酿酒酵母HAL1基因的克隆及植物表达载体的构建

HAL1基因是酵母中重要的耐盐基因。以酿酒酵母AS2.375菌株的DNA为模板,根据已发表的序列设计引物,经PCR扩增得到约900 bp的HAL1基因片段,连接到pMD18-T载体上,转化大肠杆菌JM109,筛选重组质粒进行酶切分析和序列测定,结果显示已克隆到完整的可读框,该基因的序列与已知序列同源性达99%。将HAL1基因从T-载体上切下连接到pAM194载体上构建了HAL 1基因的植物表达载体,用于烟草的转化获得了耐盐性提高的转化植株。     

大豆fad基因反义表达载体构建及转化烟草研究

使用PCR方法从大豆基因组DNA中扩增出大豆油酸脱饱和酶基因fad2-1,连接到pMD18-T载体中,转化大肠杆菌JM109菌株.测序后,用DNAstar软件进行同源性比对.然后将正确的序列反向克隆到表达载体pBt,并转化农杆菌菌株LBA4404,经双酶切鉴定和PCR扩增检测,获得具有该基因反向序列的农杆菌工程菌,转化...     

铜绿假单胞菌VIM-2型金属β-内酰胺酶基因的克隆及原核表达重组质粒的构建

目的扩增铜绿假单胞菌VIM-2型金属β-内酰胺酶基因,导入载体pMD18-T和pGEX-4T-1构建重组质粒pMD18-T／VIM-2和pGEX-4T-1／VIM-2。方法采用PCR技术从铜绿假单胞菌扩增VIM-2基因,先将其亚克隆人pMO18-T载体后测定核苷酸序列。再将VIM-2基因克隆至表达载体pGEX-4T-1,并转化大肠埃希菌JM109。用限制性酶切分析、PCR、序列分析等进行重组质粒鉴定。结果扩增出801bp的VIM-2基因,构建重组质粒pMD18-T／VIM-2和pGEX-4T-1／VIM-2。结论成功扩增801bp的VIM-2基因,该基因与国外同类酶的核苷酸同源性100％。重组质粒pGEX-4T-1／VIM-2构建成功。     

大肠杆菌ubiC基因的克隆及序列分析

研究以克隆得到正确序列的大肠杆菌ubiC基因目的,实验通过PCR方法从大肠杆菌基因组中扩增得到了ubiC基因,扩增产物克隆到pUC118载体,转化大肠杆菌JM109,DNA序列分析结果表明克隆得到的大肠杆菌ubiC基因碱基序列正确。     

甘蓝型油菜γ-TMT基因的克隆及其植物表达载体的构建

应用聚合酶链式反应技术(PCR)扩增了甘蓝型油菜γ-TMT基因,并将其克隆到pMD18-T vector载体上,对重组子进行PCR检测和限制性内切酶分析,并测定了DNA全序列.结果表明,克隆片段全长为1 044 bp.将甘蓝型油菜γ-TMT基因定向克隆到植物表达载体pCambia1300的35S启动子下游,构建了该基因的植物超表达载体.     

CglI基因在大肠杆菌中的功能活性分析

通过PCR技术从谷氨酸棒杆菌基因组中扩增CglI基因,克隆到载体pMD18-T Simple后测序。将CglI基因亚克隆到表达载体pJL23,构建重组质粒pJL23-CglI,转化大肠杆菌HB101菌株,通过PCR反应筛选鉴定阳性克隆。通过噬菌体感染实验,初步分析了CglI基因在大肠杆菌中的功能活性。     

酒类酒球菌苹果酸-乳酸酶基因的克隆

利用PCR方法从酒类酒球菌(Oenococcus oeni)基因组中扩增出651 bp的DNA片段,将之克隆到pUC19-T载体上并转化大肠杆菌(E.coli)JM109菌株.重组质粒的测序结果表明,克隆到了苹果酸-乳酸酶基因(mle),它含有527 bp的阅读框架,其核苷酸序列与文献报道相同.     

CglI基因在大肠杆菌中的功能活性分析

通过PCR技术从谷氨酸棒杆菌基因组中扩增CglⅠ基因,克隆到载体pMD18-T Simple后测序.将CglⅠ基因亚克隆到表达载体pJL23,构建重组质粒pJL23-GglⅠ,转化大肠杆菌HB101菌株,通过PCR反应筛选鉴定阳性克隆.通过噬菌体感染实验,初步分析了CglⅠ基因在大肠杆菌中的功能活性.     

果胶酶pelB基因片段克隆及序列分析

根据GenBank上登录的果胶酶基因保守序列设计引物,从本实验室已筛选的一株具有降解果胶质功能的枯草芽孢杆菌S-1中克隆到了pelB基因片段,pelB与pMD20-T载体连接后转化到大肠杆菌JM109中,测序并构建进化树分析.结果表明,其序列与来源于Bacillus sp.果胶裂解酶pel-15和pelA的同源性分别为40.98%和39.20%;与Bacillus Pumilus的pelB一致性为40.32%.推断此pelB为类似果胶酶基因片段.     

山梨糖脱氢酶基因在大肠杆菌染色体上整合及表达

以质粒pKF3为模板,扩增出两翼与ptsG基因上下游序列同源,中间为氯霉素抗性基因的DNA片段,连至pMD18T载体,构建得到pMD18PC。以质粒pQE60SDH为模板,扩增山梨糖脱氢酶基因sdh,与pMD18PC连接,得到pMD18PCSDH。将其用PvuⅡ酶切,回收含ptsG1catsdhptsG2的目的片段,电转化至JM109/pKD46,在Red重组酶的作用下,外源DNA片段与染色体上对应区域发生同源重组,将基因ptsG敲除,替换为catsdh基因,获得整合sdh基因的JM109s。经检测JM109s具有山梨糖脱氢酶活性。以 ptsG基因上下游序列为引物,JM109s基因组DNA为模板进行PCR,扩增产物测序结果表明sdh基因染色体整合成功。     

应用RD-PCR技术制备基因芯片靶基因片段

应用RD－PCR技术分离SH－SY5Y细胞的基因片段。从正常培养的SH－SY5Y细胞中提取总RNA,经oligo(dT）纤维素柱纯化分离出mRNA,然后以oligo(dT18)为锚定引物反转录生成单链cDNA,再以此为模板合成DNA的第二条链;将双链DNA经Sau3AI酶切之后,接上接头,经通用引物和选择性引物进行扩增;然后与载体pMD18-T相连,克隆鉴定、筛选、测序。所分离的cDNA片段经过扩增后用于制备基因芯片的靶基因,杂交检测的结果表明,此种方法所分离的基因片段可以用于基因芯片的靶基因片段,所制备的芯片将为进一步研究神经细胞基因表达提供了条件。     

兽疫链球菌透明质酸分解酶基因的敲除

以透明质酸分解酶基因（Hyl）为改造目标, 利用同源重组技术获得 Hyl基因敲除的重组菌。首先以兽疫链球菌的基因组DNA为模板扩增出部分透明质酸分解酶基因（Hyl-1）,然后将其克隆到载体pMD19-T上,再以质粒pUC19为模板, PCR扩增得到氨苄青霉素抗性基因,通过反向PCR将其插入Hyl-1基因的中部,得到基因敲除载体pMD19T-SA。该载体与质粒pBR322分别用EcoRⅠ、PstⅠ双酶切后进行连接,得到基因敲除的重组载体pBR322 SA,PCR 及限制性酶切分析,构建的敲除载体与设计结果相符。最后,利用这两种敲除载体通过同源重组技术得到一株重组菌,经PCR 及酶活鉴定,这株菌的Hyl 基因已缺失。     

禽巴氏杆菌C48-3株成熟黏附蛋白基因cpm39的克隆及序列分析

目的：对禽巴氏杆菌C48-3躺株编码成熟黏附蛋白的基因cpm39进行克隆和序列分析。方法：通过PCR从禽巴氏杆菌C448-3。基因组DNA中扩增出cpm39基因,克隆到pMD18-T载体中,转化大肠杆菌DH5d,并对目的基因进行核苷酸序列测定;用Clustal X和Mega 2．1软件将测定的序列与GenBank中已登录的16种血清型巴氏杆菌株核苷酸序列进行同源性分析。结果：测序结果表明cpm39基因大小为1002bp,与已知的16个血清型巴氏杆菌cpm39基因核苷酸序列的同源性为81．5％～100％。结论：克隆得到禽巴氏杆菌C。躺株编码成熟黏附蛋白的cpm39基因,该基因在不同血清型巴氏杆菌中具有很高的同源性,该蛋白可以作为研制预防巴氏杆菌病亚单位疫苗的候选抗原。     

一步法快速构建多片段连接的同源臂载体

目的：建立一种简便、高效,可一步完成多个片段连接,从而构建含同源臂的载体的方法。方法：按照酶切后可产生前后片段相匹配的粘性末端接头的原则设计PCR引物,在目的片段两端均引入BsaⅠ酶切位点。以G160基因为例,PCR扩增打靶用左右同源臂片段、示踪基因CMV-EGFP片段、载体骨架pMD19－T等4个片段,纯化后一起加入一个反应管中,并加入BsaⅠ限制性内切酶和T7DNA连接酶及相应缓冲液,进行酶切、酶连接共10～50个循环反应,一步构建含同源臂载体的质粒;产物经高温处理后,直接转化感受态细胞,并进行重组子PCR鉴定;对pMD19－T载体进行优化,突变载体上的BsaⅠ酶切位点,把示踪基因CMV-EGFP片段引入pHSG298－T载体,再选择不同的G160基因同源臂片段组合对构建系统进行验证。结果：重组质粒酶切和PCR结果表明,应用一步法可成功连接多个片段来构建含同源臂及示踪基因的克隆载体;用优化后的pMD19－T－O载体体系,在2d内即完成了6种各含4个片段的载体的构建。结论：多个基因片段一步无缝连接的方法简便、易行、可靠,不仅可快速构建某类载体系统,还可对基因进行精确的点突变,该系统可用于快速构建基因打靶载体。     

串珠镰孢霉D-泛解酸内酯水解酶基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

利用D_泛解酸内酯水解酶N末端序列,并根据NCBI中公布的D_泛解酸内酯水解酶cDNA序列设计了一个特异引物,该引物结合Oligo(dT) 1 5,以串珠镰孢霉(Fusariummoniliforme)CGMCC 0 5 36mRNA反转录得到的总cDNA为模板进行扩增,获得约1 5kb左右的片段,将其克隆到T载体上进行测序,对测得的序列进行分析,重新设计了一对引物,并在引物两端分别加上限制酶EcoRⅠ和SalⅠ的识别位点序列,利用热启动PCR成功地扩增出了D_泛解酸内酯水解酶基因,基因片段长度为114 6bp ,该序列同来源于尖镰孢霉菌(F .oxysporum)AKU 370 2菌株的编码D_泛解酸内酯水解酶cDNA结构基因的同源性为90 0 6 %。将所得片段定向克隆到pTrc99a载体中,转化至JM10 9感受态细胞,筛选出了阳性克隆。经IPTG诱导阳性菌,进行SDS_PAGE电泳,检测出在约4 0kD处有一蛋白表达带。对两株重组基因工程菌的比活力进行测定,结果分别为37U和4 1U。     

阴道毛滴虫氢化酶体腺苷酸激酶基因的克隆及序列分析

目的-克隆阴道毛滴虫氢化酶体腺苷酸激酶(AK)基因,并测定其序列,进行序列分析。方法-根据AK基因已知序列设计合成一对引物,应用PCR技术从阴道毛滴虫基因组DNA中扩增出AK基因,并将其克隆入pMD18-T simple载体。阳性克隆的重组质粒经酶切及PCR鉴定后,用双脱氧链末端终止法进行基因序列测定。应用BLAST软件辅助分析所测基因与Genbank中阴道毛滴虫氢化酶体AK序列的同源性。结果-PCR扩增得到特异的阴道毛滴虫氢化酶体腺苷酸激酶基因序列。酶切及PCR鉴定获得了正确的PT-AK重组质粒。测序表明,所克隆的AK基因大小为690bp,编码229个氨基酸。序列分析表明,所测基因与Genbank中阴道毛滴虫氢化酶体AK序列具有高度同源性(99．9％)。结论-克隆了阴道毛滴虫氢化酶体腺苷酸激酶基因,序列测定及同源性分析表明,所测基因与Genbank中阴道毛滴虫氢化酶体AK序列具有高度同源性。     

基于18S rRNA基因序列的我国马梨形虫分类学地位分析

为从分子水平上阐明我国马梨形虫的种属分类特征。根据GenBank中登录的马梨形虫18SrRNA基因序列,在其高变区设计引物。PCR扩增获得大小分别为913bp、451bp的目的片段。将该片段克隆至pMD-18T载体后进行序列测定,并和GenBank上登录的其他地方株梨形虫18SrRNA基因序列进行同一性分析并构建系统发生树。分析显示,之前被称作马巴贝斯虫的虫种和泰勒虫虫种有着更密切的亲缘关系,在进化发育过程中处于同一种系,而与巴贝斯虫为明显的2个分支。我国驽巴贝斯虫肇源株与西班牙分离株(AY534883.1)仅有较小差异,其同源性高达91.8%。马泰勒虫肇源株与西班牙分离株(DQ287951.1,AY150064.2)同源性均高于91.4%。以上分析显示我国马梨形虫地方株和西班牙地方株亲缘关系最近,而与其他地方株差异相对较大。因此我国肇源株马梨形虫和西班牙地方株同属于Atbara8。     

用重叠PCR合成植物甜蛋白brazzein基因

目的:为在泡盛曲霉(Aspergillus awamori)中进行表达,采用重叠PCR合成了植物甜蛋白brazzein基因。方法:根据非洲热带植物Pentadiplandra brazzeana产生的天然甜蛋白brazzein的氨基酸序列及泡盛曲霉糖化酶基因glaA的密码子偏爱性,设计并化学合成了2对3’-端互补的寡聚核苷酸,通过PCR延伸获得2条末端有部分重叠的双链核苷酸片段,再通过重叠PCR扩增,合成了用于泡盛曲霉表达的植物甜蛋白brazzein基因。结果:将brazzein基因克隆到pMD18-T载体,随机挑取6个重组质粒测序,结果1个重组质粒有连续4个碱基缺失,3个重组质粒各有1个碱基缺失,2个重组质粒携带的brazzein基因核苷酸序列完全正确。结论:合成的brazzein基因大小162 bp,编码54个氨基酸,推断的氨基酸序列与Pentadiplandra brazzeana产生的天然brazzein完全一致,表明植物甜蛋白brazzein基因成功合成。     

T载体介导的基于attL核心区LR反应的简化快速Gateway克隆系统

Gateway克隆技术已得到广泛的应用。该技术先通过BP反应将目标片段连到带有完整attL特异识别位点的入门载体,然后与终载体通过LR反应得到表达载体。Gateway克隆方法与传统的酶切连接方法相比有快速简单等优点。但是,BP和LR酶都非常昂贵。本研究首先对3个常用Gateway载体的atts特异位点序列比对发现,attL序列核心交换位点“core attL”的21~22 bp长的碱基是保守和必要的。由此,设计含有core-attL序列的引物,通过PCR克隆得到DNA片段并连入pMD18-T载体,然后进行LR反应,可成功得到目标表达载体,并在保守的位点上正确重组。本研究还对其中一个带有绿色荧光蛋白基因的表达载体转化至烟草,能够正常表达该蛋白质。结果表明,通过将含有attL核心位点基因片段连接到pMD18-T载体上,可以省略BP反应而将目标片段连接到终载体上,节约了反应时间和成本。