bgIS基因的亚克隆及功能分析

带有枯草杆菌B一1,3—1,4葡聚糖酶基因(bglS)7．1kb的EcoRⅠ片段,经亚克隆,将1．5kb的EcoRⅠ—PstⅠ酶切片段插入pucl9的po1ylinker上,转化E．Coil JM101后合成出β-l,3－l,4葡聚糖酶,它能专一性地降解大麦β－1,3—1,4葡聚糖和地衣多糖,酶的大部分(>50％)留在胞内,其中25％分泌到胞外。根据酶特性分析,大肠杆菌中合成的β一1,3—1,4葡聚糖酶完全与出发菌株枯草杆菌相同。     

连续温度变化对β-1,3-葡聚糖酶酶解酵母β-葡聚糖的影响

为了探索反应温度对产物组分的影响,利用自制连续变化的温度梯度实验装置,研究了22 ℃~60 ℃ (±0.1 ℃) 区间内温度对一内切β-1,3-葡聚糖酶酶解酵母β-葡聚糖的影响,获得了酶解过程多点温度特性数据。分析表明：该酶酶解酵母β-葡聚糖的活化能为84.17 kJ/mol;以产物积累表示的最适酶解温度随时间延长呈指数下降;酶解产物组分受温度的影响,低温较高温获得的寡糖链长,高温区大于46 ℃可以获得以昆布二糖、昆布三糖为主的组分,而低温区小于30 ℃可以获得昆布五糖及更大分子量的产物。研究结果可为寡糖     

绿色木霉LTR-2 β-1, 3-葡聚糖酶基因的克隆及其在 毕赤酵母中的表达

根据从GenBank中检索到的木霉菌β-1,3-葡聚糖酶基因序列设计引物,以高产β-1,3-葡聚糖酶菌株--绿色木霉LTR-2的cDNA为模板,采用PCR方法扩增得到内切β-1,3-葡聚糖酶基因(glu).将glu克隆至载体pMD18-T上,进行了全序列测定.序列分析表明该基因由2289个核苷酸残基组成,含有一个开放阅读框架,可以编码762个氨基酸,与报道基本相同.翻译后的氨基酸序列含有两个β-1,3-葡聚糖酶的保守区RVVYIPPGTY和AASQNKVAYF.基因与已发表的木霉β-1,3-葡聚糖酶基因有较高的同源性,其中和哈茨木霉bgn3.1和绿木霉bgn13.1的同源性达到93%.序列已经提交GenBank,登录号为EF176582.将glu基因插入到巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)穿梭载体pPIC9K中,获得重组质粒pGLU14,经线性化后转化毕赤酵母菌株KM71.经大量平板筛选,获得能有效分泌表达β-1,3-葡聚糖酶的毕赤酵母工程菌株KGLU14,菌落PCR扩增证实了glu基因已经整合到酵母基因组中.SDS电泳结果表明其β-1,3-葡聚糖酶的分子量大约为80kDa,和理论推测值大致相同.摇瓶发酵结果表明,培养基中β-1,3-葡聚糖酶的活力可达889U/mL.     

发根农杆菌介导几丁质酶基因和β-1,3-葡聚糖酶基因转化烟草的研究

用冻融法和三亲交配法将具有几丁质酶基因、β—1,3—葡聚糖酶基因和卡那霉素抗性标记基因的质牲pBLGC导入具有Ri质粒的发根农杆菌中。用叶盘法转化烟草的三个品种,经Kan抗性筛选获得126株再生植株,对119株再生植株分别以启动子CaMV35S、几丁质酶基因和β—1,3—葡聚糖酶基因的引物进行PCR检测,其中几丁质酶基因至阳性的植株有72株,β—1,3—葡聚糖酶基因至阳性的有47株,具有几丁质酶基因和β—1,3—葡聚糖酶基因的植株有36株。对转化的24株转基因经PCR-Southern杂交,结果均至阳性。实验结果表明,外源基因的转化频率与植物品种、外源基因片段的大小有关,几丁质酶基因和β—1,3—葡聚糖酶基因分别或共同整合到植物基因组中。     

哈茨木霉产β-1,3-葡聚糖内切酶的发酵工艺条件研究

对哈茨木霉(Trichoderma harzianum GIM 3.442)产β-1,3-葡聚糖内切酶的液体发酵条件进行了单因素优化实验,确定了最佳培养基成分和培养条件,在此基础上通过正交试验设计对复合碳源(葡萄糖、茯苓多糖)、胰蛋白胨、Na NO3和磷酸盐进行了L9(34)试验,研究了4种因素对哈茨木霉产酶的影响,确定了最佳培养条件:葡萄糖42.0 g/L,茯苓多糖18.0 g/L,胰蛋白胨15.0 g/L,Na NO35.0 g/L,初始p H 6.0,接种量8%,28℃,110 r/min培养6 d。优化后总酶活Etotal和β-1,3-葡聚糖内切酶Eendo活力达到了471.6 U/m L和327.4 U/m L,比优化前分别提高了7.3倍和23倍,且内切酶占总酶活的比例Eendo/Etotal由0.24增加到0.71,效果显著。     

解淀粉芽孢杆菌β-1,3-1,4-葡聚糖酶的高效表达

目的:克隆解淀粉芽孢杆菌β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因(bglA)使其在解淀粉芽孢杆菌CICIM B4081中高效表达,并对重组酶进行酶学性质研究.方法:以解淀粉芽孢杆菌(CICIM B4801)染色体DNA为模板,经过PCR扩增得到了大小约为0.8kb的β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因(bglA),构建了重组表达质粒pQ-bglA,通过电转化的方法将其转化人解淀粉芽孢杆菌(CICIM B4801)中.结果:得到了能高效表达β-1,3-1,4-葡聚糖酶的重组解淀粉芽孢杆菌.在250mL摇瓶条件下,重组菌分解地衣多糖的胞外最高酶活达到了1515.7U/mL,重组酶的最适作用温度为55℃,最适反应pH值为6.5.结论:重组菌的β-1,3-1,4-葡聚糖酶的酶活为原始菌株的11.84倍,实现了bglA基因在解淀粉芽孢杆菌中的高效表达.     

微生物1,3-1,4-β-葡聚糖酶蛋白质改造及工业应用研究进展

1,3-1,4-β-葡聚糖酶(E.C.3.2.1.73)是一种重要的工业用酶,其可以通过特异性切割毗邻β-1,3-糖苷键的β-1,4-糖苷键将β-葡聚糖或地衣多糖降解为纤维三糖和纤维四糖。微生物β-葡聚糖酶属于糖苷水解酶家族16,其三维结构为卷心蛋糕状的逆向β-片层结构。文中综述了近些年来β-葡聚糖酶在工业上的应用情况及酶蛋白质工程改造的研究进展,并对其研究前景进行了展望。     

产β-1,3-葡聚糖酶植物内生放线菌的筛选及抑菌活性研究

本研究采用透明圈法, 对217株植物内生放线菌产β-1,3-葡聚糖酶进行了检测, 结果表明: 45.6%的菌株能够产生β-1,3-葡聚糖酶, 黄瓜内生放线菌中的产酶菌株最多为38个; 不同植物来源的内生放线菌中具有产β-1,3-葡聚糖酶能力的菌株比例不同, 其中黄精中的产酶菌株比例最高, 达到88.9%。产酶菌株粗酶液对油菜菌核病菌的抑菌活性测定结果发现, 36个产酶菌株的粗酶液表现出不同程度的抑制作用, 占总产酶菌株的36.4%, 其中菌株gCLA4的粗酶液能够完全抑制病菌菌丝生长。对gCLA4菌株产酶     

β-葡聚糖酶和木聚糖酶高产菌株的选育及在小麦加工中的应用

以Aspergillus nigerJ5为出发菌株,经Co60γ-射线诱变,筛选到一株β-葡聚糖酶和木聚糖酶活力都较出发菌株高的突变株A-25,其产β-葡聚糖酶和木聚糖酶的合适发酵条件为:大麦粉4%、玉米浆2.5%、NaNO30.4%、Na2HPO40.1%、MgSO4.7H2O0.03%、FeSO4.7H2O0.01%、CaCO30.5%、吐温-800.25%,初始pH6.7,300mL三角瓶的装液量为50mL,在此条件下培养84h,β-葡聚糖酶活力达到1203.9I U/mL,较出发菌株提高35.9%,木聚糖酶活力达到395.2I U/mL,较出发菌株提高27.8%。突变株粗酶液降解工业面粉非淀粉多糖的能力明显高于出发菌株。     

β-1,3-1,4葡聚糖酶基因克隆表达及其抗菌活性与机理研究进展

β-1,3．1,4-葡聚糖酶是一类能水解β-1,3．糖苷键和β-1,4-糖苷键的酶,因其主要分解大麦中的β-1,3-1,4-葡聚糖和细菌地衣多糖,所以又称地衣多糖酶。综述了β-1,3．1,4-葡聚糖酶基因的克隆表达及其抗菌活性与机理最新研究进展。     

生防木霉菌β-1,3-葡聚糖酶活性研究

通过采取还原糖法对生防木霉菌真菌2号和真菌4号菌株在不同发酵时间产β-1,3-葡聚糖酶活性进行测定,对其产β-1,3-葡聚糖酶特性进行初步研究。结果表明,同一菌株在不同发酵时间β-1,3-葡聚糖酶活性大小变化的趋势大致相同,并均在培养72 h时β-1,3-葡聚糖酶活性达到最大,在相同发酵时间,真菌2号菌株比真菌4号菌株的β-1,3-葡聚糖酶活性要高。     

藤黄节杆菌β-1,3-葡聚糖酶基因在大肠杆菌中的克隆及表达

以藤黄节杆菌基因组为模板,克隆获得β-1,3-葡聚糖酶基因,分别构建至原核表达载体pET-28a(+)与pBAD18上,诱导获得高效表达,粗酶液对酵母多糖的裂解活性达到161 U/mL。在裂解酵母试验中,粗酶液也表现出较高的活性。研究中得到一株突变株,其对于研究β-1,3-葡聚糖酶在裂解酵母中多糖结合域的地位和作用有着重要的价值。     

细菌编码β-1,3-1,4-葡聚糖酶催化活性优化方法

β-1,3-1,4-葡聚糖酶是一类专一降解β-葡聚糖的内切水解酶。高效β-葡聚糖酶在啤酒酿造工业上具有十分重要的应用价值。目前,研究较多的β-1,3-1,4-葡聚糖酶主要来源于细菌。文中概述了细菌编码β-1,3-1,4-葡聚糖酶的分子生物学性质,并且从蛋白分子改造、表达调控和发酵条件优化三方面阐述了其催化活性提高的方法和成果。     

沙质微泡菌β-1,3(4)-葡聚糖酶的克隆表达及酶学性质

【背景】β-葡聚糖是自然界中广泛存在的非淀粉多糖,是谷类植物细胞壁的主要成分。β-葡聚糖酶能够水解β-葡聚糖生成低聚合度的寡糖,在食品、饲料、造纸等领域发挥着重要的作用。【目的】从海洋细菌沙质微泡菌(Microbulbifer arenaceous)中克隆到一个β-1,3(4)-葡聚糖酶基因,在大肠杆菌中可溶表达,研究其相关酶学性质。【方法】以沙质微泡菌(Microbulbifer arenaceous)基因组DNA为模板,克隆一个β-1,3(4)-葡聚糖酶基因(MaGlu16A),构建重组表达载体p ET-28a-MaGlu16A并在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,通过Ni-NTA亲和层析纯化后进行酶学性质研究。【结果】MaGlu16A的最适pH和最适温度分别为pH 6.0和40°C,在pH 5.0-10.5和35°C以下稳定。对EDTA具有较高的抵抗性,在1 mmol/L和10 mmol/L EDTA浓度下仍保持99.3%和82.5%的酶活力。该酶能够有效水解可得然多糖、昆布多糖、大麦葡聚糖、地衣多糖、燕麦葡聚糖和酵母葡聚糖,水解产物主要为葡萄糖、二糖、三糖和四糖。【结论】海...     

黑曲霉纤维素酶的化学组成

本文测定的黑曲霉纤维素酶各组分均为糖蛋白,但含糖量和组成各不相同,含糖量分别为：β－葡萄糖苷酶１１．３％,内切β－葡聚糖酶１１．８％,β－葡聚糖纤维二糖水解酶ＣＢＨ—１７．２％、ＣＢＨ－Ⅱ５．８％。各酶组分的氨基酸组成有一定的差异,但也有一些共同之处,即都含有较多的酸性氨基酸（Ａｓｐ、Ｇｌｕ）,碱性氨基酸（Ｈｉｓ、Ａｒｇ）含量较低。分析酶组分间的相似性时发现,β－葡聚精纤维二糖水解酶的ＣＢＨ－Ⅰ组分与内切β－葡聚糖酶在各种氨基酸的含量上较为相似,而同属于β－葡聚糖纤维二糖水解酶的两个组分ＣＢＨⅠ和ＣＢＨ—Ⅱ在氨基酸的含量上有一定的差异。     

β-葡萄糖苷酶产生菌的筛选及其所产纤维素酶酶系组成分析

从木霉属、曲霉属、担子菌等17种试验菌株中筛选出一株产β-葡萄糖苷酶活性较高的黑曲霉A.niger-nl-1。该菌株在适宜的培养条件下,β-葡萄糖苷酶的最高活力达到4.7U/mL,适宜的产酶周期为4d。制备的β-葡萄糖苷酶最适反应温度为55℃、最适反应pH为5.0。该菌株除能产生β-葡萄糖苷酶外,还能产生内切葡聚糖酶和外切葡聚糖酶,滤纸酶活达到0.62IU/mL。     

嗜热毛壳菌内切β-葡聚糖酶的分离纯化及特性

探讨了液体发酵嗜热毛壳菌（Chaetomium thermophile)产生的内切β－葡聚糖酶的分离纯化及特性。粗酶液经硫酸铵分级沉淀,DEAE－Seplharose Fast Flow阴离子层析,Pheny1-Sepha-rose疏水层析,Sephacry1 S-100分子筛层析等步骤便可获得凝胶电泳均一的内切β－葡聚糖酶,经12．5％SDS－PAGE和凝胶过滤层析法分离纯化酶蛋白的分子量约为67．8kD的69．8kD。该酶反应的最适温度和pH分别为60℃和4．0－4．5在pH5.0条件下,该酶在60℃下稳定：70℃保温1h后,仍保留30％的活性;在80摄氏度的半衰期为25min,金属离子内切β－葡聚糖酶的活性影响较大,其中Na^ 对酶有激活作用;Fe^2 ,Ag^ ,Cu^2 ,Ba^2 ,Zn^2 等对酶有抑制作用。该酶对结晶纤维素有没水解能力。     

耐低温β-葡聚糖酶高产菌株的选育

通过低温驯化、紫外诱变琼脂平板上的孢子的方法,对局限曲霉进行诱变。根据刚果红与β-1,3—1,4-葡聚糖耦合而保持红色的特征,采用鉴定平板与诱变平板为同一平板的快速高效的方法粗筛耐低温β-葡聚糖酶高产霉菌。最后经过摇瓶进一步复筛,筛选出一株产酶活力比原始菌株提高4倍多的诱变株QY-00305,该菌株有较好的稳定性。     

芽四糖淀粉酶产生菌的筛选与发酵条件的研究

从290个土样中分离到1380株细菌,加上本所其他课题组提供的细菌共1870株,其中有707株能分解淀粉,经过复筛、纸层析鉴定有3株菌的淀粉酶酶解液中主要产物是麦芽四糖,进一步用β－淀粉酶水解为麦芽糖,用萄葡糖淀粉酶水解为萄葡糖,确证为麦芽四糖。其中最优菌株为537．1,其酶解产物中麦芽四糖占90％,而其他两株菌的酶解产物中除麦芽四糖外,还有较多的麦芽糖及麦芽三糖,因此选择了537．1作为形成麦芽四糖淀粉酶的优良菌株,经鉴定,该菌属于产碱菌(Alcaligenessp．)。菌株537．1产酶的较好条件为t培养基中麦芽糖1．5％,蛋白胨0．5％,起始pH7—7．5,在27—28℃振荡培养48h。株537．1培养液可以酶解谷类、薯类和野生植物淀粉生成麦芽四糖。     

真菌多相结构的化学修饰

真菌多糖因具有独特的分子结构,一般都具有促进免疫、抑制肿瘤的活性,但这种活性随真菌种类及其产生的多糖种类不同而差异较大;另外真菌多糖都具有较大的分子量,水中溶解性较差,这为真菌多糖的实际应用造成了一定的困难．对某些真菌多糖的结构进行必要的化学修饰,不仅可增强其促进免疫和抗肿瘤活性,而且水溶性也大大地提高。茯苓多糖是β-1,6-葡糖链分支的β-1,3-葡聚糖,没有抗肿瘤活性,经高碘酸氧化、Smith降解、硼氢化钠还原可得较小分支的中间产物,再经酸水解去除分支得到直链多糖,即茯苓新糖。茯苓新糖和中间产物均具有很…