CAD、ICAD分子生物学基础及作用机制研究

近年来，人们在研究凋亡中与染色体切割有关的分子时，发现了两种新的蛋白质分子；一种是能被Cas-pase3特异性激活的DNA酶-CAD，另一种是其抑制物，也是其伴侣蛋白-ICAD。本文介绍了CAD及ICAD的分子生物学特性极其在细胞凋亡中的作用机制。     

脱氧核糖核酸内切酶与细胞凋亡

哺乳动物细胞广泛存在细胞凋亡。脱氧核糖核酸内切酶(DNase)在细胞凋亡中发挥重要作用,染色质DNA降解、浓缩及细胞核结构的破坏都与DNase有关。目前已发现多种DNase参与不同类型细胞的凋亡。本重点对DNaseⅠ、DNaseⅡ、NUC18、NUC70、AN34、DFF(DFF40/DFF45)等内源性DNase与哺乳动物细胞凋亡的关系作系统的归纳和分析。     

DFF和CIDE介导细胞凋亡的分子机制

DNA裂解因子（DFF）是由分子量分别为45kD和40kD两个亚单位组成的异源二聚体。在细胞凋亡信号启动的caspase级联活化过程中作为下游caspase的底物被活化并形成脱氧核糖核酸酶（DNase)。从而介导并调节DNA断裂和染色质凝聚,DFF作为细胞凋亡信号传递的主要途径在细胞凋亡中起着关键作用。诱导细胞死亡的DFF45样效应因子（CIDE）是与DFF同源的诱导凋亡因子,CIDE与DFF在结构,功能和作用上有很大的相似性,可发挥诱导凋亡的作用。本阐述了DFF和CIDE在诱导细胞凋亡过程中担当的角色和它们相互作用的机制。从而揭示DFF和CIDE在细胞凋亡过程中作为传递凋亡信号-caspase级联反应的下游因子在诱导凋亡时所处的关键地位和重要功能。     

参与细胞凋亡的核酸酶

细胞凋亡是机体内一种重要而且保守的细胞去除机制。染色质的降解是凋亡的重要标志之一,它需要核酸酶的参与。到目前为止,参与凋亡的核酸内切酶可以分为三类:DNaseⅠ家族,DNaseⅡ家族,CAD。不同的细胞在凋亡的时候会激活不同的核酸酶,相同的细胞在不同的诱导方式下也会激活不同的核酸酶,因此,凋亡过程中,那些核酸酶的激活是由细胞种类和诱导方式等特异性所决定的。     

核酸内切酶在细胞凋亡中的作用

核酸内切酶在形成细胞凋亡的典型特征——DNA片段化中,发挥着直接的重要作用.介绍了已知的参与细胞凋亡的二价金属离子依赖性和非依赖性核酸内切酶种类,其中二价金属离子依赖性主要有nuc18、DNaseⅠ、Ca^2＋/Mg^2＋核酸内切酶、Ca^2＋/Mn^2＋核酸内切酶、DNaseγ、nuc58和nuc40;二价金属离子非依赖型主要有DNaseⅡ及类似核酸内切酶.此外,还初步探讨了核酸内切酶降解染色质DNA的过程及其作用机制.     

Sindbis病毒的繁殖与宿主细胞BHK—21的凋亡

详细报道了Sindbis病毒诱导BHK-21细胞凋亡的过程,病毒感染6h后即可观测到核染色质的断裂,病毒感染12h后染色质可见明显的凝集,感染后24h DNA电泳出现明显的DNA“阶梯”(DNA ladder)。电镜观察更清楚地显示了凋亡小体形成的某些细节:在染色质凝集处核外膜突起,最后与细胞核分离形成凋亡小体。在此基础上将一段病毒非结构蛋白nsP2基因克隆到真核表达载体pMAMneo中,并得到瞬间表达,在其中一些细胞中出现DNA断裂这一细胞凋亡的基本特征,通过对nsP2氨基酸序列的分析,结合以前的实验结果推测nsP2可能与诱导细胞凋亡直接相关。     

微波辐射的细胞生物效应及其在肿瘤治疗中的作用

近年来,人们利用现代细胞生物学技术,对微波辐射的生物学作用和机制做了深入的研究。发现经微波照射后的细胞,在细胞、亚细胞及分子水平上产生一系列的变化,导致细胞形态发生改变;细胞膜通透性增加;酶活性下降;分裂指数减少;DNA合成受抑制以及染色体断裂等。在肿瘤治疗中,利用微波加热可选择性地杀伤癌细胞,与化疗和放疗联合应用可提高其治疗效果。     

妊娠兔胎盘细胞凋亡及凋亡相关基因Bcl-2和Bax表达的动态变化

以新西兰雌兔为动物模型,研究妊娠期间胎盘细胞凋亡及其凋亡调控蛋白Bcl-2和Bax表达的动态变化.基因组DNA凝胶电泳实验检测到妊娠中期和晚期胎盘基因组DNA中出现典型的凋亡特征——DNA梯带,而且DNA断裂值在妊娠早、中、晚期分别为：0.14、0.49和1.43,与妊娠早期相比,妊娠中、晚期胎盘基因组DNA断裂值有显著性增加.TUNEL实验和活化caspase-3的免疫定位实验表明,在妊娠早期胎盘中存在细胞凋亡,而且在各妊娠期中细胞凋亡主要发生于合体滋养层.免疫印迹法分析表明,Bcl-2和Bax随妊娠的进行其表达量明显增加,Bax∶Bcl-2比值在妊娠早、中、晚期分别为：0.89,0.91和1.25,呈增加趋势.实验结果说明,在兔正常妊娠中,胎盘合体滋养层细胞发生凋亡,且随妊娠的进行,凋亡细胞数量增多,胎盘细胞凋亡主要与细胞中Bax∶Bcl-2的比例相关.     

妊娠兔胎盘细胞凋亡及凋亡相关基因Bcl-2和Bax表达的动态变化

以新西兰雌兔为动物模型。研究妊娠期间胎盘细胞凋亡及其凋亡调控蛋白Bcl-2和Bax表达的动态变化,基因组DNA凝胶电泳实验检测到妊娠中期和晚期胎盘基因组DNA中出现典型的凋亡特征-DNA梯带,而且DNA断裂值在妊娠早、中、晚期分别为：0.14,0.49和1.43,与妊娠早期相比,妊娠中,晚期胎盘基因组DNA断裂值有显著性增加,TUNEL实验和活化caspase-3的免疫定位实验表明,在妊娠早期胎盘中存在细胞凋亡,而且在各妊娠期中细胞凋亡主要发生于合体滋养层,免疫印迹法分析表明,Bcl-2和Bax随妊娠的进行其表达量明显增加,Bax:Bcl-2比值在妊娠早、中、晚期分别为：0.89,0.91和1.25,呈增加趋势,实验结果说明,在兔正常妊娠中,胎盘合体滋养层细胞发生凋亡,且随妊娠的进行,凋亡细胞数量增多,胎盘细胞凋亡主要与细胞中Bax:Bcl-2的比例相关。     

妊娠兔胎盘细胞凋亡及凋亡相关基因 Bcl-2和Bax表达的动态变化

以新西兰雌兔为动物模型,研究妊娠期间胎盘细胞凋亡及其凋亡调控蛋白Bcl-2和Bax表达的动态变化.基因组DNA凝胶电泳实验检测到妊娠中期和晚期胎盘基因组DNA中出现典型的凋亡特征--DNA梯带,而且DNA断裂值在妊娠早、中、晚期分别为:0.14、0.49和1.43,与妊娠早期相比,妊娠中、晚期胎盘基因组DNA断裂值有显著性增加.TUNEL实验和活化caspase-3的免疫定位实验表明,在妊娠早期胎盘中存在细胞凋亡,而且在各妊娠期中细胞凋亡主要发生于合体滋养层.免疫印迹法分析表明,Bcl-2和Bax随妊娠的进行其表达量明显增加,Bax∶Bcl-2比值在妊娠早、中、晚期分别为:0.89,0.91和1.25,呈增加趋势.实验结果说明,在兔正常妊娠中,胎盘合体滋养层细胞发生凋亡,且随妊娠的进行,凋亡细胞数量增多,胎盘细胞凋亡主要与细胞中Bax∶Bcl-2的比例相关.     

DNA双链断裂检测技术研究进展

细胞DNA的完整性受到不同因素的影响,可分为内源性及外源性因素,这些因素均可引起不同程度的DNA损伤。其中,DNA双链断裂是最严重的一种DNA损伤,若未能进行及时的修复,则会引起一系列的损伤反应。严重的DNA双链断裂甚至可以造成细胞凋亡、肿瘤的发生等严重后果。因此,快速并准确地检测细胞DNA双链断裂程度能帮助评估DNA的完整性、内外环境的遗传毒性效应、临床诊断和放化疗监测。DNA双链断裂检测技术近年来发展迅速,目前可基于物理或化学方法、免疫荧光法和高通量测序技术检测DNA双链断裂程度。对这些检测方法的最新研究进展、应用以及其优缺点进行介绍,旨在为后续DNA双链断裂程度检测的研究和临床提供参考。     

DNA双链断裂检测技术研究进展 *

细胞DNA的完整性受到不同因素的影响,可分为内源性及外源性因素,这些因素均可引起不同程度的DNA损伤。其中,DNA双链断裂是最严重的一种DNA损伤,若未能进行及时的修复,则会引起一系列的损伤反应。严重的DNA双链断裂甚至可以造成细胞凋亡、肿瘤的发生等严重后果。因此,快速并准确地检测细胞DNA双链断裂程度能帮助评估DNA的完整性、内外环境的遗传毒性效应、临床诊断和放化疗监测。DNA双链断裂检测技术近年来发展迅速,目前可基于物理或化学方法、免疫荧光法和高通量测序技术检测DNA双链断裂程度。对这些检测方法的最新研究进展、应用以及其优缺点进行介绍,旨在为后续DNA双链断裂程度检测的研究和临床提供参考。     

慢性髓性白血病K-562细胞的凋亡耐受

慢性髓性白血病（CML）K－562细胞株对与类别无关的多种凋亡诱导剂具有耐受性,表现为凋亡潜伏期延长,caspases激活延迟及其活性谱和亚细胞分布改变,电泳不易显示典型、清晰的DNA梯形条带。K－562细胞凋亡耐受机制复杂,Bcr-Abl上调ERK／MAPK通路,经尚未阐明的中间环节,抑制凋亡诱导剂引起的线粒体释放反应,导致caspase-3激活延迟,是其可能的机制。目前研究中的克服K－562细胞凋亡耐受、治疗CML的策略包括特异性酪氨酸激酶抑制剂等。     

荧光假单胞菌鞭毛蛋白对黑松细胞的致死作用

采用细胞免疫荧光分析、细胞染色观察、电导率测定以及基因组DNA电泳分析技术,研究了松材线虫携带的荧光假单胞菌分泌的鞭毛蛋白对黑松愈伤组织细胞的作用及其致死方式。结果表明,鞭毛蛋白与黑松细胞之间存在直接的相互作用;鞭毛蛋白处理的细胞,细胞膜皱缩变形、细胞质浓缩、细胞核解体,形成若干小核,细胞质中的RNA降解;处理细胞的着色力增强,细胞培养液的电导率增加,说明鞭毛蛋白可增加处理细胞的细胞膜透性;基因组DNA的电泳分析证实,处理细胞的DNA发生了断裂,但无明显的梯子形成,推测鞭毛蛋白对黑松细胞的致死方式为非典型的细胞凋亡。     

木质部细胞分化的程序

本文主要对近十几年来有关木质部细胞分化研究中使用的实验系统及用这些系统所取得的重要进展作了评述.并以作者实验室的研究成果为基础,结合国内外研究进展,提出木质部细胞分化程序由参与细胞编程死亡(PCD)和次生壁构建的全部基因综合编制而成.以PCD过程各阶段的划分标准来看,木质部细胞分化中从IAA诱导形成层细胞平周分裂到细胞扩大前为PCD的起始阶段,其间包括死亡信号的发生、接受和传导,以及启始caspase(半胱氨酰基天门冬氨酸蛋白酶)类似物(例如caspase-8类似物)的活化;木质部母细胞的径向扩大为PCD的效应阶段,而效应caspase类似物(例如caspase-3类似物)活化DNase、DNA的片段化及次生细胞壁的构建和各种细胞器的解体则为PCD的清除降解阶段.至今还无法将DNase活化及其引起的DNA断裂过程与次生细胞壁构建过程分开.     

杆状病毒反式激活蛋白IE-1诱导昆虫细胞凋亡及几种抑制剂对AcNPV诱导细胞凋亡的影响

为了探讨杆状病毒诱导细胞凋亡的机制,用含AcNPV-ie-1基因的重组质粒pGAM-ie-1转染斜纹夜蛾细胞SL－1和粉纹夜蛾细胞Tn-5B1。转染后24h通过光镜观察、DAPI荧光染料染色、DNA琼脂糖凝胶电泳等发现,SL－1发生了典型的凋亡,而同样的现象并没有在Tn-5B1细胞中出现。利用放线菌酮（cycloheximide,CHX)、莫能菌素（Monensin)及蚜栖菌素（aphidicolin)处理AcNPV感染的SL－1细胞,发现细胞凋亡被莫能菌素及蚜栖菌素抑制,被放线菌酮推迟。此结果为进一步研究杆状病毒诱导昆虫细胞凋亡的机制等奠定了基础。     

沙吸附DNA的分布及转化活性

尽管自然环境中存在着大量的DNase,大分子体外DNA在土等生态环境中存在并保持转化活性。实验表明DNA被沙土吸附之后会被沙土保护而产生对DNase的抗性。然而对沙中DNA的检测多是通过PCR或者探针杂交的方法来进行,采用转化方法进行来检测的却鲜有报道。为了研究DNA释放进沙之后的分布及转化活性,建立了流过式微型离心沙柱。将20μLpUC18置于1.0g直径介于1.2~2.5mm之间的沙中,1.5mL0.1mol/LCaCl2洗脱之后再用200μLTEN缓冲液提取。结果表明吸附于沙中的DNA经提取后仍然具有生物转化活性,并且与洗脱液、提取液具有不同的转化活性和对DNase抗性,说明DNA与沙粒的结合不只是一种简单的附着,而是3种复杂的复合体结构。相对于没有沙保护而只能在室温下保留7d转化活性的DNA,在被沙吸附保护之后的DNA可以保存转化活性达35d以上。研究结果还表明在存在感受态细胞的情况下,生物释放出来的DNA并非直接与沙粒结合,而是优先与感受态细胞结合。推测认为沙吸附DNA的转化活性同DNA的构象及同感受态细胞接触的机会相关,而与DNA的浓度不直接相关。这些结果为研究环境中存在的DNA库及其与混居的微生物间的相互作用,水平基因转移及其生态效应提供了有价值的信息。     

辐射诱导细胞凋亡中胱冬肽酶—3基因的活性

先前的研究发现胱科肽酶－３基因参与辐射诱发Ｕ９３７细胞凋亡,在此基础上,进一步分析了辐射诱发细胞凋亡进程中胱冬肽酶－３活性变化及其激活方式。结果发现：随着一时间的眨续,胱冬肽酶－３酶切活性逐步增高,于照后６ｈ达到最高。但ＲＮＡ印迹显示：照射鲺未照射细胞相比,胱冬肽酶－３ｍＲＮＡ水平并无改变。而免疫印迹发现：随着凋亡的进展,胱冬肽酶－３活性酶的亚基Ｐ２０的产生愈来愈多,并且从照后３ｈ起,凋亡细胞中还     

对二甲苯对皱纹盘鲍肝胰腺细胞DNA的损伤

为研究对二甲苯对皱纹盘鲍肝胰腺的毒性作用,设置4个浓度(0.5、1.0、1.5和2.0 mg·L^-1)和对照组,开展为期21 d的对二甲苯对皱纹盘鲍的亚慢性毒性试验,采用彗星试验技术进行皱纹盘鲍肝胰腺细胞DNA损伤分析,采用CASP分析软件对拖尾率、彗星尾长、彗尾DNA相对含量、Olive矩等损伤指标进行统计。结果表明: 与对照组相比,各染毒组皱纹盘鲍肝胰腺细胞DNA均受到损伤,且损伤程度存在显著性差异。随着染毒浓度的增加,肝胰腺细胞DNA受损程度加重,高浓度甚至可以引发细胞凋亡,呈现一定的剂量-损伤效应。中浓度对二甲苯短时间暴露即可对皱纹盘鲍肝胰腺细胞造成DNA损伤,随着暴露时间延长,细胞DNA受损程度加重,呈现一定的时间-损伤效应。但长时间暴露细胞DNA各损伤指标有所减小,这可能与细胞自身的DNA修复机制和生物体解毒系统的代谢机制有关。研究表明,对二甲苯可对皱纹盘鲍肝胰腺细胞产生氧化损伤,导致DNA断裂,高浓度的对二甲苯长时间暴露可导致其细胞凋亡。     

阿尔采未病神经元凋亡发生机制的研究及四氢小檗碱的抗凋亡作用

本研究用免疫组织化学、细胞增减和膜片钳技术研究阿尔采未病（ＡＤ）脑中的细胞凋亡,以及β－淀粉样肽（β－ＡＰ）诱导离体增减海马神经元的凋亡及其离子机制。结果表明ＡＤ脑内存在细胞凋亡,β－ＡＰ可以通过抑制神经元的电压依赖性Ｋ^ 和Ｎａ^ 通道促进神经元凋亡,一氧化氮与其有一定的协同作用。同时四氢水檗碱可通过降低细胞内Ｃａ^2 而 减轻β－ＡＰ引起的神经元凋亡。