞中的表达

构建了可在哺乳动物细胞表达人p53基因的重组质粒pSV2neo-p53,并通过脂质体lipofectin介导转染猴肾细胞CV-1,用新霉素类抗生素G418筛选出阳性克隆。用原位杂交法检测转化细胞中的p53 mRNA;用免疫组化ABC法证明转化细胞的胞核中有p53蛋白表达。     

蓝藻的一种人工转化系统研究

本研究用溶菌酶处理ＳｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓＰＣＣ６３０１细胞诱导人工感受态,并用外源质粒ｐＢＲ３２５转化受体细胞表达氯霉素抗性,转化频率接近５×１０￣（－５）转化子／细胞。用转化子ＤＮＡ再进行次级转化,转化频率可达５×１０￣（－４）转化子／细胞。这比以前的研究者对同种藻株,用克隆的ＤＮＡ、通过生理感受态进行转化得到的转化频率要高。ＤＮＡ电泳、次级转化和斑点杂交证明外源质粒通过单交换已经整合到了受体细胞染色体上。这些结果表明,人工转化系统是有效的,并具有可重复性。对于影响转化的一些条件,如ＤＮＡ与细胞保温时间、藻龄、光照或黑暗培养,也同时进行了研究。     

植物细胞的转化系统

本文系统地论述了目前植物细胞各种转化系统的技术特点、基本原理和研究进展,对植物细胞转化概念的广泛含义进行了初步的讨论,文中指出了转化系统对植物细胞分子遗传学及遗传工程的重要意义,最后指出了转化系除了上述各种转化系统外,用已转化的冠瘿瘤细胞原生质体与正常的原生质体融合也能实现 T-DNA 的转移,并得到属间体细胞杂种。这是一种借助细胞融合技术的转化系统。     

两个癌基因转化细胞系的建立

用BGC-ras~H和v-myc共转染第四代大鼠全胚细胞(REF),BGC-ras~H单独转染NIH3T3小鼠成纤维细胞分别获得两个恶性转化细胞系REF_(4-3)和BGC3T3。其中REF_(4-3)由一早代成纤维样细胞转化成为上皮样的、染色体高度界倍体化并可稳定传代的细胞。两种转化细胞均可接种裸鼠致瘤,成为二个用癌基因转化建立的细胞系。     

用生物技术制造食物

据美国《华盛顿邮报》1989年9月25日报道美国明尼苏达大学的研究人员在试管里用一种溶液种植草莓。这种试管草莓既有天然草莓的颜色,也接近天然草莓的味道。 研究人员所用溶液模拟草莓植株里细胞的天然环境,以诱导这些细胞表达其基因潜能。用这种溶液培养草莓既不依赖土壤、水和阳光又不依靠生长根、茎和叶来提供营养物,可以只长出植珠果实。因为在每个细胞中都有遗传信息,可以生长出草莓植株的任何部分。     

大肠杆菌JM109感受态形成因素分析

目的:分析大肠杆菌JM109感受态形成因素,提高转化效率。方法:采用不同生长状态、不同转化溶液、不同保存时间及热激处理时间的细菌制备感受态,分析转化效率。结果:以20mmol/L MgCl2 80mmol/L CaCl2为处理液,经活化培养OD600为0.82的菌液制备感受态细胞,4℃放置12~24h之内,42℃热激处理60s,转化效率最高,可达9.8×106~1.2×107cfu/μg DNA(pUC19)。随着质粒长度增加,转化效率下降。结论:感受态细胞形成与生长状态关系密切,金属离子、有机溶剂对感受态的形成影响显著。感受态形成过程中,细胞可能发生了一系列的生理变化。     

高转移人肺癌细胞系DNA转移特性的研究

 用高转移肺癌细胞DNA转染NIH/3T3鼠细胞,获得的转化细胞在裸鼠体内表现不同的成瘤潜伏期,鉴定了整合到鼠细胞中入DNA序列,并得到一株在裸鼠体内有转移活性的转化细胞株。     

枯草芽孢杆菌感受态细胞的制备及质粒转化方法研究

为便于枯草芽孢杆菌工业化生产应用,对Spizizen创立的枯草芽孢杆菌DNA转化方法进行改进.用GMI和GMII溶液处理枯草芽孢杆菌野生型菌株BS501a、营养缺陷型突变株DBl342和非营养缺陷型突变株WB800,用改进的方法制备感受态细胞,用7.5kb质粒pSBPTQ进行转化,并研究RNA、酵母粉、水解酪蛋白、培养方法对枯草芽孢杆菌质粒转化的影响.结果表明,该方法适用于不同基因型枯草芽孢杆菌的质粒转化,营养缺陷型突变株DBl342的转化率为750 CFU/μg/DNA,非营养缺陷型突变株WB800转化率为1 070 CFU/xg DNA,野生型菌株BS501a转化率为270 CFU/μg/DNA.根据影响转化效率的因素,推测在该方法中,枯草芽孢杆菌质粒转化原理:一定生物量的枯草芽孢杆菌在外界营养条件和钙、镁离子作用下,细胞壁和细胞膜形成缺陷,使外源DNA转入枯草芽孢杆菌细胞内.     

MNNG转化赤麂细胞株（KIZ—8401）的生长特性和核型观察

本文用MNNG(N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine)(甲基硝基亚硝基胍)转化赤麂肺成纤维细胞株(KIZ-7901)。转化的赤麂细胞株(KIZ-8401)具有新的核型,2n=8♂,细胞形态,细胞周期以及生物学特性都与未转化的细胞株(2n=7♂)不一样。转化细胞中还常见多倍体出现,细胞具有克隆生长能力。