脑啡肽基因的合成——Ⅱ.d-GGAAACCA的合成

本文报道了脑啡肽基因下链26核苷酸中八核苷酸片段d-GGAAACCA(10～17)的合成。合成系采用改良的三酯法,先合成和,再用对氯苯基磷酰二氯在1,2,4-三氮唑存在下磷酰化得到和,然后由bzAobz开始,依次同和缩合得到。在所有的缩合反应中,缩合剂均采用2,4,6-三甲基苯磺酰硝基咪唑。所得的全保护八核苷酸用浓氨水和80%醋酸脱去保护基后再经DEAE-葡聚糖凝胶A-25(7M尿素)柱层析分离纯化并去盐后,即得到d-GGAAACCA。产物经5'-~(32)P标记后,同系层析均一,蛇毒磷酸二酯酶部分酶解后的电泳-同系层析双向图谱能够得到预期的核苷酸排列顺序。     

脑啡肽基因的合成——Ⅰ.d-GATCCTAGA的合成

本文报道了脑啡肽基因下链二十六核苷酸中九核苷酸d-GATCCTAGA的合成。合成系采用改良的三酯法,即先合成和三个片段,然后由脱去5'-Dmt基后依次同和向5'端延伸缩合得到产物和是通过和分别同过量的d-T缩合,然后再用对氯苯磷酰双三唑对产物的3'-OH进行磷酰化得到。则是由同反应得到。在所有的缩合反应中,都采用2,4,6-三甲基苯磺酰硝基咪唑为缩合剂,缩合产物都以硅胶短柱层析分离纯化。除保护的九核苷酸未进行硅胶柱层析纯化之外,各中间片段经硅胶柱层析纯化后的收率都在75%以上。合成的全保护九核苷酸用浓氨水和80%醋酸相继脱去全部保护基后,以DEAE-葡聚糖凝胶A-25柱层析(含7M尿素)分离纯化,经去盐后得到d-GATCCTAGA,收率31.7%。产物的5'-OH用~(32)P标记后,同系层析均一,蛇毒磷酸二酯酶部分酶解后,作电泳-同系层析双向图谱,证明核苷酸排列顺序正确。     

脑啡肽基因的合成 Ⅰ.d-GATCCTAGA的合成

本文报道了脑啡肽基因下链二十六核苷酸中九核苷酸d-GATCCTAGA的合成。合成系采用改良的三酯法,即先合成d-_(Dmt)G_?~(ib)A_?~(Bs)T_(?OH)、d-_(Dmt)C_?~(An)C_?~(An)T_(?OH)和d-_(Dmt)A_?~(Bs)G_?~(ib)A_(OBs)~(Bz)三个片段,然后由d-_(Dmt)A_?(Bs)G_?~(ib)A_(OBz)~(Bz)脱去5′-Dmt基后依次同d-_(Dmt)C_?~(An)C_?~(An)T_(?OH)和d-_(Dmt)G_?~(ib)A_?~(Bz)T_(?OH)向5′端延伸缩合得到产物d-_(Dmt)G_?~(ib)A_?~BsT_?C_?~(An)C_?~(An)T_?A_?~(Bs)G_?~(ib)A_((OBs)_o)~(Bs) d-_(Dmt)G_?~(ib)A_?~(Bs)T_(?OH)和d-_(Dmt)C_?~(An)C_?~(An)T_(?OH)是通过d-_(Dmt)G_?~(ib)A_(?OH)~(Bs)和d-_(Dmt)C_?~(An)C_(?OH)~(An)分别同过量的d-T缩合,然后再用对氯苯磷酰双三唑对产物的3′-OH进行磷酰化得到。d-_(Dmt)A_?~(Bs)G_?~(ib)A_(OBz)~(Bs)则是由d-_(Dmt)A_?~(Bz)G_(?OH)~(ib)同d-A_(OBs)~(Bs)反应得到。在所有的缩合反应中,都采用2,4,6-三甲基苯磺酰硝基咪唑为缩合剂,缩合产物都以硅胶短往层析分离纯化。除保护的九核苷酸未进行硅胶柱层析纯化之外,各中间片段经硅胶柱层析纯化后的收率都在75%以上。合成的全保护九核苷酸用浓氨水和80%醋酸相继脱去全部保护基后,以DEAE-葡聚糖凝胶A-25柱层析(含7M尿素)分离纯化,经去盐后得到d-GATCCTAGA,收率31.7%。产物的5′-OH用~(32)P标记后,同系层析均一,蛇毒磷酸二酯酶部分酶解后,作电泳-同系层析双向图谱,证明核苷酸排列顺序正确。     

多核苷酸合成的研究——Ⅱ.CpUpCp、GpUp和CpUpCpGPUp的合成

本文报道了酵母丙氨酸转移核糖核酸3′-端茎区顺序中CpUpCpGpUp五核苷五磷酸的合成。Hou(OBz)-p-NHC_6H_5同_(MMT)G~(Ac)(OAc)-p或_(MMT)G~(iHu)(OiBu)-p用DCC缩合再脱去5′-MMT后可分别得到_(HO)G~(Ac)(OAc)-p-U(OBz)-p-NHC_6H_5和_(HO)G~(iBu)(OiBu)-U(OBz)-p-NHC_6H_5。_(HO)U(OBz)p-NHC_6H_5同_(Bz)C~(Bz)(OBz)-p用DCC缩合再脱去3′-末端磷酸的苯胺保护基得到_(Bz)C~(Bz)(OBz)-pU(OBz)-p,此保护二核苷酸再同_(HO)C~(Bz)(OBz)-p-NHC_6H_5用DCC缩合,然后再脱去3′-末端磷酸的苯胺保护基得到_(Bz)C~(Bz)(OBz)-p-U(OBz)-p-C~(Bz)(OBz)-p。此保护的三核苷酸同_(HO)G~(Ac)(OAc)-p-U(OBz)-p-NHC_6H_5用DCC缩合,然后脱去3′-末端磷酸的苯胺保护基和全部酰基保护基并经7世尿素柱层析纯化,最后得到自由的五核苷酸CpUpCp--GpUp0产物经纸电泳、薄板层析鉴定为均一,用牛胰核糖核酸酶水解后得到预期的核苷酸组成比例。     

多核苷酸合成的研究 Ⅱ.CpUpCp、GpUp和CpUpCpGpUp的合成

本文报道了酵母丙氨酸转移核糖核酸3’-端茎区顺序中CpUpCpGpUp五核苷五磷酸的合成。_(HO)U(OBz)-p-NHC_6H_5同_(MMT)GA~(AC)(OAc)-p或_(MMT)G~(iBu)(OiBu)-p用DCC缩合再脱去5’-MMT后可分别得到_(HO)G~(Ac)(OAc)-p-U(OBz)-p-NHC_6H_5和_(HO)G~(iBu)(OiBu)-U(OBz)-p-NHC_6H_(50) _(HO)U(OBz)-p-NHC_6H_5同_(Bz)C~(Bz)(OBz)-p用DCC缩合再脱去3’-末端磷酸的苯胺保护基得到_(Bz)C~(Bz)(OBz)-pU(OBz)-p,此保护二核苷酸再同_(Ho)C~(Bz)(OBz)-p-NHC_6H_5用DCC缩合,然后再脱去3’-末端磷酸的苯胺保护基得到_(Bz)C~(Bz)(OBz)-p-U(OBz)-p-C~(Bz)(OBz)-p。此保护的三核苷酸同_(Ho)G~(Ac)(OAC)-p-U(OBz)-p-NHC_6H_5用DCC缩合,然后脱去3’-末端磷酸的苯胺保护基和全部酰基保护基并经7M尿素柱层析纯化,最后得到自由的五核苷酸CpUpCpGpUp。产物经纸电泳、薄板层析鉴定为均一,用牛胰核糖核酸酶水解后得到预期的核苷酸组成比例。     

多聚核苷酸的合成与研究——Ⅵ.用于DNA无性繁殖研究的八脱氧核苷酸EcoRI接头的化学合成

用均三甲基苯磺酰氯(MS)作缩合剂,合成了带保护基的八脱氧核苷酸 dMMTr GpGpApApTpTpCpCp。B_2B_2B_2B2 AnAn脱去保护基后,经葡聚糖G-50凝胶过滤和7M尿素柱层析分离和纯化,得到双链的完全自身配对的八脱氧核苷酸 5′G—G—A—A—T—T—C—C—3′ 3′C—C—T—T—A—A—G—G—5′。经双向同系层析分析,核苷酸排列顺序符合实验设计要求。用Eco RI酶处理后,可以降解成小片段。     

多核苷酸合成的研究 Ⅴ.酵母丙氨酸转移核糖核酸3′-端半分子反密码区GpCpm~1Ipψ的合成

本文报道用化学方法合成酵母丙氨酸转移核糖核酸3’-端半分子反密码区中的GpCpm~1IpΨ四核苷三磷酸片段。合成路线是由_(Ho)Ψ~(Bz)(OBz)_2开始,采用逐个伸长的方式,依次同保护单核苷酸_(MMT)m~1I(OBz)-p,_(MMT)C~(Bz)(OBz)-p和_(iBu)G~(iBu)(OiBu)-p缩合得到全酰化的保护四核苷三磷酸,最后用NH_3/甲醇溶液脱去全部酰基保护基并经柱层析分离纯化得GpCpm~1IpΨ。所用缩合剂均为DCC。纯化后的GpCpm~1IpΨ层析电泳鉴定均一,碱解和酶解得到预期的核苷酸组成比例。     

多核苷酸合成的研究——Ⅴ.酵母丙氨酸转移核糖核酸3′-端半分子反密码区GpCpm~1pψ的合成

本文报道用化学方法合成酵母丙氨酸转移核糖核酸3′-端半分子反密码区中的GpCp-m~1IpΨ*四核苷三磷酸片段。合成路线是由_(HO)Ψ~(Bz)(OBz)_2开始,采用逐个伸长的方式,依次同保护单核苷酸_(MMT)m_1I(OBz)-p,_(MMT)C~(Bz)(OBz)-p和_(1Bu)G_(iBu)(OiBu)-p缩合得到全酰化的保护四核苷三磷酸,最后用NH_3/甲醇溶液脱去全部酰基保护基并经柱层析分离纯化得GpCpm~1IpΨ。所用缩合剂均为DCC。纯化后的GpCpm_1IpΨ层析电泳鉴定均一,碱解和酶解得到预期的核苷酸组成比例。     

多核苷酸合成的研究——改良三酯法化学合成脱氧十二核苷十一磷酸 d-CATGAATTCATG

本文报道一种简便的化学合成多聚脱氧核苷酸的三酯法以及自身互补的脱氧十二核苷十一磷酸d-CATGAATTCATG 的化学合成,这种方法包括:(1)直接使用容易制备的O~5',N-保护的脱氧核苷-3'-对氯苯磷酸二酯的钡盐和过量的N-保护的脱氧核苷缩合,高效地合成保护的二聚体三酯中间物DmtN'(?)N'OH(N'表示d-T,d-BzA,d-_(an)C 或d-_(ib)G;(?)表示对氯苯磷酸二酯)。(2)二聚体三酯中间物3'端的羟基和过量的对氯苯磷酰双三唑反应,得到几乎定量产率的磷酸化中间物DmtN'(?)N'(?)OH。(3)采用均三甲基苯磺酰硝基咪唑为缩合剂。试剂十分稳定,具有容易制备和缩合能力强的优点。(4)硅胶短柱层析方法应用于各个三酯中间物的分离纯化,层析过程可在3小时内完成。通过脱氧十二核苷十一磷酸d-CATGAATTCATG 的化学合成,证明这是一个快速合成多聚脱氧核苷酸的有效途径。首先,我们合成不同的二聚体三酯中间物,并依次缩合,得到八聚体d-_(HO)A~(Bz)(?)A~(Bz)(?)T(?)T(?)C~(An)A~(B(?))(?)T(?)G_(OBz)~(ib)和四聚体磷酸化中间物d-DmtC~(An)(?)A~(Bz)(?)T(?)G~(ib)(?)OH(产率70～94%)。然后,将上述四聚体和八聚体片段进一步缩合,并用浓氨水、80%醋酸脱除所有保护基,经葡聚糖凝胶G-75和DEAE-葡聚糖凝胶A-25二次柱层析纯化,得到脱氧十二核苷十一磷酸。顺序分析的结果证明合成的产物具有正确的结构。此外,产物能被限制性内切酶EcoRI 识别并水解得到预期的结果。     

多核苷酸合成的研究 改良三酯法化学合成脱氧十二核苷十一磷酸d-CATGAATTCATG

本文报道一种简便的化学合成多聚脱氧核苷酸的三酯法以及自身互补的脱氧十二核苷十一磷酸d-CATGAATTCATG的化学合成,这种方法包括:(1)直接使用容易制备的O~5',N-保护的脱氧核苷-3'-对氯苯磷酸二酯的钡盐和过量的N-保护的脱氧核苷缩合,高效地合成保护的二聚体三酯中间物DmtN'(?)N'OH(N'表示d-T,d-BzA,d-(an)C或d-_(tb)G;(?)表示对氯苯磷酸二酯)。(2)二聚体三酯中间物3'端的羟基和过量的对氯苯磷酰双三唑反应,得到几乎定量产率的磷酸化中间物DmtN'(?)N'(?)OH。(3)采用均三甲基苯磺酰硝基咪唑为缩合剂。试剂十分稳定,具有容易制备和缩合能力强的优点。(4)硅胶短柱层析方法应用于各个三酯中间物的分离纯化,层析过程可在3小时内完成。通过脱氧十二核苷十一磷酸d-CATGAATTCATG的化学合成,证明这是一个快速合成多聚脱氧核苷酸的有效途径。首先,我们合成不同的二聚体三酯中间物,并依次缩台,得到八聚体d-_(HO)A~(Bz)(?)A~(Bz_(?)T(?)T(?)C~(An)A~(Bz)(?)T(?)G_(OBz)~(ib)和四聚体磷酸化中间物d-DmtC~(An)A~(Bz)(?)T(?)G~(ib)(?)OH(产率70～94%)。然后,将上述四聚体和八聚体片段进一步缩合,并用浓氨水、80%醋酸脱除所有保护基,经葡聚糖凝胶G-75和DEAE-葡聚糖凝胶A-25二次柱层析纯化,得到脱氧十二核苷十一磷酸。顺序分析的结果证明合成的产物具有正确的结构。此外,产物能被限制性内切酶EcoRI识别并水解得到预期的结果。     

多聚核苷酸的合成与研究 Ⅱ.六脱氧核糖核苷酸的化学合成与抽提分离

用均三甲基苯磺酰氯(M8)作缩合剂,合成了二个六脱氧核糖核苷酸(d-_(MMTr)G_p~(Bz)A_p~(Bz)C_p~(An)G_p~(Bz)A_p~(Bz)G_p~(Bz)和d-_(MMTr)C_p~(An)G_p~(Bz)A_p~(Bz)A_p~(Bz)C_p~(An))*,脱去保护基后经双向同系层析测定核苷酸排列顺序,完全符合实验设计要求(d-G_pA_pC_pG_pA_pG和d-T_pC_pG_pA_pA_pC)。上述二个带保护基的六脱氧核糖核苷酸合成的每一步,都是采用溶剂抽提方法分离的,大大简化了分离的步骤和缩短了分离的时间,便于脱氧寡核苷酸的大量制备。此法也适用于其他带保护基寡核苷酸的制备,不论其三苯甲基衍生物基团在5′端或3′端(例如d-_pG_p~(Bz)A_(ODMTr)~(Bz))。     

多聚核苷酸的合成与研究 Ⅱ.六脱氧核糖核苷酸的化学合成与抽提分离

用均三甲基苯磺酰氯(MS)作缩合剂,合成了二个六脱氧核糖核苷酸(d-_(MMT_r)G~(Bz)_pA~(Bz)_pC~(An)_pG~(Bz)_pA~(Bz)_pG~(Bz)和d-(MMT_r)T_pC~(An)_pG~(Bz)_pA~(Bz)_pA~(Bz)_pC~(An)),脱去保护基后经双向同系层析测定核苷酸排列顺序,完全符合实验设计要求(d-GpApCpGpApG和d.TpCpGpApApC)。上述二个带保护基的六脱氧核糖核苷酸合成的每一步,都是采用溶剂抽提方法分离的,大大简化了分离的步骤和缩短了分离的时间,便于脱氧寡核苷酸的大量制备。此法也适用于其他带保护基寡核苷酸的制备,不论其三苯甲基衍生物基团在5’端或3’端(例如如d-_pG~(Bz)_pA~(Bz)_(-ODMT_r))。     

酵母丙氨酸转移核糖核酸5’-半分子顺序14～22九核苷酸的合成

本文报道了酵母丙氨酸转移核糖核酸5′-半分子中二氢尿嘧啶环区的九核苷酸AGDCGGGDAG的合成工作。合成的方案是采用先合成AGD、CGG和DAG三个三核苷二磷酸片段,然后再以AGD pCGGDAG(3 p6)或AGDCGG pDAG(6 p3)两种方式用T_4RNA连接酶连接成为所需要的九核苷酸。CGG和DAG是采用磷酸二酯法进行化学合成,AGD是用AG>P同D借核糖核酸酶N_1酶促合成。这个路线的优点是三个三核苷二磷酸片段易于大量合成制备,无论是3 p6或6 p3两条路线的中间产物AGDCGG(产率61%)和CGGDAG(产率64%)和最终的九核苷酸产物都能得到好的连接产率和分离纯度。3 p6和6 p3两条路线所得的九核苷酸的连接产率分别为52%和82%。合成的产物均经过毗邻分析,5′末端~(32)P标记后的电泳-同系层析双向纯度鉴定或凝胶电泳以及核苷酸顺序分析证明了合成产物的均一性和结构的正确性。     

多核苷酸合成的研究——Ⅵ.酵母丙氨酸转移核糖核酸5′-半分子反密码区中CpUpCpC和CpUpUpI的合成

本文报道用化学方法合成了酵母丙氯酸转移核糖核酸5′-半分子中反密码区的CUCC和cuuI两个四核苷酸片段。CUUI的合成路线是由(HO)I~(Bz)(OBz)_2开始,先同_(MMT)U(OBz)-p缩合并脱去5′-MMT后得到_(HO)U(OBz)-p-I_(Bz)(OBz)_2,然后与_(Bz)C~(Bz)(OBz)-p-U(OBz)-p缩合或者与_(MMT)U(OBz)-p和_(Bz)C_(Bz)(OBz)-p依次缩合得到全保护的四核苷三磷酸,最后用NH_3-甲醇溶液脱去保护基并分离纯化得到CUUI。而用_(Bz)C~(Bz)(OBz)-p-U(OBz)-p同_(HO)C_(Bz)(OBz)-p-C_(Bz)(OBz)_2缩合然后脱去保护基并分离纯化则可得到CUCC。反应缩合剂均采用DCC。合成的CUCC和CUUI均能为牛胰核糖核酸酶完全水解得到预期的碱基组成比例。     

多核苷酸合成的研究 Ⅹ.GpCpm~1Ⅰ和pGpCpm~1Ⅰ的合成

本文报导了GpCpm~1Ⅰ和pGpCpm~1Ⅰ的化学合成和酶促合成。同用DCC缩合并脱去3′-磷酸上的苯胺保护基后得到,后者再同缩合,然后脱去全部保护基经DEAE-葡聚糖凝胶A-25柱层析和电泳分离纯化而得到GpCpm~1Ⅰ纯品。而同用DCC缩合并脱去全部保护基后可得到Cpm~1Ⅰ,然后在核糖核酸酶N_1作用下同pG>p联结并经DEAE-葡聚糖凝胶A-25柱层析和电泳分离纯化则得到pGpCpm~1Ⅰ。GpCpm~1Ⅰ和pGpCpm~1Ⅰ均经酶解后得到预期的核苷酸组成比例。     

多核苷酸合成的研究 Ⅵ.酵母丙氨酸转移核糖核酸5′-半分子反密码区中CpUpCpC和CpUpUpI的合成

本文报道用化学方法合成了酵母丙氨酸转移核糖核酸5'-半分子中反密码区的CUCC和CUUI两个四核苷酸片段。CUUI的合成路线是由_(HO)I~(OBz)_2开始,先同_(MMT)U(OBz)-p缩合并脱去5'-MMT后得到_(HO)U(0Bz)-p-I~(Bz)(OBz)_2,然后与_(B(?))C~(Bz)(OBz)-p-U(OBz)一p缩合或者与_(MMT)U(OBz)-p和_(Bz)C~(Bz)(OBz)-p依次缩合得至4全保护的四核苷三磷酸,最后用NH_3-甲醇溶液脱去保护基并分离纯化得到CUUI。而用_(Bz)C~(Bz)(OBz)-p-U(0Bz)-p同_(HO)C~(Bz)(OBz)-p-C~(Bz)(OBz)_2缩合然后脱去保护基并分离纯化则可得到CUCC。反应缩合剂均采用DCC。合成的CUCC和CUUI均能为牛胰核糖核酸酶完全水解得到预期的碱基组成比例。     

用于DNA无性繁殖的EcoRI接头的化学合成

利用二酯法化学合成了一个脱氧八核苷酸(d-G-G-A-A-T-T-C-C)。此八核苷酸片段自身互补形成双链DNA片段,能被限制性内切酶EcoRI酶解。利用双向同系层析测定了它的核苷酸序列,证明这一片段的序列符合实验设计要求。     

多聚核苷酸的合成与研究 Ⅰ.十脱氧核糖核苷酸的化学合成

用片段缩合的方法,化学合成了十脱氧核糖核苷酸 d-_(MMT_r)G~(Bz)_pA~(Bz)_pC~(An)_pG~(Bz)_pA~(Bz)_pG~(Bz)_pT_pC~(An)_pC~(An)_pG~(Bz)。各中间片段及最终产物在脱除全部保护基后,均能定量地为桔青霉磷酸二酯酶酶解,并得到预期的碱基比例。将三苯甲基-纤维素柱运用于带MMTr基片段反应混合液的分离,能使情况简化,为进一步在DEAE-纤维素柱上分离纯化创造有利条件。     

一种用于检测5′-核苷酸磷酸二脂酶的荧光底物合成方法

本文利用间苯二酚为原料合成4-甲基伞形酮,继而经过磷酸酯化,缩合等反应过程合成4-甲基伞形酮-5′-胸腺嘧啶核苷磷酸二酯。反应过程中对胸腺嘧啶核苷的3′位羟基未加任何保护,缩合反应特异地发生在核苷的5′位羟基上。产品经过DEAE-葡聚糖凝胶柱层析分离纯化。利用纸层析、吸收光谱和酶学反应特征鉴定都证明合成的产品对于5′-核苷酸磷酸二酯酶具有专一性,可以用于5′-核苷酸磷酸二酯酶活性测定以及其同工酶谱分析。     

多核苷酸合成的研究 Ⅶ.RNA连接酶合成十六核苷酸 (CpUpCpGpUpCpCpApCpUpCpGpUpCpCpA)

~(32)pCUCGUCCA(作为供体),CUCGUCCA(作为受体),其比例为1∶50,在RNA连接酶催化下,进行连接反应,形成16核苷酸片段即CUCGUCCA~(32)pCUCGUCCA。反应后产物经Sephadex G-75柱分离,分离后得到的产物通过下列鉴定:抗碱性磷酸单酯酶;同系层析;毗邻分析等。证明是我们所希望的产物,其产率经过重复在50～70%之间。这种RNA连接酶对合成具有一定排列顺序的RNA片段,可以认为将是一种很好的工具酶。