嗜热藻BP-1中几个蓝细菌光敏色素结构域体内重组及光化学性质研究

通过蛋白质序列同源性比对分析,在嗜热藻（Thermosynechococcus elongatus BP-1）里面找到了与已知的Pb/Pg型蓝细菌光敏色素TePixJ和TeTlr0924同源的3个基因tlr0911、tlr1215和tlr1999。通过分子克隆技术把它们的GAF结构域分别构建在pET30a（＋）表达载体上,与可生成藻蓝胆素（PCB）的质粒pACYCDuet-ho1-pcyA在大肠杆菌BL21（DE3）体内重组,生成重组蛋白,利用亲和层析柱分离纯化,纯化后的蛋白质经过锌荧光和蛋白质酸性尿素变性以及荧光光谱和吸收光谱等实验分析鉴定,结果表明,Tlr0911-GAF存在蓝光吸收态Pb406 nm和绿光吸收态Pg527 nm之间的可逆光转换,它可共价结合两种藻胆色素,即藻紫胆素（PVB）和藻蓝胆素（PCB）,Tlr1999-GAF则存在蓝光吸收态Pb417 nm和青光吸收态Pt496 nm之间的可逆光转换,它同样共价结合PVB和PCB,而Tlr1215-GAF1和Tlr1215-GAF2不能自发结合藻胆色素,不具有光活性。     

蓝细菌光敏色素Alr1966GAF2及其突变体的表达与光化学性质研究

采用PCR技术从鱼腥藻（Anabaena sp.PCC7120）中扩增蓝细菌光敏色素基因片段alr1966gaf2,将alr1966gaf2插入到pET-30a（+）载体中,构建表达质粒pET-alr1966gaf2。最后将Alr1966GAF2与HO1、PcyA在E.coli BL21（DE3）中共表达获得色素蛋白Alr1966GAF2,并对该蛋白的光化学性质进行分析。结果显示,色素蛋白Alr1966GAF2结合色素为藻蓝胆素（phycoerythrobilin,PCB）或藻紫胆素（phycoviolobilin,PVB）,在3种不同吸收态15Z-P_{428 nm}、中间态和15E-P_{514 nm}之间具有顺序可逆光效应。通过定点突变技术将DXCF基序中的保守性Cys突变为Ala,获得了突变体Alr1966GAF2（C72A）。将Alr1966GAF2（C72A）与HO1、PcyA共表达,获得色素蛋白Alr1966GAF2（C72A）。研究结果表明Alr1966GAF2（C72A）结合色素为PCB,Alr1966GAF2（C72A）-PCB具有较强的荧光活性,其荧光量子的产率高达0.11。Alr1966GAF2（C72A）不仅能够共价结合PCB,还可以结合胆绿素（Biliverdin,BV）,均具有较强的红色荧光活性。     

鱼腥藻PCC7120细菌光敏色素缺失突变体的自催化重组研究

采用聚合酶链式反应（PCR）从鱼腥藻PCC7120 DNA中扩增出细菌光敏色素缺失突变体基因aphA（26-320）、aphA（27-320）、aphA（28-320）、aphA（29-320）和aphA（32-320）。利用表达载体pET30a进行高效表达,获得的AphA缺失突变体脱辅基蛋白在一定的反应体系下与藻蓝胆素进行了体外重组的研究。研究表明：AphA（26-320）体外重组获得的色素蛋白具有与植物光敏色素相似的可逆光致变色效应,同时酸性尿素变性实验和Zn^2＋荧光电泳实验显示藻蓝胆素和以上蛋白质发生共价连接。AphA（26-320）与藻蓝胆素重组产物的Pr／Pfr吸收峰处于660／610nm。其他4个缺失突变体,AphA（27-320）、AphA（28-320）、AphA（29-320）、AphA（32-320）和藻蓝胆素的重组产物中则没有发现可逆光致变色信号,表明这些缺失突变体不能和藻蓝胆素发生自催化重组。维系细菌光敏色素AphA与色素自催化连接的裂合酶结构域位于AphA（26-320）包含的肽链之中。     

谷子光敏色素基因光周期、非生物胁迫响应特性及关键自然变异位点鉴定北大核心CSCD

比较分析光敏色素基因家族成员对光周期、非生物胁迫响应模式并鉴定其有利自然变异类型,为全面了解光敏色素基因家族在光周期调控谷子生长发育及应对非生物胁迫中的作用机制、开展关键性状的分子辅助选择奠定基础。文中利用RT-PCR技术从超晚熟谷子农家种‘毛粟’中克隆了3个光敏色素基因SiPHYA、SiPHYB和SiPHYC;在进行生物信息学分析后,利用荧光定量PCR技术研究了3个基因的光周期调控模式及对聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)模拟干旱、自然干旱、脱落酸(abscisic acid,ABA)、高温、Na Cl五种非生物胁迫的响应特性;最后检测这3个基因在160份谷子材料的突变位点,通过单倍型分析确定基因的功能效应。结果表明,获得了基因SiPHYA、SiPHYB和SiPHYC包含完整编码区的c DNA序列,长度分别为3 981、3 953、3 764 bp,其中基因SiPHYB和SiPHYC具有较近的进化关系。基因SiPHYA、SiPHYB和SiPHYC均受光周期调控,但光周期对SiPHYB、SiPHYC昼夜表达模式的影响要强于SiPHYA;短日照条件临近抽穗SiPHYA、SiPHYB表达水平显著低于长日照,暗示其在谷子长日照抑制抽穗中发挥作用。SiPHYB和SiPHYC共同响应PEG模拟干旱、自然干旱、ABA、高温4种胁迫;SiPHYA和SiPHYB以不同方式响应盐胁迫,SiPHYC没有参与谷子盐胁迫响应过程。基于160份谷子材料重测序数据发现基因SiPHYB高度保守,基因SiPHYA含有两个错义突变:单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP) 7 034 522;,SNP7 036 657;,导致延迟抽穗、增加株高。基因SiPHYC含有一个错义突变(SNP5 414 823;),导致短日照缩短抽穗期,长日照延长抽穗期,对株高、穗长的增加作用不受光温环境影响。光周期对基因SiPHYA、SiPHYB和SiPHYC具有不同的调控作用,除了盐胁迫,SiPHYB和SiPHYC共同响应多种非生物胁迫,相比参考基因型,SiPHYA、SiPHYC突变延迟抽穗、增加株高和穗长。