微球菌的脂肪酸合成调节

本文介绍了微球菌（Micrococcussp）1504胞外脂肪酶的代谢调节模式。发现在发酵培养基中,通过补加长链脂肪酸及其油酯,能提高脂肪酶的生产水平,而中、短链脂肪酸及其酯抑制产酶能力;高浓度的葡萄糖抑制产酶能力;补加不同浓度的橄揽油,适宜补加时间也应不同。水洗细胞脂肪酶的合成受橄榄油和油酸诱导,受葡萄糖和甘油阻遏,并发现脂肪酶的分解代谢阻遏主要发生在转录水平上。     

生淀粉糖化酶催化位点氨基酸及酶合成调控的初步研究

通过对Rhizopus OR-1UVN菌种所产生淀粉糖化酶在不同底物不同缓冲溶液条件下酶最适pH的测定,推测出该生淀粉糖化酶活力中心催化位点氨基酸是天冬氨酸(Asp)和谷氨酸(Glu)。实验证明5～50mg/mL浓度葡萄糖对生淀粉糖化酶没有抑制作用。分别以浓度<5mg/mL葡萄糖和淀粉为碳源的培养基进行不同碳源发酵实验,发现以淀粉为碳源的培养基Ⅰ发酵15h开始产生淀粉糖化酶,以葡萄糖为碳源的培养基Ⅱ发酵35h开始产酶(葡萄糖浓度<8mg/mL),而且前者菌体较后者少,由此可知葡萄糖对产酶有阻遏作用。实验还发现解阻遏熟淀粉糖化酶的葡萄糖浓度(15mg/mL)比生淀粉糖化酶的要高。由于葡萄糖的阻遏作用不发生在翻译水平,而发生在转录水平上,而且生淀粉糖化酶(G1)与熟淀粉糖化酶(G2)来自同一条DNA链,可以推测存在mRNA的拼接。通过以生淀粉为碳源的比较实验,发现生淀粉对生淀粉糖化酶形成的诱导作用可能主要是通过mRNA拼接的调节来实现的。     

利用根癌农杆菌T-DNA 插入突变寻找参与漆酶葡萄糖阻遏的关键基因

【目的】新型隐球酵母(Cryptococcus neoformans)是人类重要致病真菌,主要毒性因子之一漆酶的表达受葡糖糖阻遏,机制未知。本文拟寻找参与葡萄糖阻遏的关键基因。【方法】建立根癌农杆菌介导的转化方法(Agrobacterium tumefanciens-mediated transformation,ATMT)建立一个容量约200000的随即插入突变文库,在高浓度葡萄糖条件下从中筛选葡萄糖去阻遏的突变株。通过Southern确定突变株中T-DNA的拷贝数,利用反向PCR获得依赖葡萄糖的漆酶阻遏基因序列。【结果】筛选到了30株葡萄糖去阻遏突变株,Southern blot发现83%的葡萄糖去抑制突变株含有单个T-DNA拷贝。初步鉴定了可能参与漆酶阻遏的10个不同生物学功能基因,如参与碳水化合物的代谢,固醇的合成,几丁质的合成,GPI脂锚钩的合成等等。【结论】ATMT突变策略可以找到一些参与漆酶葡萄糖阻遏的关键基因,为理解漆酶在致病过程中的作用机制和工业改进漆酶活性提供参考。     

脂肪酶产生菌Geofrichum sp. AS 2.1135产酶条件及酶一般性质的研究

在92株能同化油的地霉属菌株中,Geotrichum sp. AS2．1135菌株产脂肪酶活力为50—60u／ml,对其产酶条件的研究表明,不饱和长链脂肪酸和油类有利于酶的形成。在4％豆饼粉作为有机氮源的培养基中,加入0．2％尿素,酶活力显著增加,酶活达150u／ml。用聚乙二醇橄榄油乳化系统测定酶的作用最适pH为8．0,最适温度为4O一42℃。在pH4一9时5℃下存放24小时,或在pH 5和8时45℃保持15分钟,酶活力不变。     

产甘油假丝酵母甘油代谢关键酶的研究

本文对产甘油假丝酵母的甘油代谢关键酶进行了研究,发现产甘油假丝酵母同化甘油能力极弱,少量葡萄糖明显改善其同化甘油的能力;线粒体3磷酸甘油脱氢酶受3磷酸甘油的强烈诱导,受葡萄糖代谢的阻遏。在甘油发酵过程中,产甘油假丝酵母胞浆3磷酸甘油脱氢酶酶活处于较高水平并在36h和60h时出现两次酶活高峰,其中第一次酶活峰值水平决定产甘油假丝酵母的甘油合成和积累水平,成为甘油高速积累期(18～48h)甘油合成的关键性的限速酶。在甘油发酵18～48h内,3磷酸甘油酯酶的酶活处于高水平,并在36h时出现酶活峰值;处于缓慢甘油积累阶段的48～72h间,3磷酸甘油酯酶已处于低水平表达,此时,3磷酸甘油酯酶则成为甘油合成的限速酶。产甘油假丝酵母稳定并高表达其胞浆3磷酸甘油脱氢酶基因并且其所表达的3磷酸甘油酯酶酶活远高于胞浆3磷酸甘油脱氢酶这一特征是其高产甘油根本所在。     

不同脂肪酸组成的油脂对LPS诱导的小鼠肠道炎症的影响

摘要：【目的】：比较观察不同脂肪酸来源的油脂对LPS诱导的小鼠肠道急性炎症的影响,为重症肠道感染提供肠内营养的数据参考。【方法】： 取12周龄雄性C57BL/6J小鼠40只,腹腔注射LPS（3.5mg/kg）24小时后,测量空腹体重,随机分为5组：玉米油组（ω-6脂肪酸）,橄榄油组（ω-9脂肪酸）,紫苏油组（ω-3脂肪酸）,中长链油组（中链脂肪酸）,LPS损伤组（灌胃葡萄糖）。根据组别灌胃小鼠,7日后取小鼠腹主动脉血及小肠组织,测定细胞因子水平和TLR4信号通路中相关分子的mRNA表达,并进行小肠组织病理切片观察。研究期间每日测量小鼠体重。【结果】：研究结束时,各组小鼠体重均升高,以橄榄油组和紫苏油组最高,且与LPS损伤组和玉米油组比较均有显著性差异（P<0.05）;血和小肠中TNF-α,IL-1β,IL-6水平及小肠TLR4、MyD88和TNF-α的mRNA表达以中长链油组最低,与LPS损伤组和玉米油组比较均有显著性差异（P<0.05）,而与橄榄油组和紫苏油组无显著性差异（P>0.05）。小肠组织病理切片结果显示：各组小鼠小肠粘膜均有不同程度的损伤,以LPS损伤组损伤最明显,玉米油组次之,橄榄油组处于中等水平,中长链油组与紫苏油组损伤较轻。【结论】：中链脂肪酸、ω-3脂肪酸和ω-9脂肪酸来源的油脂对LPS诱导的肠道炎症的修复作用均优于ω-6脂肪酸来源的油脂和葡萄糖,机制可能为抑制肠道TLR4信号传导途径相关因子表达,减少促炎细胞因子释放。     

脂肪酶产生菌地霉7203菌株的分离和诱变

从76个土样中分离获得271株脂肪酶产生菌,其中7203菌株产酶活性最高,从其形态特征确定属地霉属。对该菌株脂肪酶合成受油脂、脂肪酸及某些结构类似物的影响进行了考察,发现琥珀酸钠对该菌株生长及产酶有明显的负控制作用。经诱变筛选药物耐性变异株,使产酶能力有较大的提高。对改良株的发酵条件及特征作了初步试验,并对有关机理进行讨论。     

GL-7ACA酰化酶基因工程菌(Escherichia coli MMR204/pZC1)批式补糖发酵条件优化

戊二酰 7 氨基头孢烷酸 (GL-7-ACA)酰化酶 (3.1.5.11)可有效催化GL-7ACA分子中戊二酰基侧链水解 ,形成7-氨基头孢烷酸 (7-ACA)而成为两步酶法生产7-ACA的重要工业用酶之一。在已构建的GL-7ACA酰化酶基因(acy)重组质粒pZC1基础上 ,进一步对酰化酶基因工程菌EscherichiacoliMMR204pZC1的产酶发酵条件进行了考察。研究表明 ,工程菌的最佳发酵温度为 33℃ ,pH7.5～ 8.5的微碱条件有利于酶的生成。LB培养基补加适量葡萄糖 (1～ 5g/L) ,可提高发酵生物量和产酶水平 ,但葡萄糖的过量补加 (6g/L以上 ) ,则导致发酵液偏酸 (低至pH4.0 )而完全抑制酰化酶生成 ,并证明工程菌生长和产酶对乙酸的抑制效应较为敏感。同时通过5L自控发酵罐的批式补糖试验 ,对恒速流加、pH反馈控制和指数流加等三种补糖模式的发酵产酶进程进行了比较。结果发现 ,三种方式的补糖条件下 ,acy基因在tac启动子控制下 ,呈组成型表达 ,细胞生长与产酶同步 ,无需诱导 ;其中 ,以指数流加方式得到的生物量和产酶水平最高。而从acy基因的表达效率,即比酶活看,pH反馈的补料方法略高于恒速或指数流加模式。     

黄孢原毛平革菌抗营养阻遏产漆酶诱变育种及其产酶特性

【目的】筛选能抗营养阻遏产漆酶的黄孢原毛平革菌,论证其产漆酶的确定性及抗营养阻遏产木质素酶的可行性,为白腐菌产酶代谢调控、木质素降解机理的研究奠定基础。【方法】利用重复紫外诱变法,以愈创木酚富氮鉴别培养基筛选目标菌株;比较不同营养条件下菌体生长与产酶动力学差异研究产酶营养调控机理;通过热处理、排除锰离子和加入过氧化氢酶等不同措施论证黄孢原平毛平革菌能否产生漆酶。【结果】3种不同方法均证实选育到的pcR5305和pcR5324菌株在限氮与富氮条件下均能产生漆酶,pcR5305和pcR5324在限氮条件下产漆酶分别达到203.5、187.6 U/L;在富氮条件下为220.6、183.9 U/L,而原菌株pc530在两种条件下都基本不产生漆酶。二菌株产漆酶调控方式不同,pcR5305漆酶产生与菌体生长同步,而pcR5324漆酶产生却受营养氮阻遏。二菌株同时具有抗营养阻遏高产木质素过氧化物酶(LiP)和锰过氧化物酶(MnP)(分别为LiP 1343.2、MnP 252.2 U/L;LiP 1169.5、MnP 172.4 U/L)的能力。【结论】筛选到的黄孢原毛平革菌变异菌株能产漆酶,同时表现了抗营养阻遏产漆酶、木质素过氧化物酶和锰过氧化物酶的能力,具有重要的生产应用与理论研究价值,为白腐菌产酶代谢调控机理研究提供了原始菌株并奠定了良好的基础。     

GL-7ACA酰化酶基因工程菌(Escherichia coli MMR204/pZC1)批式补糖发酵条件优化

戊二酰-7-氨基头孢烷酸(GL-7-ACA)酰化酶(3．1．5．11)可有效催化GL-7ACA分子中戊二酰基侧链水解,形成7-氨基头孢烷酸(7-ACA)而成为两步酶法生产7-ACA的重要工业用酶之一。在已构建的GL-7ACA酰化酶基因(acy)重组质粒pZC1基础上,进一步对酰化酶基因工程菌Escherichia coli MMR204／pZC1的产酶发酵条件进行了考察。研究表明,工程菌的最佳发酵温度为33℃,pH7．5～8．5的微碱条件有利于酶的生成。LB培养基补加适量葡萄糖(1～5g／L),可提高发酵生物量和产酶水平,但葡萄糖的过量补加(6g／L以上),则导致发酵液偏酸(低至pH4．0)而完全抑制酰化酶生成,并证明工程菌生长和产酶对乙酸的抑制效应较为敏感。同时通过5L自控发酵罐的批式补糖试验,对恒速流加、pH反馈控制和指数流加等三种补糖模式的发酵产酶进程进行了比较。结果发现,三种方式的补糖条件下,acy基因在tac启动子控制下,呈组成型表达,细胞生长与产酶同步,无需诱导;其中,以指数流加方式得到的生物量和产酶水平最高。而从acy基因的表达效率,即比酶活看,pH反馈的补料方法略高于恒速或指数流加模式。     

碳源对轮枝链霉菌SK-2合成谷氨酰胺转胺酶的影响

研究不同的碳源对轮枝链霉菌(StreptoverticilliumSK-2产谷氨酰胺转胺酶的影响.结果2%甘油是最有效的碳源,其最高酶活达7.89μmol/(min*ml);添加油脂有助于菌体产酶,在各种油脂中,以添加橄榄油效果最好.并进一步研究了甘油和橄榄油作为复合碳源对产酶的影响.     

快速筛选产β—葡聚糖酶曲霉及抗阻遏育种

采用改良琼脂块鉴定平板法进行产β-葡聚糖酶曲霉的快速筛选。其中温度、初始pH、平板厚度及去氧胆酸钠的浓度都影响曲霉产β－葡聚糖酶分解底物所形成水解圈大小及透明度。同时研究发现,高浓度的葡萄糖对曲霉合成β－葡聚糖酶具有阻遏作用,通过改变分离培养基的葡萄糖浓度,结合诱变育种可以快速筛选到抗葡萄糖阻遏的高产β－葡聚糖酶的菌株。     

产低温脂肪酶非极端细菌的筛选、产酶发酵及粗酶性质研究

目的：筛选产低温脂肪酶非极端细菌菌株,扩大脂肪酶的应用范围。方法：利用维多利亚蓝B平板显色法和摇瓶发酵法,从土壤中筛选产脂肪酶菌株,通过菌落形态和菌体特征观察初步对菌种进行鉴定,并对该菌株的产酶发酵培养基进行了优化。结果：得到一株产低温脂肪酶非极端细菌菌株sybc—li一1,该菌株适宜产酶培养基（％）为淀粉1、牛肉浸膏1、NaNO3 0．08、CaCl2 0．04、MgSO4 0．04、橄榄油2和OP1;初始DH8、30℃、200r／min培养72h,脂肪酶活力可高达到30．2U／mL;所产脂肪酶粗酶最适作用温度20℃,最适pH9．5,0℃时仍能保持70％的酶活性,属于低温酶;该酶与目前报道的低温脂肪酶相比,有较好的热稳定性,粗酶在pH8．5、70℃条件下保温60mla,酶活力损失30％。结论：该菌株为自然环境中筛选的非极端细菌,所产脂肪酶为低温脂肪酶,在开发应用上有良好的前景。     

尿素对热带假丝酵母(Candida tropicalis)合成长链二元酸途径的调节 Ⅰ.抑制和阻遏作用

尿素明显地影响热带假丝酵母的长链二元酸合成。当存在适量尿素(0.1％)时,长链二元酸大量合成,但当尿素量增加至0.2％以上时,长链二元酸基本上不积聚,但短链二元酸,主要是庚二酸有所增加。 尿素的利用呈S形曲线,说明尿素可能经酶的诱导利用。在发酵中当尿素量增至0.2％以上时,整个发酵过程均残留少量尿素,它对长链二元酸的合成起着调节作用。 发酵中加入和尿素含氮量相当的酒石酸铵或硫酸铵以代替尿素,或在适量尿素的发酵过程中,补加入和0.1％尿素含氮量相当的氨时,均不明显抑制长链二元酸的合成,但在不同时间补加入0.1％尿素时,则受强烈抑制。 适量尿素(0.1％)培养的休止菌体,在不同时间补加尿素都显著抑制长链二元酸的合成,表明尿素对已生成的酶系具有抑制作用。但过量尿素培养的休止菌体,不能转化烷烃生成长链二元酸,说明过量尿素所培养菌体的长链二元酸合成酶系受到显著的阻遏作用。 适量尿素培养的休止菌体,在不同时间加入氨,它的抑制作用远较尿素为低。用适量尿素含氮量相当的铵盐培养的休止菌体,亦具有类似现象,但过量氨培养的休止菌体转化时仍能生成多量长链二元酸。以上均说明尿素对长链二元酸合成的影响不是氨而是尿素分子本身起了抑制和阻遏作用。 尿素分子的化学结构类似物——硫脲和胍也具     

单因子-响应面法优化白地霉Y162产脂肪酶条件

对白地霉Y162液体发酵产脂肪酶的条件进行了优化。首先采用单因子实验筛选出最适碳源为橄榄油,氮源为黄豆粉和NH4Cl,无机盐为BaCl2和MgCl2。在此基础上,利用Plackett-Burman设计对影响产酶因素的效应进行评价,筛选出具有显著效应的橄榄油、BaCl2和NH4Cl三个最显著的因素。用最陡爬坡路径逼近最大产酶区域后,利用响应面中心组合设计对显著因素进行优化,得出橄榄油、BaCl2和NH4Cl最佳浓度分别为2.35％,0.36％,1.35％。优化后液体发酵液中脂肪酶活力提高到31.85 U/mL,比初始酶活力14.16 U/mL提高了2.25倍,表明单因子-响应面结合法可显著优化白地霉Y162液体发酵产脂肪酶条件。     

纳豆激酶产生菌——纳豆菌对木糖和葡萄糖的利用

在纳豆激酶 (Nattokinase,简称NK)发酵条件研究中 ,我们发现木糖是较葡萄糖更佳的产酶碳源。进一步的试验证明 ,NK的发酵菌种———Bacillussubtilisvar.natto在混合碳源中没有二次生长现象 ,对木糖和葡萄糖的吸收是同时的 ,且互不干扰 ,葡萄糖对木糖的吸收利用没有分解代谢阻遏。     

产低温脂肪酶菌株CZW001发酵培养基优化研究

【目的】研究产低温脂肪酶菌株CZW001发酵培养基。【方法】在单因素试验的基础上, 采用Plackett-Burman (P-B)设计, Box-Behnken (B-B)设计和响应面试验设计(RSM), 在20 °C、pH 8.0、160?r/min发酵2 d条件下, 对发酵培养基进行优化。【结果】该菌株最适产酶培养基为(g/L): 葡萄糖7.68, 橄榄油21.93, 硫酸铵2.0, 磷酸二氢钾1.0, 硫酸镁0.27, 氯化钙0.3, 氯化钠20.0, 吐温-80 1.0。其最高酶活为62.8 U/mL, 比优化前提高了3.14倍。【结论】通过对产低温脂肪酶菌株CZW001发酵培养基优化研究, 明显提高低温脂肪酶活力。     

牦牛瘤胃中产脂肪酶微生物的分离与鉴定

【背景】脂肪酶是一类特殊的酯键水解酶,广泛应用于工业化生产中,微生物是工业脂肪酶的主要来源。瘤胃中微生物种类繁多、数量庞大,已有关于瘤胃微生物产纤维素酶的报道,尚无产脂肪酶瘤胃微生物的分离筛选报道。【目的】从牦牛瘤胃中分离筛选出能够产脂肪酶的微生物,并进行菌株鉴定及其酶学性质的研究。【方法】以橄榄油为唯一碳源,通过中性红油脂平板进行初步筛选后,用改进铜皂-分光光度法测定酶活力进行复筛;再经形态学观察、生理生化实验和16S rRNA基因序列分析进行菌种鉴定;研究3种脂肪酶的最适作用温度、pH值及金属离子、有机溶剂和表面活性剂对酶活力的影响。【结果】筛选出6株酶活力较高的菌株,其中3株为液化沙雷氏菌,2株为白地霉,1株为卷枝毛霉。脂肪酶的酶学性质研究表明:液化沙雷氏菌、白地霉和卷枝毛霉所产脂肪酶的最适作用温度为45、35和40°C;最适pH为8.0、7.0和7.0;Ca2+和Mg2+对3种脂肪酶均有激活作用;Zn2+对3种脂肪酶有不同程度的抑制作用,EDTA、SDS可使3种脂肪酶失活;3种脂肪酶对丙三醇的耐受力较高,卷枝毛霉脂肪酶对甲醇、乙醇、丙酮的耐受力较高。【结论】从牦牛瘤胃中分离出3种产脂肪酶的微生物,且证实瘤胃微生物在脂肪酶研究方面具有较高的价值。     

红曲AS 3．3491葡萄糖淀粉酶生物合成的调节

红曲 Monascus AS 3.978的变异株 AS 3.3491曾是葡萄糖淀粉酶的工业生产菌株。本文报告的实验结果表明该菌株的葡萄糖淀粉酶是构成酶,它的形成受降解物阻遏的调控。AS 3.3491葡萄糖淀粉酶形成的时间过程属典型的产物形成与生长呈负相关的类型,即菌丝体生长停止后酶才开始大量形成。从培养基中除去过量易利用碳源可使葡萄糖淀粉酶形成消阻遏。各种可利用碳源以低浓度分别加到洗涤的菌丝体悬浮液中都能促进葡萄糖淀粉酶的形成,其中蜜二糖和半乳糖的促进作用最甚。在限制生长的条件下,即向洗涤菌丝悬浮液连续缓慢供给低浓度葡萄糖,则在整个培养过程中,葡萄糖淀粉酶的活力稳步上升,不需要任何诱导物,并且比酶形成值达到蜜二糖培养基的水平。因此,高浓度葡萄糖阻遏葡萄糖淀粉酶形成,但低浓度葡萄糖却促进酶的形成。     

响应面法优化Burkholderiasp．SYBCLIP—Y发酵产低温脂肪酶条件的研究

用响应面法对Burkholderiasp．SYBCLIP—Y液体发酵产低温脂肪酶的发酵条件进行了快速优化。首先利用Plackett—Burman设计对影响其产酶相关因素进行评估并筛选出具有显著效应的三个因素：牛肉膏,橄榄油,TritonX-100;用最陡爬坡路径逼近最大产酶区域后,利用响应面中心组合设计对显著因素进行优化,确定出牛肉膏,橄榄油,TritonX-100的最佳浓度分别为：牛肉膏31．8g／L、橄榄油21mL／L、TritonX-10036．55mL／L,优化后脂肪酶的酶活达到61．52U／mL,是优化前的2．62倍。