产肠毒素大肠杆菌的热敏肠毒素B亚基(LT-B)和耐热肠毒素(ST)基因融合及其表达

采用基因重组技术构建了表达产肠毒素大肠杆菌(ETEC)的耐热肠毒素(ST)基因和热敏肠毒素B亚基(LT-B)基因融合抗原的疫苗候选株。将ST基因的5’端与LT-B基因的3’端连接,并置于同一阅读框。编码ST的基因是通过PCR从pSLM004质粒中扩增得到的,含有ST的pro序列(其编码ST前体的pro区域),并应用寡核苷酸定点突变技术将编码ST的第14位氨基酸残基发生突变,使ST的第14位氨基酸残基Ala突变为Leu。在所构建的结构中,于LT-B和proST之间分别插入了不同长度的氨基酸Linkers。表达的融合多肽同时具有ST和LT-B的抗原性,并保留结合GM-1神经节苷脂的能力,且无LT和ST的生物毒性。表达的融合蛋白免疫动物,能诱导产生相应的特异性抗体。     

产肠毒素大肠杆菌的热敏肠毒素B亚基（LT—B）和耐热肠毒素（ST）基？…

采用基因重组技术构建了表达产肠毒素大肠杆菌（ＥＴＥＣ）的耐热肠毒素（ＳＴ）基因和热敏肠毒素Ｂ亚基（ＬＴ－Ｂ０基因融合抗原的疫苗候选株。将ＳＴ基因的５‘端与ＬＴ－Ｂ基因的３’端连接,并置于同一阅读框。编码ＳＴ的基因是通过ＰＣＲ从ｐＳＬＭ００４质粒中扩增得到的,含有ＳＴ的ｐｒｏ序列,并应用寡核苷酸定点突变技术将编码ＳＴ的第１４位氨基酸残基发生突变,使ＳＴ的第１４位氨基酸残基Ａｌａ突变为Ｌｅｕ。     

产肠毒素大肠杆菌肠毒素LT,ST融合的研究进展

产肠毒素大肠杆菌（ＥＴＥＣ）肠毒素ＬＴ与ＳＴ融合是ＥＴＥＣ多价疫苗候选株研制的一项重要工作,ＬＴ与ＳＴ的化学偶联研究已证明融合后可使小分子的ＳＴ获得免疫原性成为完全抗原,而基因融合对构建多价疫苗则是更重要的手段。本文着重介绍了近年来对ＬＴ与ＳＴ基因融合的研究,特别是一些影响基因融合效果因素的基础性研究。这些都为候选株的研制提供了研究手段和依据,并对广泛的基因融合研究具有理论意义。     

大肠杆菌肠毒素的基因融合及其免疫原性的研究

应用重组基因工程技术,将热敏肠毒素Ｂ亚基（ＬＴ－Ｂ）基因与含有部分前体的耐热肠毒素（ｐｒｏ－ＳＴ）基因融合在一起,构建了表达ＬＴ－Ｂ／ｐｒｏ－ＳＴ融合蛋白的重组质粒．该融合蛋白不仅保持结合神经节苷脂（ＧＭ１）的能力,而且具有热敏肠毒素和耐热肠毒素的抗原性．乳鼠实验证明,融合蛋白虽然含有野生耐热肠毒素,但不具耐热肠毒素的生物毒性．腹腔免疫和鼻饲免疫均能激发产生抗ＥＴＥＣ两种肠毒素的抗体．     

猪肥胖基因在大肠杆菌中的高效融合表达

采用PCR方法扩增猪肥胖基因编码原成熟蛋白cDNA序列,并在5′端加上BamHⅠ位点,3′端加上EoRⅠ位点,将5′端密码子CCC转变为大肠杆菌常见密码子CCG,扩增得到459bp的片段,克隆于融合表达载体p GEX-2TBamHⅠ和EcoRⅠ位点,酶切、测序正确,经0．1mmol/LIPTG诱导表达出一条约42kD的融合蛋白,其中26kD为pGEX-2T中带有的谷胱苷肽转移酶,16kD是猪肥胖基因表达产物瘦蛋白。利用非融合表达产品制备抗血清,检测融合表达的重组蛋白,Western-blot为阳性。     

肠毒素大肠杆菌定居因子CS3和肠毒素融合抗原基因在减毒鼠伤寒沙门氏菌中的共表达

不耐热肠毒素（LT）和耐热肠毒素（ST）是产肠毒素大肠杆菌的主要致病因素,CS3为该菌的优势定居因子,是定居因子CFA/Ⅱ菌毛抗原的共有抗原组分。采用基因操作技术将编码CS3和融合肠毒素蛋白基因转化到减毒鼠伤寒沙门氏菌疫苗侯选株X4072中进行表达。用重组菌株口服免疫小鼠后,免疫动物能产生抗CS3、LT和ST的血清抗体。特别有意义的是,所产生的抗ST抗体能中和天然ST的生物活性。这一结果为研究载体疫苗防治肠毒素大肠杆菌腹泻疾病奠定了基础。     

人产肠毒素大肠杆菌ST、LT—B肠毒素基因融合的研究

将人产肠毒素大肠杆菌(ETEC),编码耐热肠毒素(ST)的基因片段与编码不耐热肠毒素B亚基(LT-B)的基因进行融合,并在此基础上进行不同数目ST基因的串联,ELISA检测融合基因表达蛋白产物观察到ST与LT-B之间存在着相互影响。ST的检测滴度随基因串联个数增加而逐渐升高,而LT的ELISA滴度则减弱。说明了ST可以通过基因串联提高表达产物抗原活性,这为产肠毒素大肠杆菌多价疫苗的研制提供了重要的研究基础。     

大肠杆菌肠毒素ST1-LTB融合基因表达条件的优化

目的:对已构建的含有大肠杆菌肠毒素ST1-LTB融合基因的重组菌株进行鉴定和表达条件优化。方法:采用限制性核酸内切酶酶切鉴定含ST1-LTB融合基因的重组质粒,同时用SDS-PAGE检测不同条件下ST1-LTB融合基因的表达情况。结果:酶切鉴定证实重组质粒pXSL1含有ST1-LTB融合基因且阅读框架正确,以IPTG为诱导剂诱导ST1-LTB融合基因表达的优化条件是:培养基pH7.5,培养温度37℃,IPTG浓度0.8mmol/L,菌体生长密度OD600达到0.8时加入IPTG,诱导时间5h,此时ST1-LTB融合蛋白表达量达35.2%。结论:实现ST1-LTB融合基因的高效表达,为大肠杆菌肠毒素双价基因工程菌苗的生产工艺研究提供了可靠的实验数据。     

两种人源化单链抗体-尿激酶融合基因的构建与表达

Ｓｃｕ ＰＡ 32Ｋ是单链尿激酶 (Ｓｃｕ ＰＡ)分子的Ｎ端肽段被水解后的产物 ,其分子量小但具有与Ｓｃｕ ＰＡ相同的体内外生物活性[1] 。在过去的工作中 ,本实验室利用噬菌体表面呈现技术筛选到 1株对人纤维蛋白特异的鼠源单链抗体[2 ] ,并构建了鼠抗人交联纤维蛋白单链抗体—Ｓｃｕ ＰＡ 32Ｋ融合基因。为解决该融合基因在大肠杆菌中的高表达问题 ,通过在大肠杆菌中表达构建的一系列融合基因的缺失突变体 ,初步认定Ｓｃｕ ＰＡ 32Ｋ基因中两个连排的大肠杆菌稀有密码子ＡＧＧ(精氨酸 )是影响该融合基因表达的主要因素。用ＰＣＲ定位诱变法…     

Mn-SOD与抗癌胚抗原单链抗体基因的融合及高效表达

将Ｍｎ－ＳＯＤ与抗癌胚抗原（ＣＥＡ）单链抗体基因（Ｓｃ－Ｆｖ ｇｅｎｅ）融合,重组到含Ｔ７启动子的表达载体ｐＥＴ－２２ｂ（＋）中,构建表达质粒ｐＥＴＭｎ－ＳＯＤ－ＳｃＦｖ,并转化大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３）,进行高效表达,表达物占菌体可溶性总蛋白的２４％。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和蛋白质和迹图谱显示表达物分子量为４５ｋＤ与融合基因编码蛋白质的理论值相符。该蛋白质在大肠杆菌中为泌型表达有利于纯化。ＲＩＡ测定表     

人源化鼠抗人纤维蛋白单链抗体-尿激酶融合蛋白在大肠杆菌中的功能性表达

尿激酶是目前临床上广泛使用的一种有效的溶栓制剂 ,但由于尿激酶缺乏对血栓的特异亲和性 ,导致临床上尿激酶的使用剂量较大 ,容易出现全身性出血等副作用。因而开发对血栓特异的导向溶栓制剂是目前溶栓药研制的一个重要方向。本实验室在以前的工作中 ,利用噬菌体表面呈现技术 ,筛选到一种对人纤维蛋白特异的鼠单链抗体[1 ] ,在对该鼠抗体可变区进行结构模建的基础上[2 ] ,对其进行了人源化改造和体外亲和力成熟 ,得到亲和力和特异性较鼠抗体更好的人源化单链抗体[3 ] 。为研制导向溶栓制剂 ,本实验室构建了人源化单链抗体 低分子量尿激酶的…     

抗菌肽Diptericin cDNA的克隆及在E.coli中的融合表达

 从果蝇成虫中抽提总 RNA,RT- PCR扩增编码伏蝇素 diptericin的 c DNA,克隆并测定了全序列 .将该 c DNA亚克隆到融合表达载体 p MAL- CR1上 ,转化大肠杆菌 BL2 1菌株 ,进行了高效的可溶性融合表达 .通过离子交换层析纯化融合蛋白 ,经 Xa因子酶切后得到的重组 diptericin具有抗菌活性 .     

人颗粒裂解肽片段在大肠杆菌中的表达

目的：建立颗粒裂解肽（NKG5）的原核表达载体系统,并在大肠杆菌中获得表达。方法：采用寡核苷酸合成、PCR扩增得到NKG5编码序列,克隆到pGEM-T载体上,经测序正确后,再切下编码序列连接到重组表达载体pGEx-4T-1中,转化大肠杆菌BL21,用IPTG诱导重组工程菌表达,采用谷胱甘肽偶联的Sepharose 4B纯化重组蛋白。结果：重组菌株可以表达GST-NKG5融合蛋白,用免疫印迹反应鉴定纯化的融合蛋白,在相对分子质量34000处有一条带。结论：获得了在大肠杆菌中低表达的颗粒裂解肽融合蛋白,为后续研究奠定了基础。     

人自身抗原SmB'的基因克隆和原核表达

目的:为建立新的自身抗体检测方法,自行克隆、表达和鉴定人自身抗原SmB'。方法:应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术,从白血病淋巴细胞HL-60细胞株中克隆人自身抗原SmB'全长基因;将PCR产物直接进行TA克隆、鉴定及测序,再定向克隆至pGEX-5T载体中,转入大肠杆菌BL-21;阳性克隆经鉴定后在IPTG诱导下表达,产物行SDS-PAGE和Western印迹。结果:PCR产物长约700bp,与预期的657bp接近,测序结果与GenBank核酸数据库报道完全一致。pGEX-5T-SmB'重组阳性克隆酶切鉴定正确,SDS-PAGE和Western印迹结果显示融合蛋白相对分子质量为51000,具有天然人自身抗原SmB'的免疫原性。结论:克隆表达了人自身抗原SmB',为建立相应的自身抗体检测方法奠定了基础。     

含有Fxa切割位点的抗菌肽X在大肠杆菌中的融合表达

抗菌肽是昆虫体液免疫的重要成分[1,2 ] ,它们的分子量较小 ,具有抗菌、抗病毒和杀伤某些肿瘤细胞的功能 ,而不破坏人体正常细胞。基于它的这种选择性效应和分子小、无抗原性的特点 ,可望成为新一代的抗菌、抗肿瘤药物。然而 ,天然抗菌肽来源十分困难 ,不能满足研究和临床应用的需要 ,通过基因工程技术生产抗菌肽已成为人们普遍关注的焦点。抗菌肽ＣＭＩＶ是从家蚕蛹中分离并测定了其一级结构的新型抗菌肽 ,它由 35个氨基酸组成 ,不含甲硫氨酸 ,Ｃ 末端为酰胺[3 ] 。抗菌肽Ｘ是中国家蚕抗菌肽ＣＭＩＶ的变体 ,其一级结构与天然的抗菌肽ＣＭ…     

蜘蛛拖丝蛋白基因的构建及在大肠杆菌中的表达

蜘蛛大壶腹线产生的拖丝是非常优良的纤维蛋白, 具有独特的强度和弹性。基于拖丝蛋白高度重复序列和部分cDNA序列, 合成蜘蛛拖丝蛋白基因单体, 通过头尾相连的构建策略, 得到拖丝蛋白多聚体, 与原核高效表达载体pET30a(+)连接, 转化大肠杆菌BLR(DE3), 用IPTG诱导表达。 表达产物经His.Bind树脂金属螯合亲和层析一步纯化, 纯度达90%以上, 表达量为20mg/L。SDS-PAGE和蛋白质印迹图谱显示表达产物分子量为37kD, 其值与氨基酸组分分析结果与理论推算值基本符合。 