原癌基因c-myb在体外孕酮诱导小鼠卵母细胞成熟中的作用

目的：本文采用体外培养技术观察原癌基因c-myb对孕酮诱导的生发泡（GV）期小鼠裸卵体外成熟的影响。方法：建立小鼠裸卵体外培养模型,用不同浓度反义C-myb寡脱氧核苷酸（c-myb ASODNs）与GV期小鼠裸卵共孵育观察其对孕酮诱导的小鼠裸卵体外成熟的影响并探讨其机制。结果：在M199培养液中体外培养GV期小鼠裸卵24h,10μmol／L孕酮组与5μmol／L孕酮组比较有显著性差别（2 h GVBD％ P〈0.05,8 h PBI％ P〈0.05）．与20μmol／L孕酮组比较无显著性差别。10μmol／L c-myb AFODNs能抑制孕酮（10μmol／L）诱导的小鼠裸卵体外成熟（2 h GVBD％ P〈0.05,8 h PBI％ P〈0.01）。1×10^-4μmol／L dbcAMP、10μg／ml肝素钠可分别单独抑制孕酮诱导的GV期小鼠卵母细胞体外成熟（2 h GVBD％均P〈0.01,8 h PBI％均P〈0.01）．也可和反义c-myb ODN协同抑制孕酮诱导的卵母细胞体外成熟（2 h GVBD％均P〈0.01,8 h PBI％均P〈0.01）。结论：孕酮、原癌基因c-myb和cAMP、Ca^2＋参与了GV期小鼠卵母细胞的体外成熟,孕酮、cAMP和Ca^2＋调控卵母细胞成熟的机理可能与原癌基因c-myb表达有关。     

雌核发育银鲫和两性融合彩鲫卵母细胞体外诱导成熟过程中周期蛋白合成和MPF活性变化的比较研究

采用体外诱导卵母细胞成熟技术 ,比较研究了雌核发育银鲫和两性融合发育彩鲫卵母细胞成熟过程中周期蛋白合成和MPF活性变化情况。结果表明 :1 7α ,2 0 β 二氢孕酮(简称DP)浓度为 0 5μg/ml,温度为 2 4℃ ,光照时间 2 0小时为最适诱导条件。在相同条件下 ,两性生殖彩鲫卵母细胞体外诱导成熟速度明显快于银鲫。相应的细胞学研究表明 ,在体外诱导时 ,银鲫和彩鲫卵母细胞的发育成熟是正常的。银鲫卵母细胞生发泡破裂 (GVBD)时已有周期蛋白的合成 ,但生发泡破裂开始后则呈现合成速度下降直至没有合成的现象。尽管如此 ,卵母细胞中MPF活性却仍保持继续增强之势 ,至GVBD达1 0 0 %时 ,活性最强。而在两性融合发育彩鲫卵母细胞成熟过程中 ,周期蛋白的合成呈现出由较多到无 ,再逐渐到多的变化。GVBD开始时 ,周期蛋白合成较多 ,此后则急剧下降至几无周期蛋白的合成 ,以后随着成熟诱导的进行 ,周期蛋白的合成速度又缓慢回升至GVBD开始时的状态。与此相对应 ,MPF活性也出现从较强变无 ,再逐渐增至最强的变迁。这些结果初步揭示 ,鱼类卵母细胞中周期蛋白的合成和MPF活性的出现与卵母细胞的成熟分裂密切相关 ,雌核发育银鲫卵母细胞生发泡破裂开始以后 ,周期蛋白合成的消失可能与其特殊的三极纺锤体形成及其后的动力     

蛋白质合成活动与卵母细胞成熟

蛋白质合成率的增加是卵母细胞成熟过程中的重要现象之一;合成率的增加是 mRNA与核糖体机构两者协调活动的结果。S6蛋白磷酸化和 pHi 上升似乎与蛋白质合成增加有关,但有证据表明这种联系是表面现象,非必然的。翻译机构中的蛋白质因子 cIF-4 A 可能参与成熟中蛋白质合成活动的调控。本文还分析了蛋白质合成的总体变化特点,蛋白质合成、磷酸化活动与 MPF 活性和 GVBD 现象之间的关系,这是研究 MPF 活性以及卵母细胞成熟机理的一个重要方面。     

哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)在小鼠卵母细胞成熟过程中的表达及作用

哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)是一种Ser/Thr激酶,属于PIKK超家族,对调节细胞周期、蛋白质合成等具有重要作用,是细胞生长、增殖、分化、凋亡的中心调控器,但在哺乳动物卵母细胞中的研究还未见报道．以小鼠卵母细胞为研究对象,采用免疫荧光为主要研究方法,对mTOR在小鼠卵母细胞中的表达进行研究,并通过mTOR的特异性抑制剂雷帕霉素( rapamycin,RAPA )对卵母细胞进行处理,对mTOR在卵母细胞成熟过程中的作用进行研究．结果显示：小鼠卵母细胞成熟过程中,生发泡( germinal vesicle,GV )期mTOR主要集中在核膜处表达,生发泡破裂 ( germinal vesicle breakdown,GVBD )后mTOR伴随染色体分布,第二次减数分裂中期( second metaphase,MⅡ期 ) mTOR伴随纺锤体分布;雷帕霉素处理后,小鼠卵母细胞的成熟受到抑制,且这种抑制作用具有浓度依赖性,同时其mTOR的表达部位和形态也发生变化．研究表明,在小鼠卵母细胞成熟过程中,mTOR在各个时期的表达及分布具有阶段特异性,并对小鼠卵母细胞GVBD的发生和第一极体的排放都具有重要作用．     

环境温度影响蟾蜍卵母细胞成熟能力的机制之实验分析

长年饲养在高温(28—30℃)环境中雌性中华大蟾蜍,它们的卵母细胞可以长足,但经激素处理时,生发泡不破裂,仅显示成熟过程早期阶段的变化。值得注意的是,在孕酮刺激后的高温卵卵质中,出观了一种能诱发低温卵恢复减数分裂的物质,称作为“依赖冬眠因子的促成熟物质”(HF-MPS)。HF-MPS 与MPF 有不少相似之处,如孕酮处理后,它们在卵质中出现的时间相仿,它们的形成均不依赖于转录水平,而是依赖于翻译水平的蛋白质合成活动;但亦存在不同之处,如MPF 诱发低温卵GVBD 时程不受温度影响,而HF-MPS 在10℃环境中,诱发低温卵GVBD 的时间明显延缓;MPF 不仅能诱发低温卵GVBD,而且同样能诱发高温卵GVBD,然而,HF-MPS 只能诱发低温卵GVBD。由此表明,MPF 和HF-MPS 似乎是截然不同的两类活性蛋白质。高温卵缺少低温诱发产生的“冬眠因子”,所以不能恢复cdc 2基因的转录活动,不能实现MPF 自身催化扩增作用,不能保证孕酮处理后的卵母细胞完成正常成熟的全过程变化。足见,低温是中华大蟾蜍卵母细胞恢复减数分裂过程中的必要条件,是导致中华大蟾蜍现有区域分布的内在原因之一。     

褪黑素抑制小鼠卵母细胞的体外成熟

目的:探讨褪黑素(MT)对小鼠卵母细胞的体外成熟的影响.方法:通过卵母细胞自发、次黄嘌呤(HX)阻滞和激素诱导成熟三种体外培养模型研究了褪黑素(MT)对小鼠卵母细胞体外成熟的影响.结果:①0.1 g/L、0.02g/L、0.004 g/L及0.0008 g/L浓度的MT均能显著抑制小鼠卵丘卵母细胞复合体(CEOs)自发成熟过程中第一极体(PB1)的释放(P＜0.01);②动力曲线分析表明,MT对自发成熟的CEOs的GVBD和PB1有显著的推后作用,与对照组相比,处理组的GVBD和PB1分别被推后8～10 h和3～4 h;③0.1 g/L和0.02 g/L两有效浓度的MT还能显著抑制促性腺激素(FSH)诱导的HX阻滞的CEOsGVBD的发生(P＜0.05),对PB1的排出虽有一定的抑制作用,但没有统计学意义;④MT和次黄嘌呤(HX)对CEOs的自发成熟有协同抑制作用(P＜0.01),但在裸卵(DO)自发成熟的阻滞中没有协同效应.结论:MT是调节哺乳动物卵母细胞成熟的重要激素之一,其作用机制可能是通过卵丘细胞实现的.     

中华大蟾蜍卵母细胞成熟过程中膜电位变化的实验分析

中华大蟾蜍冬眠卵和高温卵的静息膜电位分别为-41.51±O.77 mV和-43.83±1.39mV。孕酮作用后,冬眠卵发生GVBD,膜逐渐去极化,至第二次成熟分裂中期,膜电位甚至可降至-10 mV;高温卵不发生GVBD,在早期(前4小时左右)出现膜去极化,之后恢复。高温休克(37-38℃)卵虽然亦不发生GVBD,膜去极化的情况与高温卵的相似,然而,卵质中却出现MPF。将孕酮作用后的冬眠卵核液转移注入未经任何处理的冬眠卵中,未能激起受体卵GVBD ??和膜去极化。接受MPF或促冬眠卵成熟因子的冬眠卵,均发生GVBD和膜去极化。接受MPF的冬眠卵的GVBD时间较孕酮诱发的提前约4小时,膜去极化的进程也相应提前4小时左右。蛋白质合成抑制剂嘌呤霉素能抑制由孕酮诱发的冬眠卵成熟效应,而不能抑制由MPF诱发的卵成熟效应。接受MPF的高温卵发生GVBD和膜去极化,而高温卵本身无能产生MPF,也不具备扩增MPF的能力。上述实验结果说明,冬眠卵质膜去极化与GVBD之前的核液无关,与MPF的出现亦无直接关系,该逐渐去极化的全过程可分二阶段,前阶段的去极化与孕酮诱发的早期蛋白质合成活动有关,后阶段与含MPF的卵质引起的生物学效应有关。     

一氧化氮供体硝普纳对小鼠卵母细胞体外自发成熟的影响

目的　探讨一氧化氮供体—硝普纳 (SodiumNitroprusside ,SNP)对昆明小鼠卵母细胞体外自发成熟的影响。方法　利用体外培养方法 ,在培养的不同时间观察卵母细胞的成熟情况 ,研究SNP对卵母细胞自发成熟的动力学影响。结果　 (1) 1mmol LSNP能够明显延迟卵丘卵母细胞复合体 (CEOs)的自发成熟 ,与对照组相比 ,CEOs的生发泡破裂 (GVBD)和第一极体 (PB1)释放分别延迟了 8h和 10h。但在培养结束 (2 4h)时 ,CEOs处理组的PB1释放率与对照组相比有明显的降低 ,而处理组的生发泡破裂 (GVBD)百分率和对照组相比没有明显变化 ;1mmol LSNP能够明显延迟裸卵母细胞 (DOs)的自发成熟 ,与对照组相比 ,DOs处理组的GVBD和PB1释放分别延迟了 6h和 12h。且在培养 2 4h后 ,DOs处理组的GVBD和PB1释放率与对照组相比有显著的降低。 (2 ) 1mmol LSNP能够明显促进CEOs中卵丘细胞的离散 ,造成CEOs互相粘连在一起。 (3) 1mmol LSNP能够明显影响体外培养的DOs的形态 ,但对CEOs的卵母细胞却没有影响。而 1μmol LSNP对CEOs和DOs的自发成熟都没有影响。 结论高浓度的SNP对小鼠卵母细胞体外自发成熟有抑制作用     

雷帕霉素靶在小鼠受精卵早期发育中的作用研究

哺乳动物雷帕霉素靶(mTOR)是细胞生长的中心调控因子,应用RT-PCR、免疫印迹、放射性同位素体外测定酶活性等方法,研究mTOR在小鼠受精卵第一次有丝分裂过程中在卵中的表达、活性变化以及对卵裂的影响.研究发现mTOR在小鼠卵母细胞和受精卵中都有表达,在mRNA水平,mTOR从G2期开始降解,在蛋白水平,则各期没有明显变化;mTOR的激酶活性在受精后明显升高,并且在整个1-细胞期保持较高活性;mTOR的特异性抑制剂雷帕霉素能抑制卵裂,并且能抑制成熟促进因子MPF的调节亚基cyclin B的表达,从而抑制了MPF的活性.结果表明mTOR可能通过促进MPF的激活而促进小鼠受精卵的分裂.     

原癌基因c-erbB2和c-myb经丝裂原活化蛋白激酶和成熟促进因子途径调节卵母细胞的成熟

本研究探讨了原癌基因c-erbB:和c-myb对小鼠卵母细胞成熟的影响及其在调控卵母细胞成熟中与丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)和成熟促进因子(mamration promoting factor,MPF)的上下游关系.c-erbB2反义寡脱氧核苷酸(antisense oligodeoxynucleotide,ASODN)和c.myb ASODN均呈剂量依赖方式抑制卵母细胞的生发泡破裂(germinalvesicle breakdown,GVBD)率和第一极体(first polar body,PBl)排放率,并显著延迟其成熟时间.小鼠卵母细胞显微注射重组人c-erbB2蛋白和c-myb蛋白后,培养6 h其GVBD率分别比对照组上升了23.1%(P<0.05)和32.2%(P<0.05),.培养12 h其PBl排放率分别比对照组上升了17.3%(P<0.05)和23.5%(P<0.05).RT-PCR结果显示,小鼠卵母细胞中存在c-erbB2mRNA和c-myb mRNA表达;c-erbB2ASODN能明显抑制卵母细胞中c-erbB2mRNA和c-myb mRNA的表达,c-myb ASODN能明显抑制卵母细胞中c-myb mRNA的表达,对c-erbB2 mRNA无明显影响;MAPK抑制剂PD98059以及MPF抑制剂roscovitine在抑制卵母细胞成熟的同时,均能阻断显微注射重组人c-erbB:蛋白和重组人c-myb蛋白对卵母细胞成熟的促进作用,但对卵母细胞中c-erbB2mRNA和c-myb mRNA表达无明显影响.Western blot结果显示,c-erbB2ASODN、c-mybASODN、PD98059、roscovitine均使卵母细胞中MAPK磷酸化水平和cyclinB 1含量下降.结果提示,原癌基因c-erbB2、c-myb在卵母细胞成熟中起重要作用,可能是调控卵母细胞成熟中关键蛋白激酶如MAPK、MPF的上游激活物.     

金鱼精子质膜和核膜的区域特异性

本文结合采用扫描和透射电子显微镜(包括冷冻断裂-蚀刻、超薄切片以及细胞化学染色法),研究了金鱼精子的超微结构特征,结果表明金鱼精子的质膜和核膜都具有区域特异性:1)精子质膜内大部分区域含有许多蛋白颗粒,但在特定区域内,蛋白颗粒呈有序排列,构成晶格状结构。2)精子头颈部和尾部均有液泡密集之处,凡是覆盖着液泡区的质膜内,几乎都不含有蛋白颗粒。3)液泡区能被细胞化学方法染成致密色,表明内含糖蛋白。4)核膜孔只集中存在于靠近颈部的核膜上,而其他部分则没有。本文对上述诸点进行了讨论。     

注射装载孕酮的红细胞膜泡诱发蟾蜍卵成熟的研究

中华大蟾蜍长足的卵母细胞,经注入装载水相孕酮的红细胞膜泡,能被诱发成熟;直接注入水相孕酮的卵母细胞,无能恢复成熟分裂。将蛋白酶处理的红细胞制备成装载水相孕酮的膜泡,注入卵内,照样能诱发其成熟分裂;然而,分别用根皮素结合或磷脂酶A_2水解红细胞膜磷脂,制备的膜泡,虽亦包裹着水相孕酮,但注射的卵母细胞都未能被诱发成熟。这些结果表明,在通过红细胞膜转运孕酮诱发卵母细胞成熟过程中,红细胞膜上的某些膜蛋白可能不是必要的成份,而膜磷脂类却是关键成份,它不仅可能保证孕酮不被迅速代谢,且保证孕酮从卵母细胞内部诱发成熟分裂。     

低分子量神经丝蛋白(NF-L)的体外组装

利用超速离心和离子交换层析技术,从牛脊髓中分离纯化了神经丝蛋白三组分:NF-L,NF-M和NF-H。应用电镜负染色和金属投影方法研究神经丝的形态结构与NF-L的体外组装,结果表明:神经丝由10nm的核心纤维与外周的丝状突起组成;在近似生理条件下,NF-L可在60min内组装成10nm纤维,纤维由4根亚丝缠绕而成;在碱性缓冲液中,NaCl能促进NF-L装配成短纤维,这种10nm的短纤维无法连接成长纤维。     

多种神经活性物质在幼年猫和鸡视网膜神经细胞中的共存(简报)

视网膜起源于前脑泡,结构简单层次分明,因此常被视为脑的简化模型。但近期工作证明,视网膜包含的神经活性物质(神经递质、调质和神经肽)种类之多、分布之复杂并不亚于脑。尤其是无长突细胞不仅包含多种递质和肽类,而且还有递质与肽类或肽类与肽类在一个细胞中的共存。对视网膜神经递质、调质和神经肽的研究将是探索脑奥秘的有效途径。     

血管内皮生长因子蛋白在大鼠睾丸和附睾的表达和定位研究

为探讨血管内皮生长因子(VEGF)在雄性生殖系精子发生发育和成熟过程中的调控作用,应用免疫组化、Periodic acid-Schiff(PAS)染色及蛋白质免疫印迹技术,检测VEGF蛋白在成年大鼠睾丸和附睾的表达和定位情况。Western-blots显示,在大鼠睾丸和附睾内均有VEGF蛋白(约45kD)的表达;免疫组化显示,睾丸内VEGF见于圆形和长形精子细胞、Sertoli细胞和Leydig细胞,免疫阳性产物位于细胞质内。精子细胞的VEGF表达伴随精子细胞顶体发育的全过程,精子残余体呈强阳性。附睾内VEGF表达于附睾管上皮,且有区域和细胞特异性。附睾起始段的所有上皮主细胞内都有VEGF阳性颗粒;头、体、尾各段的VEGF阳性细胞多数与含PAS阳性颗粒的细胞重合,证明为亮细胞;近端附睾的管腔内可见精子头部呈VEGF阳性染色。睾丸、附睾间质血管内皮为VEGF阴性。上述结果表明,VEGF蛋白可由生殖细胞和附睾管上皮细胞直接产生,它可能以自分泌和/或旁分泌的形式共同作用于睾丸和附睾的生殖细胞和血管内皮,直接或间接影响精子的发生、发育和成熟过程,特别是精子顶体的形成过程,并可能与精子在附睾内的成熟有关。     

花背蟾蜍蝌蚪发生类坏死的皮肤在恢复过程中的超微结构

本实验以花背蟾蜍后肢芽期的蝌蚪为材料,用0.001 mol/L氨水(氨水组)和0.01mol/L醋酸(醋酸组)处理皮肤使之发生类坏死。以细胞核、细胞表面、细胞质及细胞间隙等的超微结构变化为指标,研究了各组皮肤发生类坏死后恢复过程中的可逆变化。结果观察到:两组均能引起核染色质浓缩,粘液分泌,液泡增多,线粒体及内质网膨大变形,细胞间隙变窄;醋酸还引起张力原纤维的凝集及紊乱等。恢复过程中,细胞核内染色质的分布趋于均匀,粘液的分泌渐正常,液泡减少,线粒体及内质网的形态逐步恢复,但细胞间隙一直很??窄;醋酸组中张力原纤维恢复成束且排列较整齐。作者认为氨水及醋酸引起蝌蚪皮肤发生类坏死后,在一定时间内是可以恢复的,而且此可逆变化也反映在超微结构的变化上。     

Chlorophyll isolation,structure and function: major landmarks of the early history of research in the Russian Empire and the Soviet Union

This paper covers major events of the early history of chlorophyll research in the Russian Empire and the Soviet Union from 1771 until 1952, when the modern period of studies on photosynthesis began in full swing. Short biographical sketches of key scientists, reviews of their major research contributions and some selected photographs are included. This revised version was published online in August 2006 with corrections to the Cover Date.     

磁场对丘脑下部一氧化氮含量的影响及与丘脑下部神经内分泌核团的关系

应用硝酸还原酶反应—分光光度法测定和NADPH-d组织化学技术,对磁场处理后丘脑下部一氧化氮量的变化及其可能的原因进行了研究,发现磁场可促使丘脑下部一氧化氮量(OD值)显著升高,并具有显著滞后效应。NADPH-d阳性神经细胞及NADPH-d和血管加压素(AVP)双染阳性神经细胞集中分布在丘脑下部室旁核、室周核和视上核,但不存在 于视交叉上核,提示室旁核、室周核和视上核一氧化氮能神经细胞是丘脑下部的一氧化氮的主要来源。磁场处理后大鼠丘脑下部一氧化氮含量(OD值)较正常对照组显著升高应归因于这些神经细胞受磁场作用表达增强。一氧化氮和血管加压素的共存可能对磁场调节内分泌具有一定意义。     

重组人pLXSN-CD80逆转录病毒载体的构建及在CHO和PA317细胞中的表达

CD80是表达于抗原提呈细胞表面的分化抗原,它提供T细胞活化的协同刺激信号,并在抗肿瘤免疫应答中起着重要作用。我们在克隆了CD80全长。cDNA的基础上,将其与逆转录病毒pLXSN表达载体连接,构建成表达质粒,并用磷酸钙沉淀法将其转染PA317和CHO细胞,经G_(418)筛选获得抗G_(418)的PA317和CHO细胞克隆。以RIA,FACs和Westernblot检测CD80分子在PA317和CHO细胞上的表达、分布和分子量,结果显示,pLXSN-CD80转染的CHO细胞可表达较高丰度的CD80分子,其表观分子量为40kD。pLXSN-CD80转染的PA317和CHO细胞经5个月连续传代培养,无论存在G_(418)的选择压力与否,仍然持续表达CD80分子,表明我们构建的pLXSN-CD80表达载体具有应用于试验性治疗的潜能。     

荧光脂质体导入黄瓜悬浮细胞原生质体的研究

用“脱水再加水法”制成包裹荧光黄的脂质体,通过PEG诱导融合或保温共培养法,成功地将脂质体导入了黄瓜悬浮细胞原生质体。PEG处理组摄入脂质体的细胞可达80—90%,其中50—60%的细胞荧光较强,均匀一致。脂质体/原生质体保温共培养半小时,荧光细胞达95%以上,荧光较弱,在细胞中呈点状分布,3—4天后脂质体逐渐破裂,点状荧光变为均匀一致的荧光。导入荧光黄脂质体的原生质体经持续分裂形成愈伤组织和胚状体,进一步分化出芽和根。