体细胞核移植克隆民猪: 培养液对卵母细胞成熟及胚胎发育的影响

体外培养成熟的卵母细胞是进行克隆猪研究所需受体卵母细胞的主要来源, 卵母细胞成熟质量与体细胞核移植胚胎发育能力关系密切. 为提高卵母细胞体外成熟率和成熟质量, 进而提高体细胞核移植猪的成功率, 本实验以改进的TCM199培养液为基础液(T), 分别添加10%的猪卵泡液(T+pFF)和 10%的胎牛血清(T+FBS)后进行卵母细胞成熟培养, 以成熟率和体细胞核移植胚胎发育率等重要指标为标准, 研究了pFF和FBS对卵母细胞成熟及核移植胚胎发育能力的影响. T, T+pFF和T+FBS组在成熟培养后42 h卵母细胞成熟率分别为(53.2±3.8)%, (69.7±3.8)%和(70.2±3.7)%, 添加10%的pFF和FBS显著(P<0.05)提高了卵母细胞成熟率; 3组不同成熟培养液获得的成熟卵母细胞在体细胞核移植后囊胚发育率差异不显著, 但T+pFF组的囊胚细胞数(34.5±2.24)显著(P<0.05)高于T组的囊胚细胞数(26.6±1.25). 来自T+pFF组的体细胞核移植胚胎经手术法移植入发情周期为第0天或第1天的18头受体母猪输卵管, 其中有3头受体母猪妊娠发育到期, 获得克隆民猪14头, 其中有6头健康成活至今. 实验结果表明, 培养液中添加10%pFF可以有效提高卵母细胞成熟比例和成熟质量, 在含有10% pFF培养液中获得的成熟卵母细胞具有支持核移植胚胎全程发育的能力.     

猪体细胞核移植重构胚的体外发育

以卵丘细胞为核供体细胞组成重构胚,卵裂率达到56．7％,发育至桑椹胚率达到11．7％,囊胚率为6．7％,显著高于成纤维细胞重构胚（P＜0．05）。本文还研究了卵母细胞的采集方法、激活程序和卵龄对卵丘细胞核移植重构胚体外发育的影响。以血清饥饿法将卵丘细胞诱导G0/G1期,抽吸法／解剖法采集卵母细胞,体外培养33－44h,将卵丘细胞放至去核卵母细胞的卵周隙中,重构胚以钙离子载体A23817或电脉冲结合6－DMAP激活处理,体外培养6d。研究表明,卵母细胞采集方法、激活液中细胞松驰素（CB）、激活程度并不影响重构胚的发育（以卵龄44h的卵母细胞为受体）;而以电脉冲结合6－DMAP激活处理能提高重构胚发育能力（以卵龄33h的卵母细胞为受体）（P＜0．05）。本研究显示,以电脉冲结合6－DMAP激活卵丘细胞重构胚,体外能发育至囊胚。     

猪体细胞核移植的研究进展和影响因素

自2000年Polejaeva IA获得第1头克隆猪后,短短几年时间全世界已有10多例成功的报道,使得猪的体细胞核移植有了长足的发展,但目前猪的体细胞核移植效率依然低下（1—2％）,人们对核移植中重编程分子机理的认识知之甚少。简要综述了猪体细胞核移植近年来的研究进展,就猪核移植中的技术难点和影响因素进行了分析,涉及供体细胞种类的选择、体外长期培养和高压筛选对随后核移植的影响以及供核细胞细胞周期的选择,核质双方的协调,去核和注核方法的选择,融合和激活程序的优化,妊娠的维持等。     

成熟培养液中胎牛血清添加量对山羊卵母细胞体外培养成熟的影响

本研究以屠宰奶山羊的新鲜卵巢为材料,回收可培养卵丘细胞-卵母细胞复合体(COC)。将可培养COC置于M199+FBS+100 IU/mL FSH+100 IU/mL LH培养微滴中,在5%CO2、95%空气、饱和湿度的CO2培养箱中39℃下培养。进行二因子三水平设计,比较基础培养液中添加FBS体积分数为0%、10%和15%时,及培养时间16 h、24 h、26 h的成熟率。结果表明:不添加FBS组的成熟率极显著(P0.01)低于其他两组,而10%FBS组与15%FBS组差异不显著(P0.05);体外培养16 h与培养24 h、26 h的卵母细胞成熟率分别为67.6%与81.7%、81.7%,差异极显著(P0.01),而后二者间未表现差异。     

影响猪体细胞核移植重构胚体外发育的若干因素

以卵丘细胞为核供体细胞组成重构胚,卵裂率达到56．7％,发育至桑椹胚达11．7％、孵化囊胚率为6．7％,显著高于成纤维细胞组成的重构胚（P＜0．05）。我们研究了卵母细胞的采集方法,激活方法和卵龄对卵丘细胞核移植重构胚体外发育的影响。以血清饥饿法将卵丘细胞诱导至G0或G1期,抽吸法／解剖法采集卵母细胞,体外培养33或44h,将卵丘细胞置于去核卵母细胞的卵周隙中,重构胚以钙离子载体A23817或电泳冲结合6－DMAP激活处理,体外培养6天,结果表明,卵 母细胞采集方法、激活液中细胞松弛素（CB）并不影响重构胚的发育（以卵龄44h的卵母细胞为受体）;而以电脉冲结合6－DMAP激活处理能提高重构胚发育能力（以卵龄33h的卵母细胞为受体）（P＜0．05）。本研究显示,以电脉冲结合6－DMAP激活卵丘细胞重构胚,能在体外发育至囊胚。     

TSA促进转基因猪体细胞核移植胚胎发育和外源基因表达

不完全的表观遗传重编程是造成转基因克隆动物效率低下的主要原因,组蛋白修饰作为表观遗传修饰的一个重要部分,可以直接影响克隆胚胎的发育和外源基因的表达情况。TSA(Trichostatin A)作为一种组蛋白去乙酰化抑制剂,可以改变组蛋白的乙酰化水平,促进表观遗传重编程,提高克隆动物的效率。同时TSA能改变染色质结构,使转录因子易于与DNA序列结合,促进外源基因的表达。文章确定了TSA处理转基因猪成纤维细胞和核移植胚胎的最佳条件,分别为250 nmol/L、24 h和40 nmol/L、24 h,通过进一步正交实验发现,TSA同时处理供体细胞和克隆胚胎可以显著的促进核移植胚胎的体外发育。此外,无论TSA处理转基因猪成纤维细胞或核移植胚胎,都可以提高外源基因的表达水平。     

猪卵泡内环境对其卵母细胞体外成熟与发育的影响

目的：研究猪卵泡内环境对卵母细胞体外成熟,受精及受精卵体外发育的影响。结果：直径≥5mm,4-4.9mm,3-3.9mm,2-2.9mm的卵泡内卵母细胞体外成熟率分别为90．5％,89．7％,85．4％和67．4％。体外受精后,受精卵的发育能力随卵泡直径的增大而增强,来自直径≥5mm和4－4．9mm卵泡的受精卵发育到2－细胞,3－4细胞的比率显高于来自直径2－2．9mm的卵泡受精卵（P＜0．05或0．01）,体外成熟培养36,42,48小时,直径2－2．9mm卵泡卵的体外成熟率,体外受精后的卵裂率差异不显（P＞0．05）。在体外成熟培养液中添加5％或15％的不同直径卵泡的卵泡液,各组间卵母细胞的体外成熟率,受精卵的体外发育率均无显差异。结论：卵泡大小对猪卵母细胞体外成熟,受精及受精卵体外发育有重要影响。     

不同激活方法对牛体细胞核移植胚胎体外发育的影响（简报）

Effects of different activation methods on the cleavage and in vitro development of bovine somatic cloned embryos constructed by intracytoplasmic nuclear injection were compared. The results show that the cleavage and in vitro development rate were not different significantly for constructed embryos cultured in 6-DMAP comparing with those in 6-DMAP + cytochalasin B (CCB) after activation with Ionomycin. Culture duration (3 to 4 h) in 6-DMAP or 6-DMAP + CCB had no significant effects on the cleavage and in vitro development ability of reconstructed embryos. CCB addition in the activation medium was benefit to the development of constructed embryos, although the effect wasn't significant. Within 1 to 4 h, the longer interval duration of nuclear injection and reconstructed embryo activation was, the higher cleavage and the blastocyst development rate of reconstructed embryos were.     

卵泡内环境对猪卵泡卵体外成熟和发育的影响

研究卵泡内环境对猪卵母细胞体外成熟、受精及受精卵体外发育的影响。主要结果如下：直径≥5mm、4－4.9mm、3－3.9mm和2－2.9mm的卵泡卵母细胞体外成熟率分别为90.5%、89.7%、85.4%和67.4%,体外受精后,卵母细胞的发育能力随卵泡直径的增大而增强,直径≥5mm和4－4.9mm卵泡卵的2－细胞、3－4－细胞发育率显著高于直径2－2.9mm的卵泡卵（P＜0.05或0.01）。体外成熟培养36h、42h和48h,直径2－2.9mm卵泡卵的体外成熟率,体外受精后的卵裂率差异不显著（P＞0.05）。在体外成熟培养液中添加5％或15％的不同直径卵泡的卵泡液,各组间卵母细胞的体外成熟率,受精卵的体外发育率均无显著差异,结果表明：卵泡大小对猪卵母细胞体外成熟、受精及受精卵体外发育有重要影响。     

山羊卵母细胞体外成熟过程中细胞核迁移的研究

本试验应用传统的醋酸地衣红染色法研究了山羊卵母细胞体外成熟过程中细胞核迁移现象,结果发现成熟分裂从GVBD现象起,其细胞核即由卵母细胞的近中央位置逐渐移向细胞表面,之后同源染色体分开,排出第一极体。卵母细胞成熟后,随着时间的延长,细胞核又逐渐远离第一极体端。试验结果采用面积积分法处理,结果为:0~5.7h山羊卵母细胞处于GV期,持续时间为5.7h;5.7~8.9h为DK期,持续时间为3.2h;8.9~15.9h卵母细胞处于MI期,持续7h;15.9~17.5h为AI期,持续1.6h;17.5~22h为MII期,持续4.5h。     

不同激活方法对牛体细胞核移植胚胎体外发育的影响(简报)

哺乳动物体细胞核移植在家畜品种改良、濒危珍稀动物保护以及生物学、医学等基础科学研究和应用中越来越显示出其重要的作用。自Wilmut等首次用成年动物体细胞作供体,获得第一只成年体细胞克隆绵羊“Dolly”以来,世界各国科学家进行了大量深入的研究,已在小鼠、牛、猪、山羊等家畜上获得了成功。而且,体细胞核移植技     

牛供体细胞的来源、血清饥饿和预激活对核移植卵体外胚胎发育的影响

牛皮肢成纤维细胞经血清饥饿或预激活处理后获得核胞体,并注入去核卵母细胞内构建重组胚。检查重组胚24h和36h卵裂率以及8d囊胚率,以评估供体细胞及其处理方法对体细胞核移植效果的影响。实验结果表明：来自3个年龄（6、18和36月龄）、2个品系（红安格斯肉牛和荷斯坦奶牛）的4头供体牛皮肤细胞重组胚的卵裂率和囊胚率均无差异。生长到完全汇合的36月龄荷斯坦牛供体细胞血清饥饿10-13d组重组胚的36h卵裂率显著低于0d（对照）、3-5d和6-9d组,囊胚率显著低于3-5d组;经5μmol/L离子霉素或7％乙醇预激活5min重组胚的卵裂率和囊胚率均与对照组无差异。     

细胞核重编程对克隆的影响

细胞核重编程是哺乳动物正常受精胚胎和克隆胚胎发育过程中的一个重要特性,主要是对表观遗传学特征进行重新编写,包括染色质重塑、组蛋白修饰、DNA甲基化、印记基因表达、X染色体失活等表观遗传修饰的改变。通过细胞核重编程,首先,受精卵和克隆胚胎的供体核停止其特有的基因表达程序,恢复为全能状态的基因表达程序;然后,受精胚胎和克隆胚胎的细胞再从全能状态重新进入分化状态,最终形成各种组织和器官。近年来,不少研究表明,克隆胚胎的细胞核重编程存在不同程度的表观遗传修饰异常,可能对克隆及其农业和医学应用有着重要影响。本文就正常和克隆胚胎细胞核重编程的研究进展以及克隆胚胎的细胞核重编程异常对克隆的影响作一综述,并对目前有关治疗性克隆前景的不同看法进行了讨论。     

初次卵裂时间是猪克隆胚胎发育潜能的重要标识

初次卵裂时间与哺乳动物胚胎发育潜能有关．比较了不同初次卵裂时间(20～24 h,早期;25～36 h,中期;37～48 h,晚期;20～48 h,对照)的猪孤雌(parthenogenetic,PA)、体细胞核移植(somatic cell nuclear transfer,SCNT)胚胎的囊胚发育率、扩张囊胚发育率和囊胚细胞数,评价其体外发育能力．发现早期卵裂的PA胚胎发育到第6天的囊胚发育率显著高于中期、晚期以及对照组(P < 0.05;54.0% vs. 19.6%,5.4%,18.7%)．扩张囊胚发育率,早裂胚胎同样优于其他组．早期卵裂的SCNT胚胎发育到第6天的囊胚比率高于中期卵裂胚胎(32.2% vs. 23.5%),而晚期卵裂胚胎发育到囊胚的比率最低(6.3%)．早期卵裂的SCNT胚胎发育到第6天的扩张囊胚比率显著高于其余各组 (P < 0.05;18.9% vs. 5.9%、3.1%、7.4%)．囊胚细胞数在早期、中期、晚期三组之间表现出下降趋势．将早期卵裂的SCNT胚胎与未经挑选的对照组胚胎分别进行移植,观察其体内发育能力．移植早裂SCNT胚胎的受体在产仔数和克隆效率上均明显高于未经挑选胚胎的受体(4.7 vs. 2.1;3.9% vs. 0.9%),说明早裂胚胎着床后具有更强的发育能力．以上结果表明：初次卵裂时间可以作为猪克隆胚胎发育潜能的重要标识,选择早裂的胚胎进行移植,有助于提高克隆效率．     

GTL2基因在体细胞核移植牛中的印记状态分析

体细胞核移植技术（SCNT）在医学研究、畜牧业生产和拯救濒危动物方面有重要的应用价值,而核移植效率低是制约其应用的主要因素．印记基因在哺乳动物胚胎发育和出生后的正常生长中都具有十分重要的作用,GTL2基因是在人和鼠中已被鉴定的印记基因,它作为一种RNA调解分子调控目的mRNA的转录．为了研究GTL2基因在自然繁殖牛和体细胞核移植牛中的印记状态,首先应用PCR-SSCP方法对GTL2基因多态性进行检测,鉴定自然繁殖牛和体细胞核移植牛中的杂合子,进而利用RT-PCR-SSCP技术对GTL2基因在杂合子牛的心、肝、脾、肺、肾、大脑中的表达状态进行分析．研究结果表明：GTL2基因在自然繁殖牛的被检测的6个组织中均表现为单等位基因表达,在体细胞核移植牛的心和肝中表现为单等位基因表达,而在大脑、脾、肺、肾中为双等位基因表达,GTL2基因在体细胞核移植牛的部分组织中表达紊乱有可能是造成体细胞核移植牛器官发育异常和核移植效率低下的原因之一．     

前培养对猪卵母细胞生发泡染色质构型和体外成熟的影响

在体外成熟培养时使卵母细胞过早接触高浓度激素可能影响体外成熟卵母细胞的质量。本实验研究了推迟卵母细胞与激素接触时间对卵母细胞GV染色质构型、卵母细胞核成熟质量及极体形态的影响。结果表明：猪体外成熟卵母细胞的极体形态不同,分为完整、退化、碎裂和无极体四种。在不含激素培养液中前培养12h,A类卵母细胞的GV-1比例(48．2％)明显高于在含激素培养液中前培养12h卵母细胞(27．1％);而前者的GV-3比例(19．6％)却明显低于后者(50．8％);前者成熟卵母细胞的极体完整率(59．6％)也明显高于后者(27．5％)。这说明推迟卵母细胞与激素接触时间可能提高体外成熟卵母细胞的质量和发育同步水平。     

蛋白质合成抑制剂亚胺环已酮（CHX）对猪卵母细胞体外成熟的影响

研究了蛋白质合成抑制剂亚胺环已酮（CHX）对猪卵母细胞体外成熟过程中的GVBD、染色质凝集、MⅡ期成熟及卵丘细胞扩展的作用。结果表明：（1）培养液中添加CHX,可抑制卵母细胞GVBD的发生,而且此作用是浓度依赖性的,但CHX的抑效果是完全可逆的;（2）在含10μg/mlCHX液中分别培养0、6、12和24h后转入正常培养液再继续培养至48h,卵母细胞成熟率分别为84．1％、77．1％、48．9％和27．8％;（3）正常培养液中培养0、6、12、24、36和48h后,再转入浓度为10μg/mlCHX液中继续培养至48h,卵母细胞成熟率分别为0、0、0、31．3％、65．4％和79．5％;（4）CHX对卵丘细胞扩展的影响培养时间延长而增强,在CHX中处理时间为16h或更长,完全抑制卵丘细胞的扩展。