黄颡鱼“裂头病”病原二重PCR检测方法的建立及应用

"裂头病"是黄颡鱼养殖业的主要病害之一,其病原为鮰爱德华氏菌或迟钝爱德华氏菌。以GenBank所收录鮰爱德华氏菌与迟钝爱德华氏菌16S rRNA基因为模板,优化设计两对特异性引物,经多重PCR反应体系优化及特异性与敏感性检测,建立了检测鮰爱德华氏菌和迟钝爱德华氏菌的二重PCR检测方法。结果显示,阳性对照样品的琼脂糖凝胶电泳条带同时检测到鮰爱德华氏菌和迟钝爱德华氏菌,扩增产物大小分别为470 bp及268 bp,灵敏度为1.38 ng/μL。此法用于检测江西南昌地区多个养殖场所患"裂头病"黄颡鱼脑部DNA,11份患病黄颡鱼的脑部组织均检出鮰爱德华氏菌,表明该地区黄颡鱼所患"裂头病"的病原菌为鮰爱德华氏菌,此结果与常规细菌分离鉴定的检测结果一致。所建二重PCR检测法敏感度高,特异性强,检测成本低,对黄颡鱼"裂头病"的快速诊断与流行病学调查有较好的应用价值。     

利用16S rDNA建立种特异性PCR快速检测鸭疫里默氏菌

鸭疫里默氏菌感染是危害养鸭业的主要疾病,用表型指标鉴定鸭疫里默氏菌存在不足,因此有必要建立检测该菌的种特异性PCR法。利用已登录的鸭疫里默氏菌、大肠杆菌、沙门氏菌、多杀性巴氏杆菌的16S rDNA基因序列,设计了一对鸭疫里默氏菌16S rDNA基因的特异性引物190f和843r,分别以基因组DNA和菌落提取液为模板,从1~19型鸭疫里默氏菌参考菌株和代表亚型、变异株和可能新型的国内分离株共26株细菌中均扩增出大小为654bp的特异性片段,而扩增鸭大肠杆菌、鸭沙门氏菌和禽多杀性巴氏杆菌等感染鸭的常见细菌的结果均呈阴性。分别将鸭疫里默氏菌基因组DNA和菌落提取液进行10倍梯度稀释,基因组DNA的最小检出量为50pg,菌落最小检出量为15CFU/mL。结果说明,该PCR法具有较好的特异性和敏感性,可用于快速鉴定鸭疫里默氏菌。     

利用16SrDNA建立种特异性PCR快速检测鸭疫里默氏菌

鸭疫里默氏菌感染是危害养鸭业的主要疾病,用表型指标鉴定鸭疫里默氏菌存在不足,因此有必要建立检测该菌的种特异性PCR法。利用已登录的鸭疫里默氏菌、大肠杆菌、沙门氏菌、多杀性巴氏杆菌的16S rDNA基因序列,设计了一对鸭疫里默氏菌16S rDNA基因的特异性引物190f和843r,分别以基因组DNA和菌落提取液为模板,从1-19型鸭疫里默氏菌参考菌株和代表亚型、变异株和可能新型的国内分离株共26株细菌中均扩增出大小为654bp的特异性片段,而扩增鸭大肠杆菌、鸭沙门氏菌和禽多杀性巴氏杆菌等感染鸭的常见细菌的结果均呈阴性。分别将鸭疫里默氏菌基因组DNA和菌落提取液进行10倍梯度稀释,基因组DNA的最小检出量为50pg,菌落最小检出量为15CFU／mL。结果说明,该PCR法具有较好的特异性和敏感性,可用于快速鉴定鸭疫里默氏菌。     

检测鲆鱼腹水病病原菌迟缓爱德华氏菌和溶藻弧菌的嵌套PCR方法

本文首次建立了用嵌套式聚合酶链式反应（nested-PCR）分别检测天津地区海水工厂化养殖大菱鲆和褐牙鲆腹水病病原菌迟缓爱德华氏菌（Edwardsiella tarda）和溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）的方法。以E781F和E781R为引物,扩增迟缓爱德华氏菌溶血素基因中781bp的片段,再以E485F和E485R为引物,扩增其中的485bp的片段;以V899F和V899R为引物,扩增溶藻弧菌胶原酶基因中899bp片段,再以V550F和V550R为引物,扩增其中的550bp片段。以其他常见海水鱼类致病菌为阴性对照,结果均无非特异性扩增。对迟缓爱德华氏菌和溶藻弧菌的检出灵敏度分别可达10fg和1fg细菌DNA,显著优于目前的检测方法。作者应用该技术对天津地区海水工厂化大菱鲆和褐牙鲆于2006年3月至10月连续进行监测,为有效地控制该病的流行提供了技术支撑。     

牛蛙腐皮-红腿病并发症致病菌研究Ⅱ.荧光假单胞菌的分离和鉴定

对牛蛙腐皮 -红腿病并发症致病菌进行了分离、鉴定和人工感染试验 .从病蛙分离出 4株细菌 ,通过对健康幼蛙的人工感染试验 ,奇异变形杆菌和克氏耶尔森氏菌独立致发牛蛙腐皮病 ;嗜水气单胞菌和荧光单胞菌独立致发牛蛙红腿病 ,且都是通过伤口感染 .初步认为牛蛙患腐皮—红腿病并发症 ,是由于奇异变形杆菌、嗜水气单胞菌或克氏耶尔森氏菌与荧假单胞菌合并感染所致     

牛蛙腐皮——红腿病并发症致病菌研究

对牛蛙腐皮－红腿病并发症病菌进行了分离。鉴定和人工感染试验,从病蛙分离出４株细菌,通过对健康幼蛙的人工感染试验,奇异变形杆菌和克氏耶尔森氏菌独立致发牛蛙腐皮病;嗜水气单胞菌荧光单胞菌独立致发牛蛙红腿病,且都是通过伤口感染,初步牛蛙患腐皮－－红腿并发症,是由于奇异变形杆菌、嗜水气单胞菌或克氏耶尔森氏蓖与芝假单胞菌合并感染所致。     

翘嘴鳜病原嗜水气单胞菌分子特征及LAMP检测方法的建立

嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)是一种危害鳜鱼养殖生产的重要病原细菌, 为进一步明确该病原菌的分子特征及建立快速检测技术, 实验对引起翘嘴鳜(Siniperca chuatsi)暴发性死亡的病原嗜水气单胞菌进行了致病性、菌株毒力特征研究, 同时以嗜水气单胞菌气溶素基因aerA为分子靶标设计引物, 利用环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification, LAMP)建立了病原嗜水气单胞菌的快速检测方法。结果表明, 本次引起翘嘴鳜暴发性死亡的病原嗜水气单胞菌半致死浓度为1.6×106 CFU/mL, 携带aerA等14种毒力基因, 此14种毒力基因可用于其致病性分析及分子检测。以气溶素基因aerA设计引物进行的环介导恒温扩增, 结果显示可扩增出阶梯状条带, 加入SYBR Green I染色后呈现绿色的阳性反应, 而对照组均未出现任何扩增条带且反应体系呈现橙色, 表明LAMP检测方法对于嗜水气单胞菌检测具有很好的特异性; 灵敏度检测的最低检测限为4.6×101 CFU/mL; 10种经人工感染的淡水养殖鱼虾组织匀浆增菌液, 提取DNA后进行LAMP方法检测, 结果均可获得阳性扩增结果, 而对照未染菌组呈阴性, 表明该方法具有较好的应用性, 可应用于嗜水气单胞菌引起的水生动物疾病的检测。     

牛化脓性隐秘杆菌病PCR诊断方法的建立

近几年犊牛化脓性肺炎发病率逐年升高, 经检测该病原以化脓性隐秘杆菌为主, 研究建立快速检测化脓性隐秘杆菌的PCR诊断方法。根据化脓性隐秘杆菌16S rRNA基因设计并合成一对特异性引物, 对PCR条件进行优化后通过特异性试验和敏感性试验检测其特异性和敏感性。扩增出927 bp目的基因, 最佳引物浓度为0.2 μmol/L、退火温度58°C、Mg2+浓度1.5 mmol/L, 特异性试验结果表明化脓性隐秘杆菌参考菌株能扩增出927 bp目的基因, 而大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、化脓链球菌、蜡样芽孢杆菌、沙门氏菌、肺炎克雷伯氏菌和变形杆菌等的扩增结果均为阴性。敏感性试验结果表明, PCR的最低检出量为42个化脓性隐秘杆菌。建立的牛化脓性隐秘杆菌的PCR诊断方法, 具有较高的特异性和敏感性, 为化脓性隐秘杆菌引起的牛化脓性肺炎的快速诊断及流行病学调查提供了新的手段。     

致病性维罗纳气单胞菌检测方法的建立

发掘维罗纳气单胞菌特异性更强的检测靶点和毒力相关基因靶点,建立能够检测致病性维罗纳气单胞菌的PCR检测方法.通过序列比对分析气单胞菌的16S rRNA基因序列,筛选对维罗纳气单胞菌特异的引物,用于检测种特异性,利用气单胞菌气溶素基因保守引物,检测菌株的致病性,并进行反应条件和反应体系的优化,灵敏度试验和特异性试验.发掘并设计的维罗纳气单胞菌16S rRNA特异性引物结合气单胞菌气溶素基因保守引物建立的检测方法,对12株气单胞菌和10株非气单胞菌的检测结果显示,所有致病性维罗纳气单胞菌都能扩增到大小分别为343 bp和232 bp的特异性条带,而非维罗纳气单胞菌的致病性气单胞菌只能扩增到232 bp的气溶素基因特异性条带,其它菌株都不能扩增到目的条带.灵敏度试验表明,该反应体系的检测灵敏度为1.35×10-3 mg/L.我们建立的致病性维罗纳气单胞菌检测方法能特异地检测致病性维罗纳气单胞菌,并具有高度灵敏性.     

16S rRNA PCR鉴定嗜酸乳杆菌鸡源分离株

用自行设计的嗜酸乳杆菌16S rRNA的特异性引物和建立的PCR方法对初步鉴定为嗜酸乳杆菌的鸡源分离株进行检测。PCR检测结果表明分离株和嗜酸乳杆菌参考株扩增出大小一致的目的片段,从分子水平对鸡源分离菌进行了鉴定。