Ⅰ型前胶原氨基端肽化学发光免疫分析检测方法的建立及评价

为了建立定量检测人血清中Ⅰ型前胶原氨基端肽 (Type Ⅰ procollagen N-terminal peptide,PINP) 的化学发光免疫分析检测方法,首先在谷氨酸棒状杆菌中分泌表达了PINP-α1链重组蛋白,以其为免疫原制备单抗,获得了2B10、8C12和1F11共3株可稳定分泌抗PINP-α1链的单抗杂交瘤细胞株。进一步配对筛选后,以单抗8C12偶联生物素作为捕获抗体,单抗1F11标记辣根过氧化物酶作为检测抗体,二者与样本中的PINP结合形成夹心复合物,再与包被有链霉亲和素的磁微粒形成完整的检测系统,从而定量检测人血清中PINP的浓度。对该方法进行条件优化后,确定捕获抗体、检测抗体的最佳工作浓度均为3 μg/mL,孵育时间为30 min;本方法的最低检测限为1.22 ng/mL,批内、批间的变异系数均在10%以内,线性范围为5–1 100 ng/mL,回收率在93%–107%之间。通过对160份临床样本进行检测,本方法检测结果与罗氏诊断试剂盒检测结果的相关系数R2为0.906 2。开发的磁微粒化学发光免疫分析检测方法可定量检测人血清中PINP的含量,有望成为骨骼疾病检查的辅助手段。     

流式微球一步法快速免疫检测马铃薯A病毒

[目的]建立流式微球一步法快速免疫检测马铃薯A病毒(PVA)的新方法.[方法]以荧光微球为反应载体,通过在微球表面进行双抗夹心免疫反应形成微球-捕获抗体-PVA-标记FITC检测抗体的复合物,利用流式细胞仪荧光检测系统收集荧光信号.[结果]通过实验优化检测条件,最佳捕获抗体工作浓度为4μg/mL、最佳检测抗体工作浓度为1:25倍稀释、最佳反应时间为2h;与马铃薯Y病毒、莴苣花叶病毒、番茄环斑病毒等均未出现交叉反应;阳性样品经64倍稀释后依然可检出,检测灵敏度是传统微孔板ELISA的4倍.[结论]流式微球一步法能灵敏、快速、简便的检测马铃薯A病毒.     

胱抑素C抗体制备及化学发光免疫检测方法的建立

制备胱抑素C的单克隆抗体并建立可用于肾损伤早期诊断的化学发光检测方法。合成胱抑素C多肽制备单抗隆抗体,用竞争抑制法筛选优化配对抗体并建立化学发光胱抑素C检测方法。获得胱抑素C单抗细胞共39株,经筛选确定出可配对抗体,通过线性范围、最低检测限、精密性、准确度等分析性能评价,建立了线性范围为50-20 000 ng/mL、最低检测限为3 ng/mL的化学发光胱抑素C检测方法。成功制备胱抑素C配对抗体,并以此为基础建立了化学发光检测方法,为早期肾损伤提供了一种新检测技术和方法。     

杆状病毒P6.9蛋白的表达及自身互作研究

目的:在大肠杆菌中表达苜蓿银纹夜蛾核多角体病毒P6.9蛋白并制备抗体,研究P6.9的自身互作。方法:用PCR方法扩增p6.9基因,将其分别克隆到原核表达载体pMAL-c2x、pGEX-4T-1、pET28a中,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。选取可溶性较好的融合蛋白纯化后免疫家兔制备抗体。然后利用该抗体进行Western blot检测、分析P6.9的自身互作。结果:构建了pMAL-P6.9、pGEX-P6.9、pET-P6.9三种原核表达质粒,分别在大肠杆菌中经IPTG诱导表达产生了与预期分子量相符的MBP-P6.9(49.4kDa)、GST-P6.9(32.9kDa)、HIS-P6.9(12.5kDa)融合蛋白。制备了P6.9的多克隆抗体,能与P6.9蛋白发生特异反应。Pull-down结果表明P6.9自身互作。结论:获得了兔抗P6.9的多克隆抗体,为深入研究P6.9的功能提供了检测工具。证明了P6.9之间的互作,说明该蛋白功能的发挥可能是通过多聚体起作用的。     

人tBID蛋白的表达纯化及其偶联的新型分子探针对前列腺癌细胞的促凋亡作用研究

目的:以PQE-30为原核表达载体,构建PQE30-tBID重组表达载体,表达和纯化目的蛋白tBID,并利用金磁纳米微粒将tBID蛋白与人HER2抗体偶联成分子探针Anti HER2-Gold Mag-tBID,以探究其对前列腺癌细胞的促凋亡作用。方法:根据tBID的基因序列设计特异性的上下游引物,利用普通PCR扩增目的基因tBID,构建重组表达载体PQE30-tBID,将其转化到BL21(DE3)中,IPTG诱导表达,经SDS-PAGE凝胶电泳和Western Blot鉴定分析,验证目的蛋白tBID的表达,并对其进行纯化。利用金磁纳米微粒与蛋白质之间的静电相互作用以及疏水相互作用,将人HER2抗体与tBID蛋白偶联在其表面,构建分子探针Anti HER2-Gold Mag-tBID。流式细胞术检测该分子探针与前列腺癌PC-3细胞的特异性亲附结合能力,通过Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒分析分子探针对PC-3细胞的促凋亡作用。结果:普通PCR扩增后得到了411 bp的DNA片段,经双酶切鉴定以及菌液测序,表明重组表达载体PQE30-tBID构建成功。促凋亡蛋白tBID成功地在大肠杆菌中表达,蛋白相对分子量约15 KD,经过纯化,得到了纯度较高的tBID蛋白。经过与金磁纳米微粒的偶联,成功构建出一种新型的分子探针Anti HER2-Gold Mag-tBID。该分子探针可与PC-3细胞特异性结合,且经Annexin V-FITC染色分析可见PC-3细胞发生明显凋亡,凋亡率达62.9%,与未处理组(3.79%)和对照组(4.33%)相比,具有显著的统计学差异。结论:PQE30-tBID重组表达载体能在大肠杆菌中高效表达,且成功得到了纯度较高的人促凋亡蛋白tBID。经金磁纳米微粒偶联,该蛋白能够与人HER2抗体重组成新型的分子探针,且能特异性地靶向前列腺癌PC-3细胞并显著促进其凋亡。     

应用RAD多肽展示体系制备抗hCG类抗体分子

应用基于激烈火球菌Pyrococcus furiosus重组酶RadA的ATP酶结构域(RAD骨架)的多肽展示体系,通过嫁接人绒毛膜促性腺激素(hCG)结合多肽,制备抗hCG类抗体分子。通过合成hCG结合多肽插入RAD多肽展示位点的类抗体基因,成功构建了pET30a-RAD/hCGBP-sfGFP原核表达载体,在大肠杆菌中诱导蛋白表达,分离、纯化获得类抗体蛋白,通过亲和吸附-GFP荧光检测方法测定类抗体对hCG的结合活性,并与应用单域抗体通用骨架制备的嫁接抗体比较活性差异。结果显示,RAD类抗体分子对hCG分子具有较高的亲和性和特异性,显著优于单域嫁接抗体,并与商业单克隆抗体的活性相当;同时,利用RAD多肽展示骨架制备的抗hCG类抗体,具有较高的生化稳定性,是一种具有应用潜力的抗体替代分子。     

牛奶过敏原β-乳球蛋白的重组制备及磁微粒化学发光检测法的建立

运用原核系统表达牛奶β-乳球蛋白(Bos d5)蛋白,建立一种纳米磁微粒化学发光方法用于检测牛奶组分过敏原β-乳球蛋白特异性Ig E抗体的含量。通过优化合成牛奶β-乳球蛋白基因,与质粒重组导入Rosetta原核表达菌株中表达目标蛋白,纯化的重组蛋白采用生物素标记后,在化学发光平台上进行过敏原项目检测。获得纯度﹥85%的22.5 kD重组牛β-乳球蛋白,将生物素化的重组蛋白用于牛奶β-乳球蛋白纳米磁微粒检测试剂盒,检测临床110例血清样本,和Phadia进行方法学比对阳性符合率为88.9%,阴性符合率97.3%,总符合率94.5%,P<0.001,χ^2=84.238,Kappa=0.874,其与Phadia参照试剂盒同样具有良好的检测能力。原核表达系统中获得的重组牛奶过敏组分β-乳球蛋白具有较好的免疫活性,开发的免疫诊断试剂盒具备良好的性能,可用于临床辅助诊断。     

中华蜜蜂热休克蛋白70的克隆、表达及中蜂囊状幼虫病毒感染后表达差异分析

[目的]本研究旨在明确中华蜜蜂Apis cerana cerana热休克蛋白70 (Heat shock protein 70,HSP70)与中蜂囊状幼虫病毒(Chinese sacbrood virus,CSBV)的关系.[方法]首先根据NCBI上已公布的中华蜜蜂HSP70的全基因(NO.MH122655.1)序列,设计特异性引物,提取3日龄中华蜜蜂幼虫总RNA,通过RT-PCR方法获得HSP70基因,并通过生物信息学软件进行分析;其次将其克隆到原核表达载体pET-32a中,转化入大肠杆菌BL21(DE3)进行蛋白表达,并制备重组蛋白,将纯化的重组蛋白免疫小鼠制备多克隆抗体;最后利用制备多克隆抗体作为一抗,通过Western-blot方法检测CSBV感染中华蜜蜂前后HSP70在幼虫体内的变化.[结果]成功获取中华蜜蜂HSP70蛋白的全基因,其核苷酸序列全长为1833 bp,生物信息学分析后,发现其编码蛋白存在7个抗原表位.利用原核表达系统,成功获得大小约87 ku的重组蛋白HSP70,免疫小鼠后获得多克隆抗体,经Western-blot分析能与标签蛋白发生特异性反应;对感染CSBV前后蜜蜂体内HSP70蛋白检测发现感染后HSP70表达水平显著提高.[结论]通过原核表达系统,成功表达中华蜜蜂HSP70基因和HSP70多克隆抗体,并证实CSBV感染后影响中华蜜蜂体内HSP70蛋白表达量的改变,为深入研究HSP70功能提供了帮助.     

抗脱氧雪腐镰刀菌烯醇单克隆抗体的制备

[目的]小麦赤霉病菌产生的毒素不仅在病害发展过程中具有加重赤霉病的作用,而且污染谷物导致严重的食用安全性问题.由于赤霉病的普遍发生,有必要建立快速、灵敏、有效的毒素检测方法,本试验旨在制备可用于检测被脱氧雪腐镰刀菌烯醇污染的粮谷类特异性单克隆抗体.[方法]本实验首先将脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)的衍生物3-半琥珀酰-脱氧雪腐镰刀菌烯醇(3-HS-DON-OVA)与卵清蛋白(OVA)采用碳化二亚胺法进行偶联得到人工抗原,以此人工抗原免疫BALB/C小鼠,取该鼠脾细胞与SP2/O鼠骨髓瘤细胞融合,经筛选和克隆,得到了1株能稳定分泌DON抗体的单克隆细胞株(382),并制备单克隆抗体腹水.[结果]经检测382的抗体类型及亚类均为IgG1,其轻链为κ链.腹水通过间接酶联免疫吸附测定效价在1×10-7以上.该单克隆抗体与脱氧雪腐镰刀菌烯醇特异性结合反应的50%抑制质量浓度为29 μg/L,除与3-acetyldeoxynivalenol(3-Ac-DON)的交叉反应率为78.38%,与其他脱氧雪腐镰刀菌烯醇结构类似物无交叉反应.[结论]本实验所制备的单克隆抗体有较高的灵敏度和特异性,具有较好的应用价值.     

甘蔗宿根矮化病多克隆抗体和免疫磁珠的制备

本研究通过制备Lxx(Leifsonia xyli subsp.xyli)免疫磁珠,实现对甘蔗Lxx进行分离,用于病原菌与甘蔗互作的深入研究。以RSD PCR检测呈阳性的感病甘蔗为材料,分离培养Lxx抗原进行多克隆抗体制备,利用磁性Fe3O4纳米粒子与Lxx多克隆抗体偶联制备免疫磁珠。根据菌落的形态特征,并结合PCR验证确认所分离到的菌是甘蔗宿根矮化病的致病菌Lxx,免疫兔子后获得了较好的多克隆抗体,间接ELISA测定Lxx多克隆抗体的效价高于204 800。免疫磁珠外观成球性较好,粒径大小在125-268 nm之间,对菌培养液中Lxx亲和性强分离物可用于进一步的PCR实验。Lxx免疫磁珠的成功制备,能够快速实现Lxx的分离与富集,为Lxx与甘蔗互作时期下甘蔗感病性检测和病原菌的富集提供了便捷高效的技术手段。     

灰飞虱内生病毒HiPV外壳蛋白VP1多克隆抗体的制备及在病毒检测中的应用

【目的】前期发现水稻条纹病毒(rice stripe virus, RSV)可与介体灰飞虱Laodelphax striatellus体内的HiPV病毒(Himetobi P virus, HiPV)互作。本研究旨在制备HiPV外壳蛋白VP1的多克隆抗体,并评估其在HiPV病毒检测中的可用性,以为深入研究HiPV-RSV和HiPV-灰飞虱的互作机制提供技术支持。【方法】以RT-PCR方法从灰飞虱成虫体内扩增HiPV主要外壳蛋白基因VP1,然后将VP1基因亚克隆至原核表达载体pET-32a中,构建表达载体pET-VP1。将重组质粒转化大肠杆菌Escherichia coli BL21 (DE3),经IPTG诱导、Ni²⁺-NTA亲和层析纯化,获得重组蛋白,免疫新西兰大白兔,制备抗体。【结果】从灰飞虱体内克隆到774 bp的HiPV外壳蛋白基因VP1,经原核表达、纯化,获得分子量约47.5 kD的融合蛋白,免疫新西兰大白兔后获得VP1多克隆抗体。该抗体间接ELISA效价达1∶819 200,与HiPV外壳蛋白VP1有特异性反应,而与灰飞虱蛋白无交叉反应。利用该多克隆抗体建立了检测单头灰飞虱成虫体内HiPV的Western blot和免疫捕获RT-PCR方法,检测结果显示HiPV在携带和不携带RSV的灰飞虱高亲和性群体内均广泛存在。【结论】利用制备的HiPV的VP1多克隆抗体可特异性检测灰飞虱体内HiPV。本研究为HiPV病毒的快速检测以及HiPV-RSV互作、HiPV-灰飞虱互作研究提供了技术支持。     

基于TbpA蛋白的副猪嗜血杆菌抗体间接酶联免疫吸附试验检测方法的建立及应用

[背景]副猪嗜血杆菌(Haemophilusparasuis,HPS)是猪革拉瑟氏病(Glasser's Disease)的病原体,抗生素治疗和疫苗接种对于防控该病效果不明显,建立快速、准确的抗体检测方法尤为重要.[目的]利用表达纯化的HPS转铁结合蛋白A(TbpA)建立检测HPS抗体的间接酶联免疫吸附试验(ELISA...     

肺炎嗜衣原体蛋白酶样活性因子免疫优势区基因 重组蛋白在早期诊断中的应用

[目的]克隆和表达肺炎嗜衣原体(Chlamydophila pneumoniae,Cpn)蛋白酶样活性因子(CPAF)免疫优势区基因,评价重组蛋白在早期感染诊断中的应用价值.[方法]挑选并克隆出Cpn CPAF免疫优势区基因,构建原核表达载体,诱导表达并纯化重组蛋白,分析其抗原特异性;间接ELISA法检测Cpn参考血清、临床血清标本中的特异性IgM抗体,以及呼吸道感染患者痰咽拭子中的Cpn抗原;检测沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis,Ct)临床阳性血清和泌尿生殖道分泌物.[结果]高效表达和纯化出一相对分子量约51.3kDa的重组蛋白;Western blot证明其只与人抗Cpn抗血清发生特异性反应;间接ELISA法检测40份Cpn IgM参考血清,阴性和阳性结果的一致率均为100%(40/40);与"金标准"方法MIF对照,检测300例临床血清标本中的IgM抗体,符合率为98.3%;与PCR试剂对照,检测120份呼吸道感染患者痰咽拭子中的Cpn抗原,符合率为88.3%;检测Ct阳性血清和泌尿生殖道分泌物,与Ct没有交叉反应.[结论]制备的CPAF免疫优势区基因重组蛋白具有良好的抗原性,在Cpn感染早期诊断中具有较高的利用价值.     

Carboxin抗性基因(Cbx~R)原核表达及多克隆抗体的制备

[目的]克隆CbxR基因,进行原核表达,纯化CbxR基因蛋白并制备其多克隆抗体。[方法]CbxR基因克隆至原核表达载体p ET-28a(+),转化大肠杆菌BL21(DE3)诱导表达并纯化,Western blot鉴定分析。制备CbxR蛋白的兔源多克隆抗体,运用间接ELISA方法检测多抗效价,利用Western blot印记检测抗体特异性。[结果]成功获得CbxR基因,在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导可大量表达,成功制备CbxR蛋白兔源多克隆抗体,效价为1∶64 000,经Western blot检测表明多克隆抗体特异性良好。[结论]多克隆抗体为CbxR检测及进一步研究CbxR基因功能奠定了基础。     

抗Ⅰ型马立克氏病毒sorf2蛋白的多克隆抗体制备及其特异性鉴定

[目的]制备高效价鼠和兔抗Ⅰ型马立克氏病毒(Marek's disease virus,MDV) sorf2蛋白的多克隆抗体并对其特异性进行鉴定.[方法]以Ⅰ型MDV GX0101为模板,利用PCR扩增sorf2基因,分别克隆进原核表达载体pET-28a(+)和pET-32a(+)中,转化大肠杆菌BL21 (Rosetta),经异丙基硫代-β-D半乳糖苷(IPTG)诱导后进行融合蛋白的表达和纯化.用纯化的融合目的蛋白常规免疫6-8周龄Balb/c小鼠和成年新西兰大白兔,制备抗sorf2蛋白的多克隆抗体.用Western blot和间接免疫荧光试验鉴定多克隆抗体的特异性.[结果]Ⅰ型MDV的sorf2基因在原核表达载体中能够正确表达,免疫小鼠和兔后能获得与sorf2蛋白发生特异性反应的高效价的多克隆抗体.[结论]制备的抗sorf2蛋白的多克隆抗体能够特异的鉴定MDV sorf2基因缺失株,有效的区分MDV疫苗株HVT(FC-126)与Ⅰ型MDV毒株,用于临床MDV野毒的分离鉴定.     

钼还原菌中TrxR的原核表达及多克隆抗体制备

[目的]构建枯草芽孢杆菌硫氧还蛋白还原酶(thioredoxin reductase,TrxR)原核载体,表达、纯化TrxR重组蛋白,制备并鉴定多克隆抗体。[方法]通过分子克隆获得TrxR蛋白的表达菌株;利用镍离子亲和层析获得纯化的TrxR重组蛋白,免疫兔子制备TrxR蛋白多克隆抗体;采用ELISA法测定抗体效价;Western Blot检测抗血清的特异性。[结果]TrxR重组载体双酶切结果与DNA测序鉴定结果一致,蛋白表达纯化条带大小与预测一致。ELISA法测定抗血清效价为7×104,Western Blot证实抗血清有较高的特异性。[结论]成功克隆、表达与纯化TrxR重组蛋白,制备并鉴定兔子多克隆抗体,为TrxR的生物学功能研究奠定基础。     

DLL4蛋白真核表达及多克隆抗体制备

该研究旨为克隆、表达和纯化出人源DLL4蛋白,并制备出相对应的多克隆抗体。采用搭桥PCR,构建带有t PA信号肽的DLL4基因,并克隆到p GZX表达载体上,经过酶切和测序鉴定后,瞬时转染到HEK293F细胞中,转染48 h后对发酵上清液进行镍柱亲和纯化。利用Dot blotting、Western blotting和Fortebio大分子互作仪检测DLL4的生物活性;免疫兔子制备DLL4多克隆抗体,采用ELISA法检测抗体效价,Western blotting检测抗体特异性。PCR扩增出1.6 kb的t PA-DLL4-6His目的片段,测序结果表明,与NCBI数据库中的DLL4序列(NM_019074.3)相同。一步亲和纯化后,得到纯度为95%的DLL4蛋白,Dot blotting和Western blotting检测到发酵上清液中含有DLL4蛋白,DLL4蛋白和DLL4抗体之间的亲和力在1.848E-10,R2=0.999,ELISA法获得DDL4抗体效价为1∶12 800,Western blotting检测DLL4抗体具有良好的特异性。成功制备出具有免疫原性的DLL4蛋白及其多克隆抗体。     

重组人骨硬化蛋白的表达、纯化及多克隆抗体制备

[目的]构建人骨硬化蛋白(Sclerostin,SOST)原核载体,表达、纯化SOST蛋白,制备与鉴定小鼠多克隆抗体。[方法]通过分子克隆获得SOST蛋白的表达菌株;利用SDS-PAGE电泳切胶纯化、尿素梯度复性获得SOST蛋白,免疫小鼠制备SOST蛋白多克隆抗体;采用ELISA法检测抗体滴度;Western blotting检测抗血清特异性;DNAMAN与MEGA软件分析SOST蛋白系统进化关系。[结果]SOST重组载体双酶切、DNA测序鉴定结果,以及蛋白表达、纯化条带大小与预测一致。ELISA法获得SOST抗血清滴度达1:6 400倍,Western blotting证实抗血清具有很好的特异性。SOST序列的系统发生分析发现动物具有显著不同的进化趋势。[结论]成功克隆、表达与纯化SOST蛋白,制备并鉴定小鼠多克隆抗体。为SOST蛋白功能研究奠定基础。     

旋转磁场联合5-FU对SP2/0细胞超微弱发光强度的影响

目的:研究旋转磁场(RMF)联合氟尿嘧啶(5-Fu)对小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0)超微弱发光的影响,探讨两者联合对肿瘤细胞的杀伤作用.方法:SP2/0细胞分为四组:对照组,单纯5-FU化疗组(单化组),单纯磁疗组(单磁组),磁场联合5-FU组(磁化组).用RMF、5-FU作用于SP2/0细胞,化学发光仪进行分析.结果:对照组的化学发光强度值最低,单化组、单磁组、磁化组化学发光强度值均明显高于对照组(P均<0.001).单磁组低于单化组及磁化组,有明显差别(P<0.001);磁化组的化学发光强度值最高,高于单化组(P<0.001).结论:磁场和5-Fu均可引起SP2/0细胞化学发光强度值的变化,以磁场联合5-Fu的化学发光强度值变化最明显,提示磁场单独及联合5-FU对SP2/0细胞有明显的杀伤作用.其机理可能与旋转磁场和5-FU引起细胞自由基增高有关.     

11个灵芝菌株的分子ID构建

[目的]收集11株灵芝菌种为材料,在分子水平上对其进行分类鉴定,并构建分子ID.[方法]采用ITS和SSR分子标记技术,对11株灵芝进行分子鉴定分析.[结果]通过内转录间隔区(ITS)序列测定分析表明,与GenBank上登录的灵芝(Ganoderma lucidum)菌株ITS序列相似度达到99％,在种的水平上证明实验所采用的供试菌株均属灵芝种(Ganoderma lucidum).利用SSR分子标记技术对菌株进行引物扩增,综合多态性条带,用NTSYS软件进行聚类分析,相似度在0.62水平上,1 1个灵芝菌种被分成4个类群,其中GL-2与GL-4各自聚为一类.用ID Analysis 1.0软件进行数据分析表明,用5对SSR引物可将11株灵芝供试菌种完全区分开,并构建其分子身份证.[结论]基于SSR分子标记构建灵芝菌属的分子ID是可行的.