T细胞免疫球蛋白粘蛋白分子-4在免疫应答中作用及其与免疫疾病的关系

T细胞免疫球蛋白粘蛋白分子(T-cell immunoglobulin and mucin-domain-containing molecule,TIM)基因是近年发现的新的基因家族。TIM家族蛋白在调节免疫应答中发挥重要作用。TIM-4是TIM家族一个成员,是一种I型跨膜糖蛋白分子。TIM-4仅表达在活化的树突状细胞(dendritic cell,DC)和巨噬细胞的表面,它是TIM-1的体内天然配体。TIM-1与TIM-4相互作用可调节T细胞活化增殖,调节Th1/Th2细胞平衡。此外,TIM-4可与磷脂酰丝氨酸结合,促进巨噬细胞对凋亡细胞的吞噬作用。因而,TIM-4与一些过敏疾病和自身免疫疾病存在相关性。     

PS1基因突变敲入小鼠B免疫记忆细胞功能变化

探讨PS1基因突变敲入小鼠B免疫记忆细胞功能变化。OVA免疫PS1基因突变敲入小鼠,通过ELISA抗体检测观察B细胞免疫记忆功能;分离小鼠脾淋巴细胞,检测脾淋巴细胞增殖实验、B细胞表面抗原表达情况。痘苗病毒免疫正常和基因突变敲入小鼠两次,在免疫后的一年进行痘病毒腹腔攻毒实验,观察PS1基因突变敲入小鼠存活情况。通过分离中枢和外周淋巴细胞进行体外功能检测表明,PS1基因突变敲入小鼠细胞增殖功能明显降低(P0.0001);B记忆细胞表面蛋白表达有差异(P=0.045);痘苗攻毒实验结果表明,PS1基因突变敲入小鼠死亡率明显增高(P0.0001)。研究结果表明,PS1基因在调控B记忆细胞功能方面发挥重要作用,但是通过调控T细胞功能而发挥间接还是直接针对B细胞发挥调控作用,还需要进一步研究结果确认。     

长效抑制TIM-3表达增强ROR1嵌合抗原受体修饰的T细胞的抗肿瘤免疫应答

该文探讨了T细胞免疫球蛋白黏蛋白3(T cell immunoglobulin and mucin domain-containing protein 3,TIM-3)基因沉默对靶向ROR1的嵌合抗原受体(ROR1-CAR)修饰的T细胞增殖和抗肿瘤免疫应答的影响及其作用机制。通过短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)基因沉默技术长效抑制TIM-3在ROR1-CAR T细胞中的表达,采用qRT-PCR和Western blot实验检测TIM-3在mRNA和蛋白水平的表达情况;采用ELISA实验验证TIM-3基因沉默的ROR1-CAR T细胞对靶细胞的杀伤能力的影响;流式细胞检测进一步评估抑制TIM-3表达对ROR1-CAR T细胞的靶向杀伤和抗原依赖性的增殖能力的影响。结果显示,shRNA可显著抑制TIM-3在ROR1-CAR T细胞中的表达,但不影响ROR1-CAR T细胞的百分比和增殖活性;通过检测发现ROR1阳性的人结肠癌细胞系SW620分泌高水平的TIM-3配体—半乳凝素9(Galectin-9),该配体可直接作用于ROR1-CAR T细胞而发挥免疫负调控...     

pEGFP-N1-IRF3a重组质粒通过调节STAT1的活化诱导非小细胞肺癌细胞的凋亡

干扰素调节因子3(interferon regulatory factor 3,IRF3)在固有免疫激活的过程中发挥重要作用,其中IRF3a是由IRF3可变剪接形成的一个亚型,目前几乎没有研究报道该蛋白对肿瘤细胞凋亡的影响。在该研究中,首先通过qRT-PCR检测IRF3a基因在肺癌组织以及癌旁组织中的表达水平;然后通过PCR从人外周血细胞中获取IRF3a基因,与质粒pEGFP-N1成功构建重组质粒pEGFP-N1-IRF3a。重组质粒转染非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)细胞A549、H1299后,细胞凋亡比例明显升高,cleaved caspase8、cleaved caspase3水平也显著升高。此外,过表达IRF3a能激活STAT1,以p-STAT1抑制剂Nifuroxazide抑制STAT1的活性能显著抑制IRF3a诱导的细胞凋亡。因此,该研究成功构建了pEGFP-N1-IRF3a重组质粒,并进一步证明了IRF3a通过激活STAT1诱导NSCLC细胞的凋亡。     

重楼皂苷Ⅶ对SW-480细胞凋亡和周期的影响及机制研究

目的:探讨重楼皂苷Ⅶ(Paris saponin Ⅶ,PSⅦ)对人结肠癌SW480细胞凋亡和周期的影响及其机制。方法:采用Cell Counting Kit-8(CCk-8)试剂盒方法观察PSⅦ对SW-480细胞增殖的影响;流失细胞术研究PSⅦ对SW480细胞凋亡和周期的作用;培养SW-480细胞并给予1.0μmol/L、2.0μmol/L和4.0μmol/L PSⅦ 24 h后,采用Western blot法检测凋亡相关蛋白Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9、Bax和Bcl-2及周期相关蛋白Cdk-4、Cdk-6、Cyclin D1和p21的表达变化。结果:PSⅦ可明显抑制SW-480细胞增殖,并诱导其凋亡,其IC50值为5.25±0.46μmol/L;PSⅦ可促进SW-480细胞Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9、Bax及p21的表达,降低Bcl-2、Cdk-4、Cdk-6和Cyclin D1的表达。结论:PSⅦ可以通过线粒体和死亡受体途径诱导SW-480细胞凋亡;将SW-480细胞周期阻滞于G1期是通过上调p21,抑制Cdk-4、Cdk-6与Cyclin D1周期调控蛋白的表达。     

重组艰难梭菌毒素B对小鼠结肠癌CT26细胞的诱导凋亡作用

本文探讨了重组艰难梭菌毒素B(rTcd B)对小鼠结肠癌CT26细胞的诱导凋亡作用。采用不同浓度rTcd B处理CT26细胞, 通过MTT法检测细胞增殖抑制率; 比色法测定Caspase 3活性; 细胞形态学和流式细胞技术检测细胞凋亡。结果表明, rTcd B显著抑制了CT26细胞的增殖, 并呈时间?剂量依赖性; Caspase 3活性在处理6 h后显著升高, 至18 h达到最大值, 与对照组相比差异显著, 具有统计学意义(P<0.05); 荧光显微镜观察到典型细胞凋亡形态学变化, 细胞膜内侧的磷脂酰丝氨酸(PS)异位到了膜外侧, 细胞膜呈明亮的绿色荧光; 通过流式细胞仪检测结果表明, 细胞凋亡率呈时间?剂量依赖性增加。实验结果表明, 重组艰难梭菌毒素B能够诱导小鼠结肠癌CT26细胞凋亡。     

重楼皂苷Ⅰ对肝癌细胞的增殖及凋亡的影响

探讨重楼皂苷Ⅰ(paris saponinⅠ,PSⅠ)在体外对人肝癌SMMC-7721细胞株增殖和凋亡的影响及相关机制.MTT法检测PSⅠ对肝癌SMM-C7721细胞株的增殖抑制作用,Hoechst 33528染色法观察细胞核的形态学变化,流式细胞术Propidium iodide(PI)染色检测细胞周期及凋亡的情况,免疫印迹的方法检测Fas、Bcl-2、Bax、细胞周期素D1(cell cycle regulatory factor D1,Cyclin D1)和细胞周期素E(cell cycle regulatory factor E,Cy-clin E)的表达情况.PSⅠ能时间和浓度依赖性的抑制肝癌SMMC-7721细胞的增殖,与对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05).干预后的SMMC-7721细胞染色质浓缩,核碎裂,凋亡小体形成,呈典型的凋亡变化.细胞周期阻滞于G1期,并且有凋亡峰形成,呈浓度依赖性.PSⅠ能浓度依赖性地上调Fas和Bax的表达,下调Bcl-2、Cyclin D1和Cyclin E蛋白的表达水平.PSⅠ可能是通过阻滞肿瘤细胞的生长及诱导细胞凋亡等机制,从而抑制肝癌细胞的增殖.     

磷脂酰丝氨酸外翻在细胞凋亡及其清除过程中的分子调控机制

细胞凋亡是程序性细胞死亡的一种重要方式,在多细胞生物中广泛存在。及时而有效地清除凋亡细胞对生物体的生长发育、维持内稳态起着关键的作用。在凋亡早期细胞会释放"食我"信号来促进吞噬细胞将其清除,目前关于"食我"信号研究最为广泛也最为透彻的是磷脂酰丝氨酸(phosphatidylserine, PS)。PS广泛分布于真核生物的细胞膜内侧面,PS外翻是细胞凋亡早期的重要特征,也是吞噬细胞识别并清除凋亡细胞的重要信号。本文综述了细胞凋亡过程中PS外翻的生物学意义及其分子调控机制以及PS作为"食我"信号如何被吞噬细胞识别并介导细胞清除的过程。     

过表达MicroRNA-199a促进TNFα诱导的脂肪细胞凋亡

旨为探明micro RNA-199a(mi R-199a)对脂肪细胞凋亡的影响及核转录因子κB(nuclear factorκB,NF-κB)在其中的作用。培养3T3-L1脂肪细胞,使用肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factorα,TNFα)诱导细胞凋亡。在此基础上分别使用NF-κB阻断剂PDTC和mi R-199a mimic处理细胞,判断过表达mi R-199a对TNFα诱导的脂肪细胞凋亡的影响及NF-κB在其中的作用。使用流式细胞仪分析细胞凋亡率,试剂盒检测Caspase3/7酶活,双荧光素酶报告系统检测NF-κB活性,q RT-PCR检测mi R-199a的表达水平,Western blotting检测NF-κB相关蛋白变化。结果显示,TNFα可以诱导分化的脂肪细胞凋亡并同时激活NF-κB,激活的NF-κB在TNFα诱导的脂肪细胞凋亡中发挥负调控作用。在脂肪细胞过表达mi R-199a明显抑制NF-κB的激活进而显著促进TNFα诱导的凋亡。mi R-199a通过调控NF-κB活性参与TNFα诱导的脂肪细胞凋亡。     

超表达蛋白激酶B对SMMC 7721肝癌细胞增殖和凋亡的影响

采用脂质体转染的方法 ,将含持续激活蛋白激酶B的真核表达质粒转染到SMMC 772 1肝癌细胞中 ,研究蛋白激酶B对人肝癌细胞增殖和凋亡的影响 .用RNA印迹及蛋白激酶B测活鉴定 ,并获得稳定表达持续激活蛋白激酶B的细胞株 ,用MTT法、软琼脂克隆形成率及细胞周期测定等方法检测超表达蛋白激酶B的 772 1细胞增殖情况 ,结果显示超表达蛋白激酶B的 772 1细胞生长能力增强 ,软琼脂克隆形成率增高 ,S期细胞增多 ,p2 7Kip1表达下降 .用流式细胞术检测悬浮培养诱导的细胞失巢凋亡 ,发现超表达蛋白激酶B能抑制细胞失巢凋亡 .上述结果提示蛋白激酶B能促进肝癌细胞增殖 ,抑制细胞凋亡 .     

脂肪酸诱导胰岛β细胞凋亡过程中FoxO1对MTP的转录调控研究

目的研究微粒体甘油三酯转移蛋白MTP在脂肪酸诱导的胰岛B细胞凋亡过程中,转录水平受FoxO1调控的情况。方法脂肪酸处理胰岛8细胞系MIN6细胞,MTF和Hoechst染色检测细胞活力和凋亡情况;ReahimePCR检测MTP相对表达量;染色质免疫共沉淀技术检验FoxO1与肘即启动子区的结合情况;荧光素酶报告基因系统检测Fox01对MTP的转录调控情况。结果脂肪酸处理引起MIN6细胞活力下降、凋亡增加,使MIN6细胞中MTP mRNA水平上升;糖尿病模型小鼠胰岛中MTPmRNA水平上升;转录因子FoxO1的过表达可上调MTP的转录活性;ChIP—PCR结果显示FoxO1能与MZP的启动子区相结合。结论MTP在脂肪酸诱导胰岛B细胞凋亡的过程中,作为转录因子FoxO1的下游靶基因,转录水平受到FoxO1的调控。     

Nature:TIM-3与CEACAM-1在癌症反应中介导T细胞免疫耐受

<正>免疫疗法(immunotherapy)是最近新兴的一种癌症治疗手段,其目的在于引导患者产生针对癌症细胞的特异性免疫反应。在最近的研究中,这种方法配合传统的手术与放射治疗具有出明显的优势。然而,作为基因突变的产物,癌细胞与人体正常细胞的特征十分相似,因此在诱导癌细胞特异性免疫反应过程中"自体免疫耐受"成为不可忽视的影响因素。TIM-3(T cell immunoglobulin domain and mucin domain-3)是一类T细胞表面抑制性分子,能够引起癌症与慢性病毒感染过程中T细胞的衰竭。与CTLA-4(cytotoxic T lymphocyte antigen-4),PD-1(programed death-1)相同,TIM-3也是目前研究最多的免疫治疗的靶点之一。因此,TIM-3     

CHOP双重调控衣霉素诱导的DU-145细胞凋亡及自噬的研究

目的研究内质网应激分子CHOP调控细胞凋亡与自噬的作用和机制。 方法利用衣霉素诱导DU-145细胞产生内质网应激,Western Blot法检测内质网应激相关分子Grp78、Grp94、p-eIF2α和CHOP及自噬蛋白LC3Ⅱ、Atg5和Beclin1的表达;用流式细胞术检测细胞凋亡水平;沉默CHOP基因,用Western Blot法检测凋亡蛋白PARP、Caspase3的表达,流式细胞术检测细胞凋亡;并利用免疫荧光检测自噬标志性蛋白LC3B的表达。 结果衣霉素诱导DU-145细胞内质网应激能诱导一定程度的细胞凋亡,衣霉素处理8、12、24?h的细胞凋亡率分别为3.27﹪±1.02﹪,8.97﹪±0.71﹪和11.67﹪±1.41﹪,处理12?h及24?h的细胞凋亡率与对照组相比差异具有统计学意义（P < 0.01）。同时也能通过抑制PI3K/AKt/mTOR信号通路激活DU-145细胞自噬。CHOP基因沉默抑制细胞凋亡,shCtrl组细胞凋亡率为32.17﹪±3.93﹪,shCHOP-1组细胞凋亡率为23.53﹪±3.41﹪,两组相比差异具有统计学意义（P < 0.05）。且CHOP基因沉默能促进细胞自噬分子LC3B的表达。 结论衣霉素诱导DU-145细胞内质网应激状态下,CHOP在细胞凋亡与自噬之间发挥双重调控作用。     

果蝇中整合素αPS3／βν介导吞噬细胞吞噬凋亡细胞和细菌

整合素是由2个跨膜α和β亚基组成的异源二聚体,具有各种细胞功能。整合素βν是果蝇整合素的β亚基,参与吞噬凋亡的细胞和细菌。该研究搜寻了与βν亚基形成复合物并共同作用的α亚基,通过RNAi感染动物模型检测发现,αPS3（而不是其他4个α亚基）是果蝇胚胎有效吞噬凋亡细胞所必需的。αPS3编码scb突变时,包括缺失突变、插入P元件或改变核苷酸序列,都能降低吞噬能力。这种降低作用能被过表达scb逆转。此外,用干扰RNA（RNAi）同时干扰苍蝇中αPS3和βν后,其吞噬能力与干扰任一个亚基相同。αPS3缺失也能降低幼虫血细胞吞噬金黄色葡萄球菌的能力。采用免疫共沉淀分析化学交联处理的果蝇细胞系发现,αPS3与βν具有物理相互作用。结果提示,整合素αPS3／βν是果蝇吞噬细胞吞噬凋亡细胞和细菌的受体。     

miR-92a对大鼠肝缺血再灌注损伤的抗细胞凋亡作用

为了探讨miR-92a与缺血再灌注损伤肝细胞的相关性,以及miR-92a表达改变对抗细胞凋亡的影响,本研究建立大鼠肝脏缺血再灌注模型,随机将21只大鼠分为7组,每组3只,分别为A:假手术(Sham)组;B:缺血(Model)组(3个时间点,每个时间点3只:6 h,12 h,24 h);C:缺血再灌注(IR)组(3个时间点,每个时间点3只:6 h,12 h,24 h)。缺氧模型建立,分为Control组和IR组。缺氧/复氧模型建立,分为Control组、Mimic组、Inhibitor组。实时荧光定量PCR (qRT-PCR)检测miR-92a、MAP2K4 (MKK4)和MAPK8(JNK1)表达,蛋白免疫印迹(Western blotting)检测Bcl-2、active Caspase-3、pJNK1的表达。CCK-8试剂盒检测细胞活性变化情况。研究结果表明,IR处理后大鼠肝组织损伤增加,缺血12 h时损伤最重,同时Bcl-2、active Caspase-3、pJNK1和MKK4表达增加,缺血引起细胞凋亡;IR处理后,大鼠肝组织miR-92a表达水平上升,均显著高于其它组(p0.05)。过表达miR-92a能降低active Caspase-3、IL-1β和IL-18的表达。抑制miR-92a表达,Bcl-2、active Caspase-3、pJNK1、IL-1β和IL-18表达会显著上升,同时诱导细胞凋亡。大鼠肝脏miR-92a的表达能抵抗大鼠肝缺血再灌注引起的细胞损伤和凋亡,与miR-92a调控抗凋亡蛋白、细胞炎症因子的表达及促进细胞增生作用机制有关。     

人星状病毒非结构蛋白C末端nsP1a/4蛋白6种删除突变体的构建与表达分析

星状病毒(Human astrovirus,HAstV)是通过引起小肠上皮细胞凋亡从而导致婴幼儿腹泻的重要病原体。课题组前期研究表明HAstV非结构蛋白nsP1aC末端蛋白nsP1a/4是诱导凋亡的主要功能性蛋白,可能含有与凋亡相关的重要结构域。为了探索nsP1a/4蛋白中的凋亡结构域,本研究采用绿色荧光蛋白真核表达载体,根据nsP1a/4蛋白功能性结构域的位置,选择不同的删除位点,构建nsP1a/4蛋白及不同结构域删除的nsP1a/4蛋白突变体,并将其转染BHK21细胞,在转染的24～72h检测重组蛋白在细胞内的表达并进行初步分析。结果显示,24h后荧光显微镜下可观察到融合nsP1a/4蛋白和其突变体的绿色荧光。Western blot分析结果显示7种融合蛋白均能在体外细胞中高效表达,72h表达量明显高于48h。这些结果表明我们构建的nsP1a/4蛋白及其删除突变体可在BHK21细胞中表达,可用于HAstV非结构蛋白nsP1a/4的凋亡结构域研究,从而为进一步研究HAstV分子致病机制提供研究平台。     

UVB 诱导凋亡时MAPK 和Mst1/caspase-3 信号通路调节 H2B 磷酸化作用

凋亡是真核细胞执行的高度协调的程序性自杀机制. 细胞凋亡时, 组蛋白的修饰与核
内事件有关. 尤其H2B 被Mst1 激酶磷酸化后, 参与调节核内凋亡事件染色质凝聚作用. 本研究
发现, UVB诱导细胞凋亡时, H2B发生磷酸化作用, 并且受MAPK家族(ERK1/2, JNK1/2 和p38),
Mst1 和caspase-3 信号通路调控. UVB能够以时间依赖方式激活MAPK家族激酶, 进而介导H2B
磷酸化, 但是H2B 乙酰化作用不受影响. 分别阻断ERK1/2, JNK1/2 或p38 任何一种激酶, 均能
抑制H2B 磷酸化作用. 而且, UVB 也能激活caspase-3, 活化的caspase-3 激活下游Mst1. 受到激
活的Mst1 直接磷酸化H2B, 导致染色质凝聚. 但是caspase-3 和Mst1 信号通路被完全阻断时, 只
能部分抑制H2B 磷酸化作用, 同时MAPK 家族激酶的活化不受影响. 因此, 细胞在受到UVB
诱导发生凋亡时, MAPK 和caspase-3/Mst1 信号途径分别独立调节H2B 磷酸化和染色质凝聚
作用.     

靶向IRE1a干扰质粒构建及对ERS时细胞增殖及凋亡的影响

目的构建靶向人IRE1a的shRNA干扰质粒（pSUPER-IRE1a）并观察其对人HeLa细胞和HepG2细胞增殖及凋亡的影响。方法设计并合成靶向IRE1a基因的两条shRNA,分别克隆至真核表达载体pSUPER构建重组质粒pS1、pS2,依次转染入HeLa细胞和HepG2细胞中。采用RT—PCR检测pS1、pS2转染前后IRE1a在HeLa细胞和HepG2细胞中的mRNA水平,免疫印迹检测pS1、pS2转染前后IRE1a蛋白的表达;MTT比色法、BrdU／DAPI双免疫荧光法及流式细胞仪分别检测各重组质粒对HeLa细胞和HepG2细胞增殖及凋亡的影响。结果干扰质粒（pSUPER-IRE1a）能有效抑制HeLa细胞和HepG2细胞中IRE1a基因的表达;成功转染后,细胞处于内质网应激（ER stress）状态时,各实验组细胞增殖率及凋亡率与对照组比较,差异均具有统计学意义P〈0．05）。结论成功构建靶向人IRE1a的shRNA真核表达载体pS1、pS2,有效抑制了HeLa细胞和HepG2细胞中IRE1a的表达;细胞处于ERS状态时,IRE1a-shRNA有效促进HeLa、HepG2两种肿瘤细胞的增殖;抑制HeLa和HepG2细胞的凋亡。     

蓝舌病毒HbC3株诱导人肝癌细胞Hep-3B的凋亡

采用MTT法检测BTV-HbC3对Hep-3B细胞的增殖抑制作用,流式细胞术检测BTV-HbC3诱导Hep-3B细胞的凋亡情况,透射电镜观察感染BTV-HbC3的Hep-3B细胞超微结构变化。结果表明BTV-HbC3对Hep-3B细胞具有抑制效应,并呈浓度和时间依赖性;BTV-HbC3作用下Hep-3B细胞呈现凋亡特征;BTV-HbC3能有效感染人肝癌细胞株Hep-3B,并在其中有限地复制,同时抑制该细胞增殖,诱导其进入凋亡。本研究证实了蓝舌病毒HbC3株对人肝癌细胞Hep-3B的杀伤及其诱导凋亡作用,结合本室已反复证实该病毒不感染人源正常细胞的事实,提示了该病毒具有抗人肝癌之潜能。