两株对虾育苗用益生芽孢杆菌的筛选和鉴定

从土壤和虾池中分离到22株具有不同特征的芽孢杆菌,分别将各菌株对数期约5×10^8个细胞添加到500mL预先加有凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）无节Ⅲ期幼体的水体中,各菌株在初始水体中含量均约为106个细胞/mL,根据各菌株对无节Ⅲ期到蚤状Ⅱ期幼体变态成活率的影响,从中初步筛选出10株对幼体变态成活有极显著（p〈0.01）效果的芽孢杆菌。进一步又从初筛到的10个菌株中复筛到2株对幼体变态成活最为明显的芽孢杆菌,菌株zou4和zou8。两菌株与复筛的其他8株芽孢杆菌相比,均显著（p〈0.05）促进幼体变态存活率。根据形态和生理生化特征,菌株zou4和zou8分别初步鉴定为坚强芽孢杆菌（Bacillus firmus）和蜡状芽孢杆菌（B.cereus）。为进一步确定zou4和zou8的分类地位,测定了两菌株的16S rRNA基因序列,分析了相关细菌16S rDNA序列的同源性,构建了系统发育树。结果表明菌株zou4和zou8分别与坚强芽孢杆菌和蜡状芽孢杆菌的同源性最高,相似值均为99%以上。系统发育树上zou4和zou8也分别与坚强芽孢杆菌和蜡状芽孢杆菌聚为一类。综合上述结果,芽孢杆菌zou4和zou8菌株分别被鉴定为坚强芽孢杆菌和蜡状芽孢杆菌。     

地衣芽孢杆菌对凡纳滨对虾Toll和HSP70基因表达的影响

目的 分析地衣芽孢杆菌对凡纳滨对虾Toll和HSP70基因表达的影响.方法 根据芽孢杆菌的使用量设置测试1组(LDG,用菌量2.0×103 CFU/mL),测试2组(HDG,用菌量1.0 × 104 CFU/mL)及未使用芽孢杆菌的对照组(CG),每7d施菌1次,实验持续24 d.每6d取样对虾肌肉和肝胰腺检测Toll基因和HSP70基因的mRNA相对表达量.结果 对虾肝胰腺Toll基因mRNA表达量在LDG组和HDG组分别较CG组提高了410.05％和78.31％,但在肌肉中CG组的表达量则分别较LDG组和HDG组提高了31.81％和8.43％.可见,芽孢杆菌在一定程度上可提高Toll基因mRNA在对虾肝胰腺的表达,但对其在肌肉中的表达则呈一定的限制作用.在肝胰腺HSP70基因的mRNA表达量,HDG组显著高于CG组和LDG组(P＜0.05),CG组和LDG组的差异无统计学意义(P＞0.05);在肌肉中LDG组和HDG组的HSP70基因mRNA表达分别较CG组提高了26.07％和26.46％,但实验组的组间差异无统计学意义(P＞0.05).结论 在水体中施用芽孢杆菌104 CFU/mL和2.0×103 CFU/mL可分别提高对虾肝胰腺和肌肉HSP70基因的mRNA表达量.     

蝇蛆蛋白粉对凡纳滨对虾生长的影响

设计了4种实验饲料(ABCD)并进行了8周饲养试验来评定添加蝇蛆粉对凡纳滨对虾生长性能的影响.以实用饲料D作为对照组,ABC是在D的基础上,分别以5%,10%和15%的蝇蛆粉替代鱼粉.养殖试验结束后,分别计算体长、全长和背甲宽等生长性能.实验结果显示,AB组凡纳滨对虾的生长性能与对照组差异不显著(P>0.05).C组与对照组差异极显著(P<0.01).结果表明,饲料中添加适量的蝇蛆蛋白粉对凡纳滨对虾有一定的促生长作用,可用适量的蝇蛆蛋白粉替代对虾配合饲料中的部分鱼粉.     

水下LED 光照对凡纳滨对虾养殖水体环境因子和浮游植物群落变化的影响

为了研究水下LED 光照对凡纳滨对虾养殖环境的影响, 从2013 年5 月到12 月对架设水下LED 光源和未加光源的养殖池塘进行水质和浮游植物样品的分析。结果显示, 在有水下LED(LED 组)和未装光源(对照组)的养殖池塘内温度、碱度、pH、透明度、总悬浮物、溶解氧、硅酸盐和磷酸盐变化趋势均相似。养殖前期LED 组和对照组各项指标变化相似。在养殖中期LED 组的叶绿素a 含量高于对照组, 说明水下LED 有助于提高微藻生物量的积累。同时养殖中期LED 组的浮游植物群落的多样性指数和均匀度指数高于对照组, 说明水下LED 光照有助于提高浮游植物群落稳定性。而在养殖后期LED 组的硝酸盐和亚硝酸盐的含量低于对照组, 说明水下LED 光照有助于水质的稳定。养殖周期内LED 组和对照组优势种变化趋势体现为前期蓝藻-绿藻-硅藻, 中期蓝藻-绿藻(少量)和后期蓝藻-绿藻。     

凡纳滨对虾MT基因序列及其在卵巢发育和低温胁迫中的表达分析

在低温处理仔虾全长cDNA文库的筛选测序中, 获得凡纳滨对虾(Litopenaeus vannmei)金属硫蛋白基因全长cDNA序列, 该序列含有425个碱基, 包含177 bp开放阅读框, 上游98 bp的非编码区及下游150 bp 的非编码区, 编码58个氨基酸, 其中半胱氨酸含量丰富, 富含金属硫蛋白典型的Cys-X(1-3)-Cys 结构。多序列比对表明, 凡纳滨对虾MT蛋白序列与美洲螯龙虾(Homarus americanus)MT蛋白序列具最高同源性72.4%。Real-time PCR结果表明, 凡纳滨对虾MT基因在卵巢组织中呈优势表达, 在不同发育期的卵巢中的表达量都很高, 在低温处理凡纳滨对虾肝胰腺组织中上调表达。实验所得结果为研究凡纳滨对虾金属硫蛋白基因在生殖发育和低温应激中的功能提供了参考。       

凡纳滨对虾肠道红杆菌科细菌富集碳源筛选及其定向分离

【目的】红杆菌科(Rhodobacteraceae)细菌为凡纳滨对虾肠道微生物的优势类群,在健康对虾肠道中具有较高的相对丰度,是指示对虾健康的关键类群,探究对虾肠道红杆菌科细菌定向富集和分离方法,可为对虾养殖益生菌菌剂的研发提供基础。【方法】利用16S rRNA基因高通量测序技术研究不同碳源添加对凡纳滨对虾肠道中红杆菌科细菌的富集作用,筛选对红杆菌科细菌有显著富集作用的碳源;利用纯培养技术从红杆菌科细菌富集的样品中定向分离红杆菌科细菌,并对其进行鉴定和遗传多样性分析。【结果】添加短链脂肪酸(乙酸、丙酸、丁酸、戊酸)和碳酸氢钠对红杆菌科细菌有显著富集作用,主要富集到Cribrihabitans、Tritonibacter、Rhodovulum、Ruegeria、Sagittula和Thalassobius属相关菌株;对红杆菌科细菌相对丰度最高的样品进行稀释涂布培养,共分离纯化出303株细菌,分属于2门12科,其中红杆菌科细菌为主导类群共119株,主要包括Tritonibacter (90株)、Phaeobacter (25株)、Sulfitobacter (1株)、Ruegeria (1...     

循环水养殖系统中凡纳滨对虾肠道微生物对三种复合益生菌制剂的响应

【目的】在循环养殖系统中应用不同的复合益生菌制剂,探讨凡纳滨对虾肠道菌群结构特征及免疫水平发生的变化。【方法】30 d养殖周期结束后,通过平板计数法分析肠道细菌总数和弧菌总数;基于高通量测序技术分析肠道样品V3+V4区菌群特征;采用实时荧光定量PCR技术分析免疫相关因子TLR1和Dorsal基因表达水平,阐述益生菌制剂应用的意义。【结果】益生菌制剂的应用降低了凡纳滨对虾肠道中细菌总数,抑制弧菌的生长,间接预防疾病的发生。不同益生菌制剂从不同程度上优化了凡纳滨对虾肠道菌群结构,提高高质量序列和有效OTU数量,Chao1、Simpson、Shannon指数显示了丰富度和多样性变化,复合益生菌制剂3效果较好。同时,菌群结构得到优化,其中益生菌制剂1组对拟杆菌门含量百分比产生显著影响。Toll受体TLR1和Toll通路中的Dorsal基因m RNA表达受到益生菌制剂的影响,1、3组促进了TLR 1表达,1、2、3组都促进了Dorsal基因表达。【结论】在循环水养殖系统中添加益生菌制剂可优化凡纳滨对虾肠道菌群特征,提高免疫水平,为病害防控和健康养殖提供理论依据。     

凡纳滨对虾优势腐败菌鉴定及其群体感应现象

为了鉴定凡纳滨对虾的优势腐败菌并研究其是否存在以N-酰基高丝氨酸内酯类化合物(AHLs)介导的群体感应系统,采用16S rRNA序列鉴定凡纳滨对虾的优势腐败菌,并采用紫色杆菌CV026对优势腐败菌的AHLs活性进行检测.结果发现凡纳滨对虾优势腐败菌菌株1(Aci-1)和菌株2 (Aci-2)均为不动杆菌属,均存在以AHLs为信号分子的群体感应系统.添加外源信号分子AHLs能促进Aci-1菌株生物膜的形成,且呈浓度依赖性.在一定的贮藏范围内,凡纳滨对虾腐败菌信号分子AHLs浓度与细菌总数、挥发性盐基氮含量存在正相关性,其相关系数r分别为0.846 6和0.986 7,分别在P＜0.05与P＜0.01水平上显著,结论是凡纳滨对虾优势腐败菌不动杆菌菌株存在以AHLs介导的群体感应系统,且与凡纳滨对虾的腐败密切相关.     

凡纳滨对虾卵母细胞卵黄发生的超微结构

利用电镜研究凡纳滨对虾卵母细胞卵黄发生的全过程。结果表明 :凡纳滨对虾卵黄的发生是双源性的。卵黄发生早、中期是内源性卵黄大量合成的阶段 ,卵黄发生中、后期则以外源性卵黄的合成为主。内源性卵黄主要由内质网、线粒体、核糖体、溶酶体、高尔基器等多种胞器活跃参与形成。其中数量众多的囊泡状粗面内质网是形成内源性卵黄粒的最主要的细胞器 ;部分线粒体参与卵黄粒的合成并自身最终演变为卵黄粒 ;丰富的游离核糖体合成了大量致密的蛋白质颗粒并在卵质中直接聚集融合成无膜的卵黄粒 ;溶酶体通过吞噬、消化内含物来形成卵黄粒和脂滴 ,且方式多样 ;高尔基器不直接参与形成卵黄粒。外源性卵黄主要通过卵质膜的微吞饮活动从卵周隙或卵泡细胞中摄取外源物质来形成     

施用硫肥对几种作物与牧草产量和硫素含量的影响

为了研究不同作物的需S状况。对我国北方3种主要农作物(小麦、玉米、油菜)和牧草(苜蓿)进行了5个施硫水平(0、5、10、20和40mg·kg^-1)的盆栽试验．结果表明。增施一定量的硫肥可以提高作物生物量和产量．4种作物生物量增加5％～32％．小麦和油菜籽粒产量增加3％～20％．同时。增施硫肥可以使作物体内S素增加,但不同作物含硫量明显不同,油菜含硫量最高(0．479％～1．228％)。玉米含硫量最低(0．043％～0．091％)．同一作物不同部位含硫量不同。但同一作物不同部位含硫量呈显著的线性正相关．如油菜I、油菜Ⅱ和小麦植株与其种子含硫量的相关性都达极显著水平,R2值分别为0．399、0．654和0．547(n=15)．作物生物量、产量与施硫量相关性除苜蓿外．都达显著或极显著水平;作物生物量、产量与作物体内硫素含量除苜蓿外也显著或极显著相关;作物从土壤中吸收的S开始时随土壤的有效硫增加而增加,但达到一定程度时。随着有效硫的增加吸收的S略有下降．     

枯草芽孢杆菌WHNB02植酸酶的酶学性质研究

从118份样品中分离到1株产植酸酶的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis,WHNB02),其发酵液经乙醇沉淀、硫酸铵分级沉淀及Sephadex G-100柱层析等步骤后分离纯化了该酶,纯化倍数约为31.5倍,回收率为13.0%。该酶为单体酶,SDS-PAGE测得的分子量约为43ku,以植酸钠为底物的Km值为0.5mmol/L,酶反应的最适温度为60℃,80℃作用10min酶活保存61%,最适pH为7.0,在pH6.0~10.0范围内稳定,酶活性及稳定性都需Ca2 存在。EDTA、Mn2 、Ba2 (5mmol/L)对酶活具有很大的抑制作用。     

枯草芽孢杆菌微生态制剂制备及在仿刺参养殖中的应用

采用2%海藻酸钠为壁材,4%氯化钙作为固定化剂,将发酵后收集的枯草芽孢杆菌菌体制备成微生态制剂。将该枯草芽孢杆菌微生态制剂添加到仿刺参基础饲料中,对仿刺参进行喂养,观察其对仿刺参消化酶活性以及生长和仿刺参养殖水质的影响。试验组在基础饲料上添加5 mL的枯草芽孢杆菌微生态制剂,其投喂量为仿刺参体重的5%,并且换水周期为3 d。试验结果表明,添加枯草芽孢杆菌微生态制剂的试验组水质中亚硝酸盐、氨氮、化学需氧量均低于对照组。通过2个生长阶段的比较,试验组内仿刺参肠道内淀粉酶、蛋白酶和纤维素酶活性均高于对照组,尤其淀粉酶活力提高明显。通过对试验组和对照组中仿刺参的质量增加率和质量日增重量进行比较,在生长第1个阶段里两组数值差距不明显,但在生长第2个阶段里,两组数值差距逐渐增大,这说明微生态制荆对仿刺参生长的影响,随着时间逐渐增大。     

Bacillus subtilis WHNB02植酸酶phyC基因的克隆及序列分析

采用PCR法获得产植酸酶芽孢杆菌(Bacillus subtilis)WHNB02株植酸酶的全长phyc基因,并将其克隆到pUC18-T载体。序列分析表明该基因全长1152bp,编码一个383个氨基酸的多肽,信号肽切割位点位于第26个氨基酸残基之后。系统进化树表明,来源于7株芽孢杆菌的植酸酶在遗传上分为两大类。将Bacillus subtilis WHNB02植酸酶phyC基因序列及其氨基酸序列在GenBank中登录,登录号分别为AF220075和AA043434．1。     

Influence of Oral Administration of Bacillus subtilis on Growth Performance and Physiological Responses in Litopenaeus vannamei Cultured in Low Saline Waters

Probiotics and Antimicrobial Proteins - The present study examined the effect of Bacillus subtilis on growth performance, digestive enzyme activity, and immune response of juvenile white-leg shrimp...     

Isolation of bacilysin and a new amino acid from culture filtrates of Bacillus subtilis

1. Bacilysin, a labile dipeptide antibiotic that lyses growing staphylococci, was isolated from culture fluids of Bacillus subtilis by a process giving higher yields than those previously obtained. 2. The process involves adsorption on a cation-exchange resin and elution with aqueous trimethylamine, separation from neutral amino acids and glutamic acid by chromatography on DEAE-Sephadex at pH8.7 and separation from other neutral peptides by chromatography in aqueous propan-2-ol on Sephadex G-25. 3. A new amino acid, which is chemically related to bacilysin, was isolated from the fraction containing neutral amino acids. 4. Two substances that yield alanine on hydrolysis, in addition to bacilysin, were obtained from the neutral peptide fraction.     

Enhancement of immunity and disease resistance in the white shrimp,Litopenaeus vannamei,by the probiotic,Bacillus subtilis E20

Effects of Bacillus subtilis E20 isolated from fermented soybean on immune parameters and the disease resistance of the white shrimp (Litopenaeus vannamei) after 98 days of B. subtilis E20 feeding were evaluated in this study. Shrimp fed B. subtilis E20-containing diets at concentrations of 10⁶ (E206), 10⁷ (E207), and 10⁸ (E208) cfu kg^?1, respectively, had significantly increased survival rates of 13.3%, 16.7%, and 20%, compared to the control (fed no probiotic) after being challenged with Vibrio alginolyticus. There were no significant differences in the total hemocyte count, respiratory burst, or superoxide dismutase glutathione peroxidase among all treatments. Shrimp fed a higher concentration of the probiotic (E208) exhibited significant increases in phenoloxidase activity, phagocytic activity, and clearance efficiency compared to control shrimp. In addition, B. subtilis E20 showed a weaker inhibitory effect against the growth of Aeromona hydrophila with around a 0.3-cm inhibitory zone, but showed no inhibitory effects against other selected pathogens, such as white shrimp pathogens: V. alginolyticus and Vibrio vulnificus. These results suggest that the increased resistance of shrimp after B. subtilis E20 consumption occurs through immune modifications, such as increases in phenoloxidase activity, phagocytic activity, and clearance efficiency against V. alginolyticus.     

Isolation of laccase gene from Bacillus subtilis and analysis of its physicochemical properties

The present study reports the cloning and sequencing of lac2 from Bacillus subtilis. The gene is composed of 1542 bp and encodes a 514-amino acid protein. The gene has 86% homology with a published laccase with GeneID 936023. The lac2 gene was deposited in GenBank as a new nucleotide sequence. This new sequence was cloned into the multiple cloning site of pPIC9K to generate pPIC9K-lac2, which was then transformed into Pichia pastoris GS115 via electroporation. The recombinant GS115 (pPIC9K-lac2) was grown initially in BMGY medium and transferred to BMMY to induce gene expression for 48 h. The recombinant Lac2 protein shows laccase activity with α-naphthol and guaiacol as substrates. The optimal pH is between 3.2 and 4.7, and the optimal temperature is 25 °C for enzyme reaction.