鸡毒支原体通用型mini-Tn4001转座子的构建

为了实现以鸡毒支原体（MG）为载体携带和表达其他呼吸道病原保护性抗原,达到多种病原体共同保护的效果,本研究拟构建一套mini-Tn4001转座子（pMT4）.该微型转座子具备以下特征：含四环素抗性基因;两臂是转座酶识别的Inner和Outer插入重复区;转座酶位于插入区之外,在整合起始点处促进转座;多克隆位点便于插入外源基因.这一微型转座子载体的成功构建为MG非必需区缺失工作奠定了基础,对下一步MG功能基因的靶向缺失技术以及外源蛋白的表达建立了有效的基因操作工具.     

水稻第4号染色体不同位置的Ds转座子转座行为的分析

使用农杆菌介导的方法转化粳稻品种中花11,构建了在第4号染色体不同位置插入了Ds（dissociation）因子的水稻转化群体和带有Ac（activator）转座酶基因的转化植株。将携带了Ac转座酶基因的植株与不同Ds转化植株杂交,杂交F1代同时带有Ac转座酶和Ds因子（Ac／Ds植株）。用PCR方法检测了杂交F1代Ds的切离频率,结果发现靠近第4号染色体着丝粒附近的Ds转座子切离频率低,而靠近第4号染色体末端区域的Ds转座子切离频率高,这表明Ds转座子的原始插入位置对其杂交后代的切离频率有很大的影响,推测与原始插入位点附近的染色体结构有关。     

根癌农杆菌致病基因及其生物学功能分析

用转座子标签技术克隆了位于农杆菌（A-208株）染色体上的致病基因acvB、abvA、chvA简单介绍克隆技术的研究思路和策略。染色体基因是农杆菌吸附到植物细胞表面所必需的基因,当某一基因发生突变时,就不能完成贴壁反应而失去毒性。由于转座子Tn5的插入,导致染色体毒性基因失活,最终使农杆菌感染后的受体细胞不能致瘤。用实验证据阐述各基因在T-DNA形成、转移、整合、表达等过程中担负的重要作用。对延宕至今的T-DNA穿壁问题作了推测：植物细胞壁表面可能存有T-DNA的天然穿壁孔道。     

铜绿假单胞菌蹭行运动相关基因的研究

应用Mu转座重组技术研究铜绿假单胞菌 (Pseudomonasaeruginosa)蹭行运动 (Twitchingmotility)的相关基因。通过转座突变、表型筛选 ,得到 8个Twitchingmotility缺陷或减弱的突变子。经过基因克隆、核苷酸测序研究 ,鉴定转座子插入到基因组中的位置。结果表明 ,在其中 4个突变子中 ,转座子分别插入到与IV型菌毛生物合成和功能相关的 3个已知基因中 (其中有两个突变子转座子插入到同一基因的不同位置 ) ,它们是pilV ,pilQ ,algR。另外 4个突变子中 ,有 3个是转座子分别插入到基因pilL基因的前端 ,中部和后端 ,均引起Twitchingmotility功能缺失。另一个突变子中 ,转座子插入到基因PA1 82 1中 ,引起Twitchingmotility功能减弱。PilL和PA1 82 1的编码产物均属于 3 类蛋白质 ,它们的功能是根据其保守的氨基酸基序或基因序列与已知功能基因的相似性推测得出的。但缺乏详细的试验证据。研究结果为pilL控制Twichingmotility提供了有力的证据。并证实基因PA1 82 1与Twitchingmotility有关。将Mu转座重组技术应用到假单胞菌的研究中 ,国内外均未见报道。由于该技术具有随机单点插入的优点 ,克服了传统转座子能在染色体上迁移的缺点。保证了表型的改变与转座子插入位点的基因突变的一一对应关系。为进一步研究铜绿假     

显性插入突变载体的设计

显性插入突变载体的设计陆建荣,金振华（中国科学院发育生物所,北京１０００８０）当可移动的ＤＮＡ片段（如转座子）插入到基因组其它基因座位,破坏了后者表达所需的完整性时,就产生了插入突变效应。由于插入的ＤＮＡ可以作为内置的标签（ｂｕｉｌｔ－ｉｎｔａｇ）,使得分离相应的基因极为简便。近年来插入突变在高等真核生物研究中得到广泛的应用,［１］除转座子外,一些转基因载体如动物的逆病毒载体,植物农杆菌的Ｔi或Ri质粒都能将外源DNA稳定整合到宿主基因组,也成为极有用的插人突变载体。     

基因捕获技术及其最新进展

基因捕获技术是目前最具应用前景的基因克隆方法之一。利用该技术建立的随机插入突变的突变体文库,可用于寻找、鉴定和研究大量末知功能和已知功能的活化基因,它是继自然突变、物理突变和化学突变之后发展起来的新的分子生物学方法。基因捕获载体是带有报告基因和/或选择标记基因的不完整的基因表达载体;这些载体所带的基因只有在整合到宿主功能基因内部且与融合的宿主基因编码框一致时才能得以表达。经典的基因捕获载体有：增强子捕获载体、基因捕获载体和启动子捕获载体。增强子载体只有一个最小化的启动子控制下游报告基因的表达活性。只有当启动子上游存在一个增强子时才能启动其下游基因的转录：而单独依靠这个启动了则不能转录。狭义的基因捕获载体是指插入到结构基因内部从而捕获该基因的载体,分为内含子捕获载体和外显了捕获载体。前者插入内含子,因此需要在无启动子的报告基因前面添加一个splice acceptor（SA）位点：后者插入外显子,因此不需SA位点就能产生融合蛋白mRNA。启动子捕获载体由一个无启动子的报告基因和选择标记基因组成,只有在捕状载体捕入到内源基因的外显子中,且两阅读框一致的时候才会有报告基因和被捕获的内源基因上游编码区的融合蛋白的表达。利用某些遗传元件的遗传特性也可以构建非常有用的捕获载体。常用的有：逆转录病毒介导的捕抉载体和转座子介导的捕荻载体等等。该文较为全面地概括了转座子介导的捕获载体的用途和研究现状。比如：在拟南芥中应用Ac／Ds转座子元件,存果蝇中应用P-element和piggyBac转座元件,在斑马鱼中应用T012转座了元件,在脊椎动物研究中应用Tc1/meriner转座了超家族,以及存哺乳动物和小鼠ES细胞中应用piggyBac转座子元件。还列举了设计新颖的载体优化策略,比如：发展新的选择标记基因,利用内源核糖体识别／结合位点（IRES）,去掉起始密码子和加一小段接头（1inker）等方法。最后介绍了几种针特定实验目的而设计的捕获载体。附录部分还列出了关于基因捕获技术的网络资源。     

铜绿假单胞菌水解弹性蛋白能力相关基因的筛选与鉴定

【目的】研究铜绿假单胞菌弹性蛋白水解能力相关基因。【方法】应用人工Mu转座技术构建铜绿假单胞菌野生型菌株PA68的转座突变文库,从2000多个突变子中筛选得到4株弹性蛋白水解能力改变的突变子,并通过克隆及测序获得转座子插入位点侧翼的序列。将铜绿假单胞菌弹性蛋白酶结构基因lasB的转录启始区序列整合入载体pDN19lacΩ并将该重组质粒电转化入野生型菌株PA68及4个突变株中,对报告基因在不同菌株中的表达水平进行测定。【结果】发现4个突变株中Mu转座子分别插入lasA、galU、xcpZ和ptsP 4个基因。ptsP基因失活的突变株中,lasB基因的转录水平是野生型菌株的7%,xcpZ和lasA基因的失活使lasB基因的转录水平分别降低为野生株的54%和75%,galU基因的插入失活使lasB基因的转录上升了1倍。【结论】推测ptsP和galU基因很可能直接或间接地调控着弹性蛋白酶的生物合成。     

piggyBac转座子在牛基因组的整合位点及特征分析

piggyBac(PB)转座子作为一种遗传工具被广泛应用于多个物种的转基因及插入突变研究, 目前PB转座子在牛中的相关研究还较少。为了获得PB转座子在牛基因组中的整合位点, 总结其转座特征, 文章构建了PB[CMV-EGFP]和pcDNA-PBase二元转座系统, 利用细胞核电转技术共转染牛耳组织成纤维细胞, 经G-418筛选, 获得了稳定转染EGFP的转基因细胞系; 提取细胞基因组DNA, 利用基因组步移技术扩增PB转座子5′ Bac区插入位置的DNA序列; 通过与牛基因组序列进行BLAST比对, 得到PB转座子在牛基因组中的插入位点。文章共获得了8个有效的整合位点, 但仅有5个位点定位到染色体1、2、11和X染色体上。序列分析表明：在牛基因组中, PB转座子可特异性的插入到“TTAA”位置, 并整合到基因间的非调控区; 分析整合位点“TTAA”相邻一侧的5个碱基组成, 发现PB转座子5′端倾向于插入到GC(62.5%)碱基富集区。该研究表明, PB转座子可以在牛基因组中发生转座, 获得的整合位点信息为利用PB转座子在牛上开展遗传学研究提供了理论参考。     

利用转座子构建靶向侵袭性抗肿瘤工程菌

转座子是一类在基因组上可以自由跳跃的移动序列,同时也是对微生物进行基因修饰和插入突变的有效工具,但尚未见有利用转座子导入革兰氏阴性菌E.coli Nissle1917菌株的报道.本研究通过构建p R6K转座载体,对肠道益生菌E.coli Nissle1917菌株进行了转座插入诱变,将假结核耶尔森菌的侵袭素基因inv和单核细胞增多性李斯特菌的溶血素基因hly随机整合至E.coli Nissle1917菌株的染色体上,从而使非致病性大肠杆菌E.coli Nissle1917获得侵袭哺乳动物细胞的能力.通过细胞体外侵袭实验发现,本研究所构建的工程菌对B16,HCT-116等肿瘤细胞有较好的侵袭活性,同时与抗肿瘤蛋白Azurin一起作用B16细胞,抗肿瘤效果显著增强,为进一步运用以大肠杆菌E.coli Nissle1917作为DNA疫苗或者基因治疗的载体开辟了新的技术途径.     

阴沟肠杆菌B8拮抗活性基因‘admA’及上游调控序列的克隆与功能鉴定

为了阐明水稻白叶枯病拮抗菌阴沟肠杆菌B8的作用机理,文章采用转座子标签法和染色体步移技术克隆到突变株B8B中Tn5插入位点周边拮抗活性相关片段,并通过基因敲除验证了获得的拮抗相关片段admA’上游调控序列的功能。以转座子中Kan抗性基因为标签,克隆了B8B菌株中Tn5插入位点左侧2 608 bp序列,经两次染色体步移得到Tn5插入位点右侧的2 354 bp序列。序列拼接后获得B8菌株拮抗相关序列4 611 bp的Bcontig。生物信息学分析显示该序列含有7个ORF,分别对应于3-磷酸甘油醛脱氢酶(GADPH)基因的部分编码区、2个LysR家族转录调控因子、弧菌假设蛋白VSWAT3-20465及成团泛菌(Pantoea agglomerans)andrimid生物合成基因簇的admA、admB和部分admC基因序列。B8B菌株Tn5插入分别位于同源于弧菌假设蛋白的anrPORF及‘admA’基因上游200 bp和894 bp处。通过同源重组技术,借助敲除质粒pMB-BG,获得拮抗活性消失的突变株B-1和B-3。结果表明B8B突变株中Tn5的插入可能影响了anrP蛋白的转录和表达,进而调控拮抗物质编码基因簇的生物合成。B8菌株中拮抗物质相关基因是类似于andrimid生物合成基因簇的基因家族,其上游调控区对该抗生素的生物合成具有重要的作用。     

同源重组法构建多功能农药降解基因工程菌研究

构建遗传稳定的多功能农药降解基因工程菌可以为农药污染的生物修复提供良好的菌种资源,然而,构建遗传稳定且不带入外源抗性的基因工程菌是一个难点。通过以受体菌的16S rDNA为同源重组指导序列、sacB基因为双交换正筛选标记构建同源重组载体,二亲结合的方法将甲基对硫磷水解酶基因（mpd）整合到呋喃丹降解菌Sphingomonas sp.CDS1染色体的16S rDNA位点,分别成功构建了含1个和2个mpd基因插入到rDNA位点且不带入外源抗性的基因工程菌株CDSmpd和CDS-2mpd。同源重组单交换的效率为3.7×10^－7～6.8×10^－7。通过PCR和Southern杂交的方法验证了同源重组事件。基因工程菌遗传稳定,能同时降解甲基对硫磷和呋喃丹。甲基对硫磷水解酶（MPH）的比活在各生长时期均高于原始出发菌株,比活最高达6.22 mu/μg。     

水稻农杆菌介导转化法关键因子研究进展

水稻是世界上最主要的粮食作物之一。近年来,DNA重组技术、遗传操作技术、水稻基因图谱的研究取得了显著发展,目前各国政府和大财团正投入大量的物力、技力和人力进行各种有益基因（如抗除草剂基因、抗虫基因、抗病毒基因、转座子等）导人水稻方面的研究,如杜邦（Dupont）公司和先锋（Pioneer）公司最近就联合投资额17亿美元开发转基因作物,包括水稻。目前水稻遗传转化体系已比较完善,中国科学院李绍清等‘’‘已详细综述了水稻遗传转化的方祛、受体系统和转化体后代遗传表达的研究进展及采用遗传工程技术改良水稻品种的现状。本文主…     

增加植酸酶基因appA-m的拷贝提高其在巴斯德毕赤酵母的表达量

为了进一步提高植酸酶的发酵效价,降低植酸酶生产成本,对毕赤酵母表达载体pGAPZα-A进行了改造。将表达载体pPIC9的AOX1启动子序列引入pGAPZα-A,使之成为甲醇可诱导型表达载体pAOXZα, 插入植酸酶基因appA-m后得到重组载体pAOXZα-appA-m 。以染色体上带有一个拷贝的appA-m基因、发酵效价可达到7.5×10⁶IU/mL发酵液的重组酵母菌株74#为受体菌进行转化,在该重组菌株的染色体上的另一位点整合含有植酸酶基因的表达盒,经筛选到高表达植酸酶的重组子。通过PCR进行验证,植酸酶基因被整合到重组酵母的染色体上,且受体菌中原有的植酸酶基因结构未改变。重组菌在5L发酵罐经甲醇诱导120h植酸酶蛋白表达量达到4mg/mL发酵液, 酶活性(发酵效价)达到1.2×10⁷IU/mL发酵液以上, 较含单拷贝植酸酶基因的受体菌株表达量有较大程度提高。PCR检测及表达量分析证明改良的菌株具有很好的遗传稳定性和表达稳定性。     

高中生物学遗传与变异实验课教学案例开发

通过接合作用,大肠杆菌携带的质粒载体pFAJ1819::mTn5gusA -pgfp21转入目标受体菌催娩克氏菌;载体上的转座子mTn5gusA -pgfp21携带的葡萄糖苷酸酶基因(gusA,无启动子)、卡那霉素抗性基因(nptⅡ,有启动子)和2个绿色荧光蛋白基因(gfp,有启动子)插入到催娩克氏菌的基因组DNA中;借助绿色荧光蛋白、gusA及卡那霉素抗性基因的表达,形成的表型直观变化展示细菌的遗传与变异现象,可以作为高中生物学实验的教学案例.     

转座因子在肺炎链球菌耐药进化中的作用

要肺炎链球菌的耐药决定子由染色体上的转座因子携带,与耐药相关的转座因子和转移的主要方式有：①接合转座子：携带erm(B)、tet(M)和aphA-3等的Tn916-Tn1545家族,通过接合转移;②缺陷转座子：携带mef基因及ABC外排系统的Tn1207．1和mega插入元件,可转化到敏感菌株引起耐药;③复合转座子：由mega插入元件与Tn916整合产生的Tn2009,以转化方式转移。肺炎链球菌通过转座因子获得并传播耐药基因,在其耐药进化中起重要作用。     

生技霉素稳定型基因工程菌的构建

运用同源重组技术将异戊酰基转移酶基因整合至螺旋霉素产生菌（ＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｓｐｉｒａｍｙｃｅｔｉｃｕｓＦ２１）的染色体上,构建了稳定的生技霉素基因工程菌。在不加压的情况下传代,菌种携带选择性遗传标记情况、生长、发酵效价及发酵产物的ＴＬＣ分析均表明此基因工程菌有较好的遗传稳定性,且发酵效价及产物的组分均得到改善。Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交证明外源基因在螺旋霉素产生菌染色体上的整合情况。     

Mutator转座子及MULE在植物基因与基因组进化中的作用

Mutator（Mu）转座子是植物中已发现的转座最活跃的转座子,其高的转座频率及趋向于单拷贝功能基因转座的特性,使该转座子成为玉米功能基因克隆的主要方法.Mu转座子的同源类似因子广泛存在于被子植物基因组中,而且同一基因组中往往具有多种变异类型.它不仅具有其他DNA转座子在基因和基因组进化中的普遍作用,而且具有能够承载基因组内功能基因和基因片段的载体功能,这种载体Mu转座子（Pack-MuLEs）能够在基因组内移动众多的基因片段,从而对基因和基因组进化产生作用.Mu转座子的同源序列发生在水稻与狗尾草之间的水平转移提供了高等植物核基因水平转移的首个例证.对Mu转座子的了解促进了我们对动态基因组概念的认识.文章对Mutator转座子的发现、转座特征、基因标签应用等的研究进展进行了综述,对Mu转座子家族的同源序列进行了分类,讨论了该转座子在基因组进化中的作用,分析了应加强研究的问题.     

转座子PiggyBac在哺乳动物中的应用

DNA转座子作为一种遗传工程工具已广泛应用于多物种的转基因及产生插入突变等研究。目前,在哺乳动物中有转座活性的转座子可分为三类：1）hAT样转座子;2）Tcl样转座子包括Sleeping Beauty和FrogPrince;3）PiggyBac转座子家族。其中甘蓝蠖度尺蛾（Cabbage looper moth Trichoplusia ni）来源的PiggyBac转座子是目前在哺乳动物中活性最高的转座子,并且可以携带十几kb的外源基因转座而不影响其效率,使其在哺乳动物的转基因、癌基因的发现、基因治疗研究方面具有巨大的应用潜力。此外,PB的无痕迹转座对于无转基因、无遗传物质改变的诱导多潜能干细胞（iPS）研究也具有非常重要的意义。本文主要对针对PB在哺乳动物中的应用现状及前景作一介绍。     

转座子在观赏植物嵌合花色形成中的应用

介绍了转座子与嵌合花色形成的关系以及用基因工程操作改良花色的方法,着重介绍采用转座子构建特殊表达载体,随机激活花色合成的基因产生嵌合花色的技术和前景.     

piggyBac转座子AgoPLE1.1在黑腹果蝇种系 转化中的应用

【目的】通过检测黑腹果蝇Drosophila melanogaster中piggyBac (PB)转座子AgoPLE1.1的转化活性,明确AgoPLE1.1开发为昆虫转基因载体的潜力。【方法】构建AgoPLE1.1转座酶辅助质粒pAgoHsp和带有红色荧光标记的供体质粒pXLAgo-PUbDsRed,辅助质粒和供体质粒以170 ng/μL∶400 ng/μL, 90 ng/μL∶200 ng/μL和90 ng/μL∶100 ng/μL 3种不同的比例混合后分别注射新鲜的W¹¹¹⁸ 黑腹果蝇胚胎,筛选注射后代中的转基因黑腹果蝇个体;利用Southern杂交验证转基因黑腹果蝇中AgoPLE1.1转座子的插入拷贝数;利用染色体步移技术克隆AgoPLE1.1插入位点旁侧序列,明确AgoPLE1.1转座子的转座特征。【结果】AgoPLE1.1转座子在黑腹果蝇中具有转化活性,转基因频率为1.32%~1.94%。Southern杂交结果显示,AgoPLE1.1转座子在黑腹果蝇中至少有6个插入位点。染色体步移法克隆了其中4个位点,分别位于黑腹果蝇的3R, 3L, 2L和X染色体,并且AgoPLE1.1转座子在黑腹果蝇染色体中的整合带有供体质粒的骨架。【结论】PB转座子AgoPLE1.1仅可以在黑腹果蝇中以较低的频率进行非精确的剪切和转座,不具有开发为新型昆虫转基因载体的潜力。