三七鲨烯合酶基因在三七根、茎、芦头中的转录表达与三萜皂苷合成

三萜皂苷是三七、人参等重要药用植物的主要有效成分．采用改进的异硫氰酸胍法提取到三七RNA,经RT-PCR克隆技术获得三七三萜合成通路关键酶之一鲨烯合酶(squalene synthase, SS) cDNA,长1 270 bp,读码框架编码415个氨基酸．比对分析表明,推衍的三七SS氨基酸序列与人参、积雪草、青蒿、拟南芥和水稻SS的一致性分别为98%、89%、81%、78%和71%．利用实时荧光定量RT-PCR技术对三七根、茎、芦头的SS转录表达研究发现,一年生三七根SS基因转录表达量最高,高于茎和芦头的表达;但总皂苷含量是:芦头>叶>根>茎．可能与SS之后其它三萜合成关键酶的活性差异或/和三萜合成后的定向输送及累积有关．     

小麦淀粉合酶基因Ⅲ片段的克隆及反义和RNA干扰载体的构建

采用RT-PCR方法从小麦品种豫教2号的发育籽粒中克隆出淀粉合酶Ⅲ基因(starch synthase Ⅲ,SSⅢ)部分cDNA片段(509bp) (GenBank No.EF466009),同源性比较结果显示,它与GenBank 上已报道的SSⅢ基因有高度同源性.以pWM101质粒为基础,构建了由35S启动子调控的SSⅢ基因的反义表达载体pWM101SSⅢA;另外,还以pFGC5941质粒为基础,构建了SSⅢ基因的RNAi干扰载体pFGC5941SSⅢsa,这些载体的构建为研究此基因的功能打下了很好的基础.     

刺五加鲨烯合酶基因cDNA的克隆与序列分析

采用改良的异硫氰酸胍法提取刺五加总RNA,逆转录为cDNA,根据已报道的人参鲨烯合酶基因(squalene synthase gene,SS) cDNA序列设计引物,利用RT-PCR法克隆刺五加SS基因的cDNA序列.克隆得到长度为1258 bp的刺五加SS基因cDNA序列,开放阅读框全长1248 bp,编码415个氨基酸残基,GenBank登录号为HQ456918,与人参的SS1、SS2和SS3氨基酸序列一致性分别为91.73％、97.59％和96.63％.首次分离并报道了刺五加SS基因cDNA序列,为刺五加苷生物合成中关键酶的表达分析及调控机理研究提供参考.     

刺五加皂苷合成关键酶基因表达的半定量RT-PCR分析

根据已克隆的刺五加鲨烯合酶(squalene synthase,SS)、鲨烯环氧酶(squalene epoxidase,SE)和β-香树酯醇合成酶(β-amyrin synthase,bAS)基因序列信息设计引物,通过半定量RT-PCR分析了SS、SE和bAS基因在刺五加不同生长发育时期和不同器官中表达量的变化.结果表明,SS、SE和bAS基因在各生长发育时期和各器官中均有表达,但表达量差异显著(P<0.05),三者均在盛花期表达量最高,之后降低,进入果实成熟期后SS和bAS的表达量迅速回升,SE无显著变化.SS和bAS在叶片和根中的表达量较高,SE表达量的最大值出现在叶片和幼茎中.刺五加SS、SE和bAS基因的表达间存在显著的正相关关系(P<0.05).研究结果为进一步分析关键酶基因对刺五加三萜皂苷生物合成的影响奠定了基础.     

基于关键酶靶点基因研究内生青霉P116-1a提高刺五加皂苷含量的机制

为了探明刺五加鲨烯合酶(squalene synthase,SS)、鲨烯环氧酶(squalene epoxidase,SE)和β-香树酯醇合成酶(β-amyrin synthase,β-AS)基因家族各成员中靶点基因在内生青霉P116-1a提高皂苷含量的作用机制,我们利用Real time PCR法检测了回接P116-1a对刺五加SS、SE和β-AS基因家族各成员表达的影响;应用分光光度法测定总皂苷含量变化,并以SPPS17.0软件进行相关性分析。结果表明,回接菌株P116-1a后,SS1的表达量显著降低(p0.05),SS2呈先高后低的变化趋势。SE1的表达量显著提高(p0.05)。回接的早期,P116-1a显著抑制了SE2的表达(pAS20.05),之后回复正常。β-AS1呈现先高后低的变化趋势与SS1的变化趋势相似;β-基因的表达量显著提高(p0.05)。菌株P116-1a显著提高了刺五加的皂苷含量(p0.05)。SS2、SE1和β-AS2的表达量变化与刺五加的皂苷含量变化呈显著的正相关关系。我们初步判断,SS2、SE1和β-AS2是P116-1a提高刺五加皂苷含量的作用靶点基因。     

刺五加内生青霉鲨烯合酶基因的克隆与序列分析

【目的】克隆刺五加内生青霉Penicillium minioluteum P116-1a的鲨烯合酶(Squalene synthase,SS)基因。【方法】采用cDNA 5末端快速扩增(Rapid Amplification ofcDNA 5 Ends,5 RACE)技术扩增P.minioluteum P116-1a SS基因的全长cDNA序列和DNA序列;运用生物信息学方法对该基因进行分析,预测其编码蛋白的结构与功能;并通过RT-PCR法和SDS-PAGE法检测SS的表达情况。【结果】P.minioluteum P116-1a的SS基因含有4个外显子和3个内含子,开放阅读框长1 416 bp,编码471个氨基酸,预测蛋白含67.73%的α螺旋,5.31%的延伸链,2.97%的β折叠,23.99%的无规则卷曲,含有鲨烯合酶和八氢番茄红素合成酶的特异性识别区域,定位于内质网膜。与P.marneffei和Talaromyces stipitatus中SS蛋白的氨基酸同源性达90%以上。不同温度下SS的表达情况不同。【结论】首次在刺五加内生青霉P.minioluteum P116-1a中克隆到SS基因,为进一步研究P.minioluteum P116-1a提高刺五加皂苷含量的机制奠定基础。     

毛白杨蔗糖合酶基因PtSS2克隆与表达分析

为了解毛白杨蔗糖合酶(sucrose synthase,SS)基因功能和表达模式,以毛白杨茎段来源的cDNA为模板,根据毛果杨PtrSS2CDS序列信息设计特异引物,采用RT-PCR技术分离克隆了PtSS2基因。测序分析表明,PtSS2基因序列全长为2 412bp,编码803个氨基酸,蛋白大小为92.14kD,理论等电点6.00,属于酸性蛋白;氨基酸序列同源性分析表明,PtSS2与毛果杨PtrSS2和PtrSS1一致性分别高达100%和98.63%;结构域分析表明,PtSS2含有2个高度保守的功能域,即蔗糖合酶(5~552)和糖基化转移酶(554~744)功能域。qRT-PCR检测表明,PtSS2在毛白杨根、茎、叶、营养芽、雄雌花芽等各个组织中均有表达,但在营养芽和花芽中表达量较高,根部相对较低,总体呈组成型表达模式;在干旱胁迫下,PtSS2表达水平提升。研究结果推测,蔗糖合酶基因PtSS2在毛白杨各组织器官发育过程及干旱胁迫响应过程中具有重要功能。     

大豆异黄酮合酶基因的克隆及序列分析

目的:大豆异黄酮是多酚类混合物,有防治肿瘤发生,提高机体免疫力等多种保健功能。异黄酮合酶(isoflavone synthase,IFS)是合成异黄酮的关键酶。本文为了利用异黄酮的特有生物学功能,从大豆中克隆了该基因。方法:采用PCR扩增从大豆[Glycine max(Linn.)Merr.]总RNA中分离了异黄酮合酶基因,并将其克隆到pUCm-T载体并测序。结果:得到全长1583bp的片段。以期用于构建诱导表达基因敲除系统,并用于无性繁殖植物的无标记基因转化。结论:序列分析表明,异黄酮合酶基因(IFS1)含1583个核苷酸,与已报道的序列比较,核苷酸的同源性为92%。     

查尔酮合酶基因对转基因植物花色和育性的影响

查尔酮合酶 ( chalcone synthase,CHS)是花色素合成途径中的一个关键酶 ,它在植物中表达量的改变可能影响花的颜色。从矮牵牛 ( Petunia hybrida)特定发育阶段的花瓣的 c DNA中 ,克隆到查尔酮合酶基因 ,并正向插入到原核表达载体和含有花椰菜花叶病毒 Ca MV 35 S启动子的真核表达载体中 ,在原核中得到高效表达 ,并通过土壤农杆菌介导的方法转化矮牵牛。转基因植物的花色不但发生了明显的变异 ,其育性也受到了影响 ,不能产生正常花粉粒 ,成为雄性不育植株。 Northern杂交表明 ,转基因植物花瓣中 ,内源及外源查尔酮合酶基因转录均受到抑制     

缺血再灌注对小鼠肠神经丛nNOS 和iNOS表达的影响

目的观察缺血再灌注后小鼠回肠神经型一氧化氮合酶(neuron alnitric oxide synthase,nNOS)和诱导型一氧化氮合酶(induciblenitric oxide synthase,iNOS)的表达,探讨肠缺血再灌注损伤(ischemia-reperfusion injury,IRI)的发生机制。方法采用小鼠肠系膜上动脉缺血再灌注模型,根据不同再灌注时间对小鼠随机分1d组、3d组、5d组、7d组、对照组和假手术组,用SP法检测小鼠回肠nNOS和iNOS的表达情况。结果与对照组和假手术组相比较,nNOS在再灌注1d后开始在肌间神经丛持续高表达(P<0.01);而iNOS在再灌注3d后开始在肌间神经丛持续高表达(P<0.05)。结论nNOS和iNOS在肠缺血再灌注后的表达增强,提示一氧化氮及一氧化氮合酶与肠神经节细胞在缺血再灌注中的损伤有着密切关系。     

抗甲磺隆假单胞菌的分离及其乙酰乳酸合酶的大小亚基ilvIH基因的克隆和表达

乙酰乳酸合酶(也称乙酰羟酸合酶acetohydroxyacid synthase,AHAS)是植物、真菌和细菌细胞内支链氨基酸Val、Leu、Ile生物合成过程中关键酶,是乙酰乳酸合酶抑制剂类除草剂如磺酰脲类、咪唑啉酮类、嘧啶水杨酸和磺酰氨类的作用靶标.[目的]获得抗甲磺隆的乙酰乳酸合酶基因,构建其表达载体,并分析基因中的位点突变与乙酰乳酸合酶对磺酰脲类除草剂抗性产生原因.[方法]从长期使用甲磺隆的土壤中分离到l株抗甲磺隆的菌株Lm10,利用PCR技术从Lm10总DNA中克隆到乙酰乳酸合酶的大小亚基基因ilvIH,对ilvIH氨基酸序列进行比对分析.分别将ilvI和ilvH分别连接到表达载体pET29a( )多克隆位点,转化大肠杆菌(Escherichia coli)获得转化子BL21(pET-I)和BL21(pET-H),并诱导表达.[结果]菌株Lm10鉴定为假单孢菌(Pseudomonas sp.),对甲磺隆的最高耐受浓度达到14000 μmol/L,且对各种乙酰乳酸合酶抑制剂类除草剂具有交叉抗性.Lm10与甲磺隆敏感菌株KT2440的小亚基氨基酸序列完全相同,而大亚基有6个氨基酸位点发生变异.转化子在IPTG诱导下,乙酰乳酸合酶的大小亚基的蛋白成功表达,粗酶液酶活试验结果表明Lm10的ilvI基因表达的乙酰乳酸合酶大亚基对甲磺隆有很强的抗性.[结论]发现菌株Lm10的乙酰乳酸合酶大亚基对甲磺隆有很强的抗性,抗甲磺隆菌株Lm10与敏感菌株KT2440的ilvI有6个氨基酸位点差异,这些位点突变可能是乙酰乳酸合酶对甲磺隆抗性产生的原因.     

丹参SmGGPPS3基因的克隆及表达分析

香叶基香叶基焦磷酸合酶(Geranylgeranyl pyrophosphate synthase,GGPPS)是植物细胞二萜类物质合成的重要调节靶点。本研究从药用植物丹参中克隆了一条新的GGPPS基因(SmGGPPS3),基因全长2908 bp,包含一个931 bp的内含子和一个960 bp的编码序列。推测的氨基酸序列与蓖麻、橡胶、拟南芥等植物GGPPS一致性达到67%以上。实时定量PCR结果显示,SmGGPPS3基因在丹参不同发育时期不同器官中表达差异显著,同时受茉莉酸甲酯和病原菌的诱导。遗传互补实验也表明,SmGGPPS3编码蛋白具有GGPP合酶的活性。     

鲨烯合酶基因的密码子偏性分析

为了分析鲨烯合酶(squalene synthase, SS)基因密码子的使用方式及其影响因素,利用codon W和SPSS 16.0软件对47条来自不同物种的SS基因进行多元统计分析、对应性分析.SS基因密码子1~3位碱基的GC含量(GC1, GC2和GC3)依次为51.33%、34.65%和54.37%,3个位点的GC含量均呈极显著相关关系(p<0.01),对应性分析的结果表明,第1轴显示30.71%的差异,有效密码子数和GC3、GC1和GC2的均值与GC3之间的相关性均达极显著水平(p<0.01).筛选出的26个最优密码子的第3位碱基均为G或C.以MEGA 5.0构建的基于SS蛋白质序列的进化树比基于RSCU的聚类更符合传统的系统发育观点.SS基因密码子偏好以G/C结尾,使用模式受选择和突变影响,突变对密码子偏好影响较大.     

两种不同植物来源白藜芦醇生物合成关键酶——芪合酶催化效率比较

白藜芦醇是一种天然植保素,且具有特殊的药理和保健功能,芪合酶(Stilbene synthase,STS)是该化合物生物合成的关键酶和限速酶。白藜芦醇存在于有限几种植物且含量差异很大,虎杖中白藜芦醇含量比葡萄、花生高1 000倍以上,推测不同STS的催化能力有可能是白藜芦醇含量差异的原因之一。为验证上述推测,文中通过overlap PCR技术从葡萄叶片基因组DNA中克隆得到葡萄STS基因,连同前期工作中获得的虎杖STS基因(PcPKS5),进行了原核表达分析。诱导表达产物经过Ni2+亲和柱纯化和PD-10柱脱盐后,均得到分子量约43 kDa的可溶性纯化蛋白。酶促产物分析结果表明,两种酶催化产物均为白藜芦醇。酶动力学分析表明,虎杖STS催化效率(Kcat/Km)是葡萄STS的2.4倍。文中从植物类型Ⅲ聚酮化合物合酶(Polyketide synthase,PKS)超家族催化活性位点和保守位点角度分析了造成上述两种酶活性产生差异可能存在的原因。     

代谢工程酵母菌合成紫杉烯的研究

紫杉烯是紫杉醇生物合成的重要中间体,为在酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中建立一个生物合成紫杉烯的代谢途径,克隆了酵母的羟甲基戊二酰CoA(3-hydroxy-3-methylglutarylcoenzyme A,HMG-CoA)还原酶基因和=牛儿基=牛儿基二磷酸(geranylgeranyl diphosphate,GGDP)合酶基因,并构建了其融合表达载体pGBT9/HG;同时构建了包含紫杉烯合酶基因的表达载体pADH/TS;将这两个表达载体共转化酵母细胞,通过GC-MS分析检测工程酵母的代谢产物,结果表明获得的工程酵母能够合成紫杉烯,即在酵母细胞中建立了一个合成紫杉烯的代谢途径。     

eNOS基因在JAR细胞中的表达

本研究应用脂质体介导转染技术将人内皮型一氧化氮合酶 (eNOS)基因转入绒癌细胞系JAR细胞 ,获得转染阳性细胞。用RT PCR和Westernblot技术从基因及蛋白水平对表达产物进行鉴定 ,结果显示 :有较高水平的mRNA转录和特异目的蛋白表达 ;通过免疫细胞化学方法证实 ,转染eNOS基因的阳性JAR细胞与对照组相比 ,有外源eNOS蛋白高表达 ;但是一氧化氮合酶 (NOS)活性及其催化产物NO并没有直接升高 ;使用A2 3187处理则能增加NOS的活性 ,说明在转染的JAR细胞中 ,NOS没有被直接激活     

眼镜蛇毒对大鼠弓状核nNOS表达的影响

目的探讨眼镜蛇毒对大鼠弓状核神经元型一氧化氮合酶(neuronal nitric oxide synthase,nNOS)表达的影响。方法采用免疫组织化学方法分别显示眼镜蛇毒组、生理盐水组和正常对照组弓状核的nNOS表达。结果与生理盐水组和正常对照组相比,眼镜蛇毒组弓状核nNOS阳性神经元数量明显减少,细胞平均灰度值明显升高(P0.05)。结论眼镜蛇毒能够使大鼠弓状核nNOS表达降低。     

虎杖苯亚甲基丙酮合酶PcPKS2的表达纯化和晶体生长

植物类型Ⅲ聚酮合酶超家族(PKSs),又称查尔酮合酶(Chalcone synthase,CHS)超家族,催化合成多种植物次生代谢产物的分子骨架。苯亚甲基丙酮合酶(Benzalacetone synthase,BAS)催化4-香豆酰辅酶A与丙二酰辅酶A通过一步脱羧缩合反应生成苯亚甲基丙酮,是一系列具有重要生物学活性苯丁烷类化合物及其衍生物的前体化合物。前期工作从虎杖中分离出苯亚甲基丙酮合酶BAS(PcPKS2)和1个具有CHS和BAS活性的双功能酶(PcPKS1)。两者与超家族其他成员序列经比较,在包括门卫氨基酸Phe215和Phe265在内的重要氨基酸序列存在一定差异。已有蛋白晶体学研究结果表明,PKSs家族不同成员的功能多样性来自于酶催化位点的非常微小的构象变化。为了能够从结构上比较PcPKS2和Pc PKS1双功能酶活性差异可能产生的机制,以确定其高效BAS活性的分子机理,研究利用了大肠杆菌原核表达系统过量表达了C-端融合有His6标签的重组蛋白,经纯化得到了高纯度蛋白。经过对其晶体生长条件进行摸索和优化,得到了能用于X-射线衍射的单晶,为其结构解析、催化机理研究、了解虎杖聚酮类化合物生物合成机制和该类酶在基因工程中的应用提供了基础。     

芪合酶基因的分子生物学研究

植物中存在芪类次生代谢产物(stilbenes)作为一种重要的植保素,不仅能够使植物体本身的抗逆性提高,在人类健康医疗领域也有很好的应用前景.由于其合成途径具有专一性,需要芪合酶(Stilbene synthase,STS)的存在,近年来芪合酶基因工程日益引起人们的研究和重视.介绍了芪合酶基因的结构功能及其诱导表达的调控机理,并对其转基因工程的研究进展进行了综述,以期为进一步开展芪类次生代谢物在作物品质改良及人类健康营养中的应用提供参考.     

拟南芥纤维素合酶基因时空表达模式与功能预测

纤维素是细胞壁的主要组成成分, 研究纤维素合成可以从源头上解决关于高效降解纤维素的问题。该研究通过综合拟南芥(Arabidopsis thaliana)纤维素合酶基因(AtCESA)家族的进化和芯片表达分析及根据拟南芥全生育期GUS染色结果分析纤维素合酶基因的时空表达模式, 发现拟南芥纤维素合酶基因AtCESA1, 3, 6以及AtCESA4, 7, 8分别参与细胞壁初生壁和次生壁的合成并存在明显的共表达现象。其中, AtCESA1, 3, 6在全生育期表达, AtCESA4, 7, 8主要在根、茎和叶脉等次生壁细胞中表达。AtCESA5和AtCESA6、AtCESA2和AtCESA9以及AtCESA1和AtCESA10等基因对均有基因重复作用。根据AtCESA家族基因表达模式和分子演化关系可以推测, AtCESA5对AtCESA6以及AtCESA9对AtCESA2可能分别存在功能冗余。此外, AtCESA9的表达具明显的组织特异性。上述研究结果为深入认识拟南芥纤维素合酶基因的功能奠定了基础。