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1.
《中国生物化学与分子生物学报》2020,(7)
全基因组范围内的靶向基因调控是了解基因功能、操纵细胞行为以及开展生物医学研究的关键。与传统调控基因表达的方法相比,成簇的有规则间隔的短回文重复(CRISPR)-dCas9系统高度的灵活性和可编程性以及调控多个内源性基因的能力,为调控动物基因组提供了强有力和精确的靶向方法。具有DNA结合活性的核酸酶缺陷型dCas9蛋白与具有不同调控功能的效应域融合,使CRISPR-dCas9系统成为多种RNA引导的DNA靶向平台,例如转录调控和表观遗传修饰与基因组成像等。伴随着一系列高精度与高效率的靶向调控表观基因组技术的不断开发,CRISPR-dCas9已被广泛应用于阐释基因功能及基因间相互作用、揭示表观遗传机制等方面的研究,并在全基因组筛选、细胞重编程和靶向基因治疗等方面显示出广泛的应用前景。本文综述了近年来CRISPR-dCas9系统的作用机制、dCas9介导的转录调控和表观遗传修饰的研究进展,并对已有的各种dCas9方法进行归纳总结,依次介绍有关转录激活和转录抑制及其表观遗传修饰的方法和原理,比较各方法之间的差异。在此基础上,进一步介绍了dCas9介导的转录调控和表观遗传修饰在动物细胞研究上的应用现状,以期为CRISPR-dCas9系统靶向调控表观基因组的研究与应用提供参考。 相似文献
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酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)是重要的模式真核微生物,广泛用于基础研究和工业发酵。基于CRISPR/dCas9系统开发的转录调控方法具有可编程、多重性和正交性等优点,在酿酒酵母的基因调控、功能基因组学、代谢工程等研究领域具有巨大潜力。本文关注酿酒酵母中CRISPR/dCas9基因转录调控工具的研究进展,阐述了不同转录调节结构域对dCas9或gRNA活性的调节,设计与优化dCas9和gRNA表达的方法,影响CRISPR/dCas9系统转录调控效率、特异性和通量的靶向性因素,最后总结了该工具在酿酒酵母代谢工程中的应用,并对该技术的未来发展提出了展望。 相似文献
3.
已有研究表明c-myb基因在白血病等癌症中发挥重要的作用,但是目前关于c-myb基因的调控机制尚不清楚。为了探究c-myb基因启动子区域表观修饰对该基因表达调控的作用,我们利用CRISPR-dCas9系统,在融合了p300和DNMT3A蛋白后,分别和靶向c-myb启动子的引导RNA (guide RNA, gRNA)共转染到小鼠急性髓系白血病M1细胞(mouse myeloid leukemia, M1)中,ChIP-qPCR结果显示dCas9-p300和dCas9-DNMT3A分别成功结合到c-myb基因启动子区域,并伴随有启动子区域组蛋白修饰H3K27乙酰化或DNA甲基化5-mC的显著增高。Western blotting及RT-qPCR结果表明d Cas9-p300使M1细胞中c-myb表达明显上调(p0.001),而d Cas9-DNMT3A使c-myb表达明显下调(p0.05)。进一步研究证明dCas9-p300可以对抗白细胞介素6 (interleukelin-6, IL-6)引起的c-myb基因表达下调。本研究结果证明c-myb基因启动子的表观遗传修饰可以影响该基因的表达,为研究白血病等癌症提供了新的治疗思路和方案。 相似文献
4.
文库筛选技术广泛应用于生命科学研究各领域,加速了生物医药基础科研和临床实践的进展。本文对基于CRISPR-Cas9的文库类型和应用进行综述。CRISPR-Cas9文库包括敲除、活化和抑制文库。敲除文库通过Cas9/sgRNA靶向切割DNA序列,产生移码突变进行基因敲除。活化文库包括两种:一种是dCas9/sgRNA与转录活化蛋白质融合,例如dCas9-SAM,dCas9-SunTag和dCas9-VPR系统;另一种是dCas9与表观遗传修饰酶融合,例如dCas9-Tet1和dCas9-p300系统。CRISPR-Cas9抑制文库通过dCas9与表观遗传修饰蛋白质融合,抑制转录,例如dCas9-KRAB和dCas9-Dnmt3a系统。目前,CRISPR-Cas9文库广泛用于功能基因筛选、药物靶点和耐药靶点筛选、病毒靶点筛选和揭示信号通路,并在基因互作筛选及揭示顺式调节元件功能等方面初步展现其优势。CRISPR-Cas9文库优势在于其设计灵活、操作便捷、筛选高效。伴随基因编辑系统的研发,新的筛选文库靶向性和突变将更加精准,应用将更加拓展和深化。基于CRISPR-Cas9筛选文库不仅可以筛选病理和生理过程中的关键基因和非编码DNA,还可以揭示其发挥功能的分子机制,是剖析生命复杂调控网络的手术刀。 相似文献
5.
文库筛选技术广泛应用于生命科学研究各领域,加速了生物医药基础科研和临床实践的进展。本文对基于CRISPR-Cas9的文库类型和应用进行综述。CRISPR-Cas9文库包括敲除、活化和抑制文库。敲除文库通过Cas9/sgRNA靶向切割DNA序列,产生移码突变进行基因敲除。活化文库包括两种:一种是dCas9/sgRNA与转录活化蛋白质融合,例如dCas9-SAM,dCas9-SunTag和dCas9-VPR系统;另一种是dCas9与表观遗传修饰酶融合,例如d Cas9-Tet1和d Cas9-p300系统。CRISPR-Cas9抑制文库通过dCas9与表观遗传修饰蛋白质融合,抑制转录,例如d Cas9-KRAB和d Cas9-Dnmt3a系统。目前,CRISPR-Cas9文库广泛用于功能基因筛选、药物靶点和耐药靶点筛选、病毒靶点筛选和揭示信号通路,并在基因互作筛选及揭示顺式调节元件功能等方面初步展现其优势。CRISPR-Cas9文库优势在于其设计灵活、操作便捷、筛选高效。伴随基因编辑系统的研发,新的筛选文库靶向性和突变将更加精准,应用将更加拓展和深化。基于CRISPR-Cas9筛选文库不仅可以筛选病理和生理过程中的关键基因和非编码DNA,还可以揭示其发挥功能的分子机制,是剖析生命复杂调控网络的手术刀。 相似文献
6.
CRISPR/Cas9系统已不仅仅是一种革命性的基因编辑工具,还能在各种原核和真核生物中调控基因转录。近年来,由CRISPR/Cas9衍生而来的CRISPR-dCas9系统已被用于基因成像、高通量筛选、基因调控、必需基因功能研究及表观遗传调控等多个方向。总结了近年来CRISPRdCas9系统在激活或抑制基因转录、降低脱靶效率、sgRNA与转录强度及特异性之间的联系等方面的研究进展,以期对CRISPR-dCas9系统定向调控基因转录的研究提供参考和帮助,并就其未来可能的改进进行了展望。 相似文献
7.
《生命科学研究》2019,(5):345-351
运用由CRISPR/Cas9技术延伸的两种转录激活系统Cas9-p300和dCas9-VPR分别激活生殖特化相关基因,比较它们针对生殖细胞特化基因的激活效率。实时荧光定量PCR结果表明,这两种激活系统均可激活大部分目的基因的表达。其中, Cas9-p300系统激活BLIMP1基因的效率更高, dCas9-VPR系统激活NANOS2、DAZL、SOX17基因的效率更高,两种系统在激活DDX4、TFAP2C基因时效率无显著性差异。由此,本研究通过比较Cas9-p300和dCas9-VPR转录激活系统调控生殖特化相关基因的表达,揭示了不同的转录激活系统在激活生殖特化相关基因时的不同效率,这将为利用转录激活系统研究生殖细胞分化提供理论基础,也将为研究其他发育系统中细胞命运的转变提供借鉴。 相似文献
8.
《遗传》2020,(5)
CRISPR/Cas9系统是一种近年来被广泛应用于基因组编辑的强大工具。通过将CRISPR/Cas9系统中的Cas9蛋白突变后,使其失去剪切活性而成为dCas9 (nuclease-dead Cas9),再结合基因功能丧失(loss-of-function,LOF)、基因功能激活(gain-of-function, GOF)以及非编码功能基因鉴定技术即可实现全基因组高通量的功能基因及调控元件靶向鉴定和筛选。目前,该技术已被广泛应用于疾病免疫机理、药物靶点筛选和动物遗传育种等研究,为生命医学和基础科学带来了全新高效的技术方法和研究思路。本文综述了基于CRISPR/Cas9技术在全基因组中高通量筛选功能基因及调控元件的方法及研究进展,重点阐述了CRISPR/Cas9系统在动物细胞中筛选功能性基因的方法,以期为基因编辑及相关研究领域提供参考。 相似文献
9.
昆虫基因功能研究因缺少相应的工具而受到明显限制,但CRISPR/Cas9系统的出现为昆虫基因编辑及转录调控研究提供巨大助力。将Cas9核酸酶的RuvC和HNH剪切结构域失活改造得到的dCas9系统近年来在基因转录调控方面得到了广泛应用,同时CRISPR/dCpf1和最新发现的CRISPR/Cas13(a/b)系统为基因功能研究提供更多选择。本文综述了dCas9, dCpf1及Cas13(a/b)系统作用机理及在果蝇中的转录调控研究进展,以期为相关昆虫研究提供参考。 相似文献
10.
CRISPR/Cas系统作为一种高效的基因组编辑工具,已经被广泛地研究和应用于各个领域。CRISPR/Cas系统已从最初的CRISPR/Cas9发展到现在的CRISPR/Cas12a、CRISPR/Cas13a、CRISPR/dCas等十多种基因编辑系统;从原来的靶向作用于DNA到现在的除了靶向作用于DNA和RNA外,还能应用于转录调控、DNA循环等无需基因编辑的领域。CRISPR/Cas系统以往存在的诸多局限性正在被一个一个突破,该系统的应用已经进入了一个新的时代。本文对CRISPR/Cas系统近些年的发展情况以及新发现的各种CRISPR/Cas系统做了一个总结,并列举了各个系统最新的应用情况。 相似文献
11.
hnulp1是具有碱性螺旋-环-螺旋(bHLH)的新的一类转录因子.其C端含一个DUF654结构域,其序列在同源基因中相当保守,但该结构域功能未知.利用GAL4转录因子中的DNA结合结构域(DBD)和含有与DBD结合序列的荧光素酶报告基因(GAL4-Luc)质粒,构建了哺乳动物细胞转录因子活性分析系统,随后利用GAL4-Luc荧光素酶报告基因对5种含DUF654结构域的不同缺失片段转录抑制活性进行检测.检测结果表明,该基因DUF654结构域中从Δ228-407氨基酸区段具有强烈的转录抑制活性.该结果为进一步研究DUF654结构域的功能和hnulp1基因转录调控的机制奠定了基础. 相似文献
12.
本文探讨了CRISPR/dCas9系统对苜蓿中华根瘤菌Sinorhizobium meliloti 320内源hemE基因的弱化效果,以提高其维生素B_(12)的能力。实验首先验证了CRISPR/dCas9系统及CRISPR/dCas9系统不同N20靶向位点在S.meliloti 320中对外源基因gfp的弱化效果。结果显示,当添加诱导剂1%木糖时,单位OD荧光值降低为对照菌株的34.18%,当N20靶位靠近翻译起始位点时,对结构基因弱化效果明显。进一步探究CRISPR/dCas9对S.meliloti 320中内源的弱化效果发现,在加入终浓度为1%木糖诱导后,hemE基因的转录水平与对照相比下降了28.3%。将hemE基因弱化后的工程菌进行摇瓶发酵,其维生素B_(12)产量较对照株提高了9.86%。研究结果显示,hemE基因的弱化有效促进了代谢流引向维生素B_(12)合成,CRISPR/dCas9系统对S.meliloti 320内源结构基因具有较好的弱化效果。 相似文献
13.
成簇的规律间隔的短回文重复序列干扰(clustered regularly interspaced short palindromic repeat interference,CRISPRi)是一种新型转录抑制技术,该系统包含RNA介导的DNA内切酶dCas9和针对目的基因的特异性单向导RNA(single guide RNA,sgRNA),通过形成DNA识别复合物特异性识别相应DNA序列以抑制目的基因的转录。异柠檬酸脱氢酶(isocitrate dehydrogenase,ICD)是三羧酸循环中的关键代谢酶,在分枝杆菌的碳代谢过程中发挥重要作用。本研究利用CRISPRi高效抑制分枝杆菌特定基因表达的方法构建耻垢分枝杆菌icd敲低(icd knockdown,ICD-KD)株。定量聚合酶链反应(quantitative polymerase chain reaction,qPCR)和蛋白免疫印迹检测结果显示,耻垢分枝杆菌中icd转录水平与ICD蛋白表达水平显著下降,表明采用CRISPRi技术成功构建了耻垢分枝杆菌ICD-KD株。进一步研究ICD-KD株的生长情况,测定其在固体培养基点板及液体培养基中的生长曲线,结果均显示ICD-KD株生长速率明显减慢,同时菌体内ICD酶活显著降低,提示ICD对分枝杆菌的生长存活起重要作用。本研究使用CRISPRi技术快速构建了分枝杆菌必需基因的敲低菌株,为后续研究分枝杆菌ICD在碳源代谢通路中的功能和碳通量流向调控机制提供了重要基础。 相似文献
14.
基于CRISPR-dCas9的基因转录激活表达能够避免基因异位表达带来的表型干扰,同时使基因有效地特异性表达。该研究利用新型CRISPR-Act3.0表达系统,在毛果杨(Populus trichocarpa)中对维管形成层特异表达转录因子ANT(AINTEGUMENTA)进行基因转录激活,创制遗传材料,并对基因的功能进行分析。首先对毛果杨PtrANTs转录因子进行同源分析,选取其中的PtrANT-4进行后续研究,对该基因进行克隆并利用荧光定量PCR分析其在各组织中的表达情况;其次在PtrANT-4启动子上设计3条gRNAs,构建CRISPR-dCas9转录激活表达载体,利用原生质体瞬时转化法检测该载体的表达;最后将该表达载体利用农杆菌介导法转化毛果杨,获得PtrANT-4转录激活遗传材料。结果表明:毛果杨中有4个PtrANTs转录因子,选取的PtrANT-4基因CDS序列全长为2 058 bp,编码685个氨基酸,在毛果杨侧生分生组织维管形成层特异表达。基于CRISPR-Act3.0表达系统成功构建的转录激活载体,在毛果杨木质部原生质体中转化后具有激活PtrANT-4表达的作用。获得... 相似文献
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CRISPR-Cas系统是一种目前已知的基因编辑工具,其中以靶向DNA基因组编辑的CRISPR-Cas9系统的研究较为成熟。相较于靶向DNA的基因组编辑技术CRISPR-Cas9系统,近年来靶向RNA的Ⅵ型-CRISPR家族CRISPR-C2c2/Cas13a系统研究日渐增多。CRISPR-Cas13a系统具有特异性识别并结合单链RNA序列从而非特异性切割RNA的特点,可应用于检测肿瘤外周血游离核酸,对早期肿瘤患者进行筛查。同时,Cas13a在进行体内RNA切割的过程中,不涉及编码基因DNA的改变,可直接对基因转录产物mRNA进行编辑,达到基因修饰的目的,并能够同时靶向多基因转录产物从而调控基因的表达。Cas13a系统可应用于分子诊断及RNA编辑中,该系统在肿瘤的诊断与治疗中也被证实具有广阔的发展前景。基于已有的文献资料,文中综述了靶向RNA的CRISPR-Cas13a技术应用于肿瘤诊断与治疗的研究进展,探讨了CRISPR-Cas13a系统对癌症治疗的新思路及存在的局限,并展望了未来可能的研究方向。 相似文献
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目的:研究转录因子Mip1对大鼠心肌细胞H9C2凋亡相关基因Bid的转录调控作用.方法:以H9C2细胞基因组DNA为模板,扩增Bid核心启动子片段,将其克隆入荧光素酶报告基因质粒PGL3-Basic中,构建重组载体,并采用双酶切法、PCR法及基因测序对其进行鉴定.用脂质体转染法将该载体转入Mip1不同程度过表达的H9C2细胞,检测该细胞Bid基因启动子区的转录活性.结果:成功克隆Bid基因启动子区,双酶切、PCR和基因测序均显示PGL3-Basic-Bid promoter重组载体构建成功.荧光素酶相对活性检测显示在H9C2细胞中,随着Mip1转入的增多,Bid启动子区转录活性逐渐下降.结论:Mip1作为一个新的转录抑制因子,可以下调凋亡基因Bid的转录. 相似文献
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CRISPR-Cas9基因编辑技术在病毒感染疾病治疗中的应用 总被引:1,自引:0,他引:1
CRISPR-Cas9基因编辑技术是基于细菌或古细菌CRISPR介导的获得性免疫系统衍生而来,由一段RNA通过碱基互补配对识别DNA,指导Cas9核酸酶切割识别的双链DNA,诱发同源重组或非同源末端链接,进而实现在目的DNA上进行编辑。病毒通过特异的受体侵染细胞,其基因组在细胞内发生复制、转录、翻译等过程完成其生活周期,某些DNA病毒或逆转录病毒基因组会整合到宿主基因组中。基因治疗是病毒感染疾病治疗的新趋势。因此,基因编辑技术在持续感染的病毒或潜伏感染病毒疾病治疗中具有重大的潜在意义。文章主要从CRISPR-Cas9作用机制以及在病毒感染疾病治疗中的应用等方面进行了综述。 相似文献
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研究不同基因、染色体以及基因与染色体之间的时空关系在遗传学、发育生物学和生物医学等领域具有重要意义。CRISPR/Cas9基因编辑技术具有优异的靶向性,已经成为应用最广泛的基因编辑工具。近年来,研究人员基于Cas9的核酸酶失活突变体dCas9发展了一系列先进的活细胞成像技术,为染色质、基因组特定位点的高分辨成像提供了快速、方便的研究工具。文中从细胞递送方式、荧光信号优化以及正交多色成像3个方面对CRISPR/dCas9系统在活细胞成像中的研究进展进行了综述,并对该领域的发展趋势进行了展望。 相似文献
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【目的】利用大肠杆菌BL21λDE3表达系统,表达出有活性的副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus,VP)ToxR截短体蛋白,为进一步研究ToxR的转录调控机制奠定基础。【方法】以VP基因组DNA为模板,PCR扩增ToxR蛋白DNA结合结构域(ToxR-N)的DNA片段,并将其直接克隆入pET28a中,获得重组质粒;将重组质粒导入大肠杆菌BL21λDE3中,所得菌株经IPTG诱导后能表达出His-ToxR-N蛋白。利用限制级凝血酶切除His-ToxR-N中的His-标签,进而以VP的calR和VP1687为靶基因,通过体外的凝胶阻滞实验(EMSA)验证ToxR-N蛋白的DNA结合活性。分别构建克隆有calR和VP1687上游启动子区的LacZ重组质粒,并将重组质粒转入野生株(WT)和toxR突变株(ΔtoxR)中,通过测定β-半乳糖苷酶活性来比较两株重组菌中靶基因启动子活性,以验证ToxR对calR和VP1687的调控关系。【结果】成功表达出有活性的ToxR-N蛋白,该蛋白对calR启动子区具有结合活性。LacZ结果显示ToxR对calR的转录具有激活作用,而对VP1687的转录具有抑制作用。【结论】所表达的ToxR-N可用于后续的转录调控机制研究;ToxR通过直接激活calR的转录表达,而间接抑制T3SS1相关基因的表达。 相似文献
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CRISPR/Cas9的发现为多种生物的基因编辑提供了强有力的工具。然而,该系统在提供靶向性基因修饰的同时,会产生一些不需要的突变,即脱靶现象。为提高CRISPR/Cas9的特异性,我们将野生型FokI核酸内切酶的功能结构域与催化功能区失活的Cas9蛋白(dCas9)进行融合,形成融合蛋白用于降低脱靶效应。FokⅠ是一种依赖于二聚化才能行使内切酶活性的核酸酶,在本研究中,通过将FokⅠ功能结构融合到dCas9的N端,构建表达质粒pST1374-dCas9-FokⅠ。我们前期研究中,发现一个sgRNA在介导Cas9编辑Dnmt1基因建立条件敲除大鼠时,存在显著的脱靶现象。以此为基础,我们利用dCas9-FokⅠ/sgRNA系统编辑大鼠Dnmt1基因,研究该系统是否能够进行基因编辑以及是否能够提高基因编辑特异性。将转录好的dCas9-FokⅠ mRNA和sgRNA显微注射到SD大鼠的受精卵中,用于产生基因编辑大鼠。通过显微注射以及胚胎移植,最终获得43只F0代大鼠,其中两只在靶点位置包含突变,突变效率达4.5%。对脱靶情况进行分析,结果显示,无脱靶现象存在。综上,表明dCas9-FokⅠ/sgRNA可以应用于编辑大鼠基因,并能显著提高特异性。尽管dCas9-FokⅠ/sgRNA系统相比于Cas9/sgRNA系统,基因编辑效率有所下降,但是该技术的发展为基因治疗提供了可供选择的潜在工具。 相似文献