氧化葡糖杆菌sndh-sdh基因簇的克隆表达

目的:从氧化葡糖杆菌H763中克隆sndh-sdh基因簇,在大肠杆菌和氧化葡糖杆菌621H中分别表达山梨酮脱氢酶-山梨糖脱氢酶(SNDH-SDH),并检测其活性。方法与结果:以氧化葡糖杆菌H763基因组DNA为模板,PCR扩增包括启动子、结构基因及终止序列在内的sndh-sdh基因簇,回收3533 bp的扩增产物,连入pMD18T载体,转化至大肠杆菌DH5α中表达;以山梨糖或木糖为底物,DCIP法检测菌体裂解液,DCIP检测液颜色由蓝绿色变为黄色,表明大肠杆菌表达产物具有脱氢酶活性。构建pBBR1MCS2-sndh-sdh载体,通过接合转移导入氧化葡糖杆菌621H,重组葡糖杆菌在以山梨醇或山梨糖为底物的培养基中培养,采用薄层层析检测法检测其培养上清中的代谢产物,层析板上显示了2-酮基-L-古龙酸斑点。结论:重组大肠杆菌DH5α和氧化葡糖杆菌621H中均表达了有脱氢酶活性的SNDH-SDH。     

酮古龙酸菌山梨醇脱氢酶的原核表达及活性检测

目的：克隆酮古龙酸菌Y25的山梨醇脱氢酶基因sldh,在大肠杆菌中进行表达并检测表达产物的活性。方法：以酮古龙酸菌Y25基因组DNA为模板,PCR扩增sldh基因,连接到表达载体pTIG,转入大肠杆菌BL21（DE3）,IPTG诱导表达;取表达菌体、菌体裂解上清和沉淀进行SDS-PAGE分析;以山梨醇为底物,通过活性电泳、体外转化及休止细胞转化进行sldh基因表达产物的活性检测。结果：扩增得到1740 bp的山梨醇脱氢酶基因,构建了表达质粒pTIG-sldh并在大肠杆菌中获得表达,SDS-PAGE结果显示表达产物为可溶性形式,相对分子质量约58×10^3;活性电泳结果说明表达产物在以山梨醇为底物时表现出脱氢酶活性,而经体外转化和休止细胞转化后薄层层析检测出转化产物山梨糖的存在。结论：在大肠杆菌中实现了酮古龙酸菌山梨醇脱氢酶的可溶性表达,且表达的重组脱氢酶能将山梨醇脱氢生成山梨糖。     

可产酸快生小菌的分离鉴定

目的：鉴定在实验过程中分离到的一株生长快速,并且可以将L-山梨糖转化为2-酮基-L-古龙酸的菌株。方法：将快生小菌传代,并进行产酸、抗菌谱、山梨糖脱氢酶活性等分析,通过PCR方法扩增并分析16S rDNA。结果：在传代过程中还分离得到了不产酸菌株;从快生小菌中扩增得到了普通酮古龙酸菌16S rDNA;从产酸菌中能够扩增得到包含酮古龙酸菌和乙酸钙不动杆菌的16S rDNA序列;在不产酸菌中只检测到乙酸钙不动杆菌的16S rDNA序列。结论：产酸的快生小菌可能是普通酮古龙酸菌和乙酸钙不动杆菌形成的融合细胞,这种融合细胞基因组表现为很不稳定,普通酮古龙酸菌基因组容易丢失,且丢失后也失去了产酸能力。     

酮古龙酸菌细胞色素c的表达、成熟及活性分析

目的:从酮古龙酸菌Y25中扩增细胞色素c基因,在大肠杆菌中表达、成熟并进行生物活性分析。方法:从酮古龙酸菌Y25基因组中PCR扩增细胞色素c基因,构建pET22b表达载体;从大肠杆菌BL21(DE3)中扩增细胞色素c成熟基因簇ccmABCDEFGH,连接到带有山梨糖脱氢酶组成型启动子的pBBR1MCS2-P200载体中;将构建的2个质粒共转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达后进行血红素染色检测;通过氧化还原光谱法对Ni柱亲和纯化的重组蛋白进行活性分析。结果:扩增得到1404 bp的细胞色素c基因及6481 bp的ccmABCDEFGH基因簇;重组菌株经IPTG诱导表达后行SDS-PAGE分析,可见相对分子质量为50×103的表达条带;血红素染色显示重组蛋白结合有血红素;经氧化还原光谱扫描,显示亲和层析纯化得到的目的蛋白有细胞色素c特征吸收峰。结论:从酮古龙酸菌Y25中扩增得到了细胞色素c基因,在大肠杆菌中进行了表达和成熟,表达蛋白具有细胞色素c生物活性。     

产L-乳酸的运动发酵单胞菌代谢工程菌株的构建

以运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)CP4基因组DNA为模板,采用PCR技术克隆得到其丙酮酸脱氢酶基因(pdc)同源下游p3片段,并连接到广谱宿主载体pBBR1MCS3-Ppdc-ldhL中构建了重组质粒pBBR1MCS3-Ppdc-ldhL-p3,将此重组质粒转化到受体菌Z.mobilis CP4中,分别以Ppdc和p3片段作为同源上游和下游片段,利用同源双交换重组技术将重组质粒中的ldhL基因置换了Z.mobilis染色体中的pdc基因,得到重组菌株Z.mobilis CP4(△pdc∷ldhL).测得重组菌株乳酸产量为10.8g/L,明显高于出发菌株,说明初步成功构建了产L-乳酸的运动发酵单胞菌代谢工程菌株.     

KL2型鲍曼不动杆菌噬菌体解聚酶克隆及抗菌活性分析

【背景】噬菌体解聚酶是噬菌体在裂解细菌过程中产生的一种抗菌蛋白,关于鲍曼不动杆菌荚膜分型及常见型别噬菌体解聚酶的研究报道较少。【目的】以KL2型鲍曼不动杆菌为研究对象,从噬菌体IME-AB2中克隆解聚酶,在大肠杆菌中进行可溶性表达并研究其体外抗菌活性。【方法】应用二代测序及生物信息学方法鉴定鲍曼不动杆菌荚膜型,分析IME-AB2全基因组。应用分子克隆技术克隆ORF76假定的尾丝蛋白(Putative Tail Fiber)基因,构建重组表达载体pEASY-Blunt-E1-gp76,在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,通过Ni-NTA亲和层析纯化解聚酶,研究解聚酶体外抗菌活性。【结果】构建了pEASY-Blunt-E1-gp76解聚酶重组表达质粒,该重组质粒在大肠杆菌中得到可溶性表达;体外活性分析显示,该重组蛋白在体外能够对所有的KL2型鲍曼不动杆菌具有较好的抗菌活性,解聚酶联合人和狗的血清具有很好的杀菌活性。【结论】鉴定解聚酶并提高其抗菌谱具有重要意义,也是噬菌体及解聚酶用于治疗耐药菌研究领域急需解决的重要问题之一。     

一种基于NanoLuc荧光素酶报告布鲁菌基因启动子活性质粒的构建及应用

[背景]布鲁菌病是由布鲁菌感染引起的一种人兽共患传染病,对畜牧业发展和人类健康有着巨大的威胁。利用新型报告基因NanoLuc荧光素酶构建一种可以检测布鲁菌基因启动子活性的质粒,对于研究布鲁菌毒力基因的调控表达具有重要意义。[目的]制备NanoLuc荧光素酶多克隆抗体,构建一种基于NanoLuc荧光素酶报告布鲁菌基因启动子活性的质粒,并通过测定bcsp31基因启动子和virB启动子活性验证该方法的可行性。[方法]构建NanoLuc荧光素酶原核表达载体pET-Nluc,纯化蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体;以广宿主质粒pBBR1MCS为骨架,构建质粒pNluc、pBcsp31-Nluc和pVirB-Nluc,通过电转化构建S2308(Nluc)、S2308(Bcsp31-Nluc)和S2308(VirB-Nluc)重组菌株,在体外培养条件下测定bcsp31基因启动子和virB启动子活性;比较分析virB启动子在胞内感染条件下和体外培养条件下的活性。[结果]通过原核表达获得NanoLuc荧光素酶重组蛋白,并制备得到效价高于1:100 000的多克隆抗体;成功构建pNluc、pBcsp31-Nluc和pVirB-Nluc质粒以及S2308(Nluc)、S2308(Bcsp31-Nluc)和S2308(VirB-Nluc)重组菌株;体外培养条件下测定bcsp31基因启动子和virB启动子活性,结果显示pNluc质粒可以精确报告其活性;测定virB启动子在胞内诱导条件下和体外培养条件下的活性,结果显示virB启动子活性在胞内感染条件下明显增强。[结论]构建了基于NanoLuc荧光素酶报告布鲁菌基因启动子活性的质粒,并验证其可以精确反映布鲁菌基因启动子活性,为研究布鲁菌毒力基因以及揭示其致病机制奠定了基础。     

利用转座系统在葡糖杆菌中表达山梨糖脱氢酶

目的：利用Mini—Tn5转座系统在葡糖杆菌中表达山梨糖脱氢酶（SDH）。方法：分离得到从山梨醇产糖的快生型小菌Y25K2,利用PCR方法扩增并分析快生型小菌的16SrDNA;构建pUT-mini—Tn5-Tet转座载体,将SDH基因（sdh）插入该载体,利用接合转移,将sdh整合至快生型小菌Y25K2的染色体,通过Western印迹检测SDH的表达。结果：16SrDNA鉴定结果初步表明快生型小菌为葡糖杆菌;构建得到pUT-mini—Tn5-Tet-sdh,将sdh整合至快生型菌Y25K2基因组,并检测到其在快生型小菌Y25K2中的表达。结论：利用Mini—Tn5转座系统在葡糖杆菌中表达了山梨糖脱氢酶。     

山梨醇脱氢酶的克隆、表达及活性检测

目的:从氧化葡糖杆菌H24中克隆山梨醇脱氢酶基因进行表达并检测其活性。方法:以氧化葡糖杆菌H24基因组DNA为模板,PCR扩增包括启动子、结构基因及其后的终止序列在内的山梨醇脱氢酶基因;将PCR产物插入pMD18T载体,转化大肠杆菌DH5α;通过活性电泳检测山梨醇脱氢酶在大肠杆菌中的表达及活性。结果:从氧化葡糖杆菌H24中扩增得到山梨醇脱氢酶基因并在大肠杆菌中实现表达,重组菌株经活性电泳检测具有醇糖转化活性。结论:原核表达的山梨醇脱氢酶具有很强的醇糖转化活性。     

山梨糖脱氢酶和氨甲酰化酶的融合表达

利用大肠杆菌-生黑醋杆菌穿梭载体pUG18构建了山梨糖脱氢酶基因sdh和氨甲酰化酶基因hyuC的融合表达质粒pUG18-SDH-HyuC.在JM109/pUG18-SDH-HyuC中检测到山梨糖脱氢酶(SDH)和氨甲酰化酶(HyuC)的酶活性,大量的SDH和HyuC不以融合蛋白形式存在.将质粒pUG18-SDH-HyuC电转化至生黑醋杆菌H24,检测到HyuC活性,但尚未检测到SDH酶活性.从生黑醋杆菌转化子中提取质粒,重新转化至JM109,又可同时检测到SDH和HyuC活性,传代实验和对质粒的鉴定结果也说明该质粒在H24中稳定存在.     

山梨糖脱氢酶在脱氮副球菌中的表达

目的:在脱氮副球菌PD1222中表达山梨糖脱氢酶(SDH)。方法:从质粒pMD-18T上复制氨苄西林抗性基因Ampr,从酮古龙酸菌中复制SDH基因sdh,先后酶切连接到pIND4质粒上,构建pIND4-Ampr-sdh穿梭质粒;再把pIND4-Ampr-sdh电转入大肠杆菌S17-1λpir作为供体菌,脱氮副球菌PD1222为受体菌进行双亲本接合转移;挑取壮观霉素和氨苄西林双抗平板上的接合子进行培养,菌液PCR复筛接合子,测序鉴定,通过DCIP法和非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳法检测阳性克隆的SDH活性。结果:构建的质粒pIND4-Ampr-sdh成功转入脱氮副球菌PD1222中,SDH获得表达并检测到其蛋白活性。结论:实现了SDH在脱氮副球菌中的表达,为在脱氮副球菌中研究SDH的下游电子传递链奠定了基础。     

Electroporation-mediated transformation of Aeromonas hydrophila

A strain of Aeromonas hydrophila producing copolyesters of 3-hydroxybutyrate and 3-hydroxyhexanoate, abbreviated as PHBHHx, was successfully transformed by electroporation. The plasmid used was a broad host range plasmid pBBR1MCS. Electroporation conditions were varied systemically to develop an electroporation protocol. The optimal yield of transformant was approximately 4x10(2) CFU/microg DNA at 12.5 kV/cm and 1000 Omega, resulting in a time constant of approximately 5 ms. The A. hydrophila transformants expressed plasmid-encoded resistance to chloromphenicol. Plasmid DNA in the A. hydrophila transformant was stably maintained. This is the first report of transformation of bacteria A. hydrophila.     

HIV-1 Vpu蛋白的原核表达、鉴定和纯化

目的：克隆、表达、纯化人免疫缺陷病毒Ⅰ型（HIV-1）Vpu蛋白,为其功能及免疫学研究奠定基础。方法：PCR扩增Vpu基因,纯化、酶切后克隆到原核表达载体pET32a中,转化大肠杆菌BL21（DE3）菌株获得表达工程菌株,IPTG诱导蛋白表达,免疫印迹鉴定目的蛋白,亲和层析纯化蛋白。结果：构建了HIV-1Vpu蛋白的原核表达载体Vpu-pET32a,并在大肠杆菌中高效表达,目的蛋白呈可溶性形式存在,免疫印迹检测显示为目的蛋白,经Ni—NTAAgarose纯化获得了高纯度的目的蛋白。结论：在原核表达系统中表达了可溶性HIV-1Vpu蛋白,为进一步进行HIV-1Vpu蛋白的免疫原性和功能研究奠定了基础。     

酮古龙酸菌醇醛脱氢酶基因的克隆及表达

目的：从酮古龙酸菌SCB329株中分离山梨糖生物氧化相关酶的基因并进行表达验证。方法：根据酮古龙酸菌SCB329株基因组序列设计引物,通过PCR从SCB329株基因组中扩增醇醛脱氢酶基因aadh;构建载体pBMP3-aadh并在大肠杆菌中表达,经活性染色、体外转化反应等方法考察表达产物的活性。结果：目的产物能够催化山梨糖、葡萄糖、果糖、木糖等多种含羟基及羰基化合物脱氢,并能将L-山梨糖直接转化为2-酮基-L-古龙酸。结论：从酮古龙酸菌SCB329株中分离到一种醇醛脱氢酶基因,可为该菌株糖酸转化机制的研究提供帮助。     

突触小体相关蛋白SNAP25的原核表达、纯化及鉴定

目的:克隆突触小体相关蛋白(SNAP25)基因,原核表达、纯化并鉴定SNAP25蛋白。方法:PCR扩增SNAP25基因,克隆至表达质粒pTIG-Trx,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,IPTG诱导表达,Ni2+-NTA亲和层析纯化目的蛋白,SDS-PAGE及Western印迹分析肉毒神经毒素BoNT/A轻链对该蛋白的裂解情况。结果:构建了pTIG-SNAP25表达质粒,经IPTG诱导表达,目的蛋白占全菌蛋白的26.2%,表达形式为可溶性表达,表达量达115.4mg/L,纯化后蛋白纯度达95%以上;经SDS-PAGE及Western印迹分析,SNAP25蛋白可被BoNT/A轻链特异降解。结论:克隆了SNAP25基因,在原核系统中表达、纯化并鉴定了重组SNAP25蛋白。     

Biotransformation of eugenol to ferulic acid by a recombinant strain of Ralstonia eutropha H16

The gene loci ehyAB, calA, and calB, encoding eugenol hydroxylase, coniferyl alcohol dehydrogenase, and coniferyl aldehyde dehydrogenase, respectively, which are involved in the first steps of eugenol catabolism in Pseudomonas sp. strain HR199, were amplified by PCR and combined to construct a catabolic gene cassette. This gene cassette was cloned in the newly designed broad-host-range vector pBBR1-JO2 (pBBR1-JO2ehyABcalAcalB) and transferred to Ralstonia eutropha H16. A recombinant strain of R. eutropha H16 harboring this plasmid expressed functionally active eugenol hydroxylase, coniferyl alcohol dehydrogenase, and coniferyl aldehyde dehydrogenase. Cells of R. eutropha H16(pBBR1-JO2ehyABcalAcalB) from the late-exponential growth phase were used as biocatalysts for the biotransformation of eugenol to ferulic acid. A maximum conversion rate of 2.9 mmol of eugenol per h per liter of culture was achieved with a yield of 93.8 mol% of ferulic acid from eugenol within 20 h, without further optimization.