猪心乳酸脱氢酶(H_4)在盐酸胍变性过程中失活与内源荧光变化速度的比较

本文比较了大然乳酸脱氢酶和硫酸铵稳定的乳酸脱氢酶在盐酸胍性过程式中失活与内源荧光的变化速度.酶失活表现为三相反应,即极快相,其速度常数用停流装置也无法测定;快相和慢相,1M胍变性时,此二相的一级反应速度常数分别为2.7×10~(-3)秒~(-1)和4.17×10~(-4)秒~(-1).在2M硫酸铵存在条件下,用2M胍更性时,快相和慢相的一极反应速度常数分别为6.16×10~(-3)秒~(-1)和1.88×10~(-3)秒~(-1).内源荧光强度的变化表现为二相反应,即极快相,相当酶失活的极快相,但变化幅度远小于酶失活的变化幅度;快相,相当于酶失活的快相,其速度常数为失活速度常数的1/3倍.上述结果表明,类似肌酸激酶,乳酸脱氢酶的失活速度快于酶分子整体构象的变化,相对于整个酶分子来说,活性中心的构象变化对变性剂更加敏感.     

猪心乳酸脱氢酶(H_4)在盐酸胍变性过程中失活与内源荧光变化速度的比较

本文比较了大然乳酸脱氢酶和硫酸铵稳定的乳酸脱氢酶在盐酸胍性过程式中失活与内源荧光的变化速度.酶失活表现为三相反应,即极快相,其速度常数用停流装置也无法测定;快相和慢相,1M胍变性时,此二相的一级反应速度常数分别为2.7×10~(-3)秒~(-1)和4.17×10~(-4)秒~(-1).在2M硫酸铵存在条件下,用2M胍更性时,快相和慢相的一极反应速度常数分别为6.16×10~(-3)秒~(-1)和1.88×10~(-3)秒~(-1).内源荧光强度的变化表现为二相反应,即极快相,相当酶失活的极快相,但变化幅度远小于酶失活的变化幅度;快相,相当于酶失活的快相,其速度常数为失活速度常数的1/3倍.上述结果表明,类似肌酸激酶,乳酸脱氢酶的失活速度快于酶分子整体构象的变化,相对于整个酶分子来说,活性中心的构象变化对变性剂更加敏感.     

温度诱导Targetron系统用于大肠杆菌高效基因失活

构建基于TeI3c/4c嗜热二型内含子的温度诱导Targetron基因失活系统 (Thermotargetron),并应用于中温微生物基因编辑。在大肠杆菌HMS174 (DE3) 基因组中,选择Subunit of flagellum基因 (fliC) 和C4 dicarboxylate orotate:H+ symporter基因 (dctA) 为靶基因。根据TeI3c/4c DNA识别规则,在fliC和dctA基因中选择fliC489a、fliC828s、fliC1038s和dctA2a位点为基因打靶位点。使用重叠延伸PCR方法,基于pHK-TT1A质粒构建打靶载体。打靶载体转化HMS174菌株,对数期转化子培养液48 ℃热激1 h后涂布于氯霉素抗性LB平板上。使用菌落PCR和DNA测序检测突变株并计算基因失活效率。获得突变株后,通过琼脂穿刺和碳源代谢实验,鉴定ΔfliC、ΔdctA突变株表型变化。菌落PCR测序结果表明,TeI3c/4c插入到fliC和dctA基因设计位点,且打靶效率高达100%。突变株表型验证实验表明,ΔfliC突变株运动能力显著下降,ΔdctA突变株苹果酸代谢能力缺失。综上所述,文中建立了一套适用于嗜中温微生物的温度诱导型、高效基因失活系统,该系统可通过控制宿主菌在48 ℃保温时间实现高效、靶向、精准基因失活。     

思茅山橙中的吲(口朶)生物碱

从思茅山橙 Melodinus henryi Craib 的根和果中分得8个吲哚生物碱。根据理化性质和光谱分析,分别鉴定为它勃水甘草宁(tabersonine)(1),11-甲氧基它勃水甘草宁(11-methoxy-tabersonine)(2),洛柯日宁(lochnerinine)(3),Δ~(14)-长春曼胺(Δ~(14)-vincamine)(4),16-表-Δ~(14)-长春曼胺(16-epi-Δ~(14)-vincaminc)(5),Δ~(14)-埃那胺(Δ~(14)-eburnamine)(6),19,20-二氢-康狄卡品(19,20-dihydro-condylocapine)(h)和双吲哚生物碱 tenuicausine(8)。     

用DANS反应-聚酰胺薄膜层析-荧光方法对小鼠尾壳核γ-氨基丁酸和牛磺酸的超微量测定

本工作将DANS反应和微量薄膜层析技术与荧光测量加以修改后联用,并注意了组织样品的去蛋白和DANS-牛磺酸洗脱剂的改进,获得了满意的定量测定氨基酸的结果。GABA、牛磺酸的浓度(GABA:0—60×10~(-12)克分子;牛磺酸:0—300×10~(-12)克分子)与其相应的DANS衍生物的荧光强度成线性关系。回收率分别为95—113％和82—94％。灵敏度比原有荧光方法提高了近100倍(10~(-12)克分子数量级)。用此法测得小鼠尾壳核中的GABA和牛磺酸分别为1.26±0.06和15.5±1.0微克分子/克湿重,组织样品只需0.5毫克或更少些。这为测定微量神经组织中的自由氨基酸提供了一种简便的超微量方法.     

青鱼腸胃道中蛋白酶的初步研究

(1)从淡水魚青魚腸胃道中提取出魚蛋白酶,酶制剂活力以酪蛋白作底物約为結晶胰蛋白酶的1/3。酶的前身有酶原存在,激活最适pH为8。(2)酶作用的pH偏于碱,水解酪蛋白和B-精-NH_2的最适pH都为9,酶和酶原对酸都不稳定,当pH低于4吋,酶活性和酶原激活的能力迅速丧失。(3)此酶对热很稳定,反应温度55度时,反应速度仍符合Arrhenius定律。測得水解酪蛋白和B-精-NH_2的活化能分别为14.6千卡/克分子及8.0千卡/克分子,較之胰蛋白酶水解此同一底物所需的活化能为低,尤以后者更显著,約相当于1/2值。(4)对小底物的水解以B-精-NH_2活力最高,K_m=3.3×10~(-3)M(40度pH8.7),为胰蛋白酶水解此同一底物所得K_m值的二分之一,对胰凝乳蛋白酶的底物B-酪-NH_2不作用,而对Cbz-甘-苯丙及白-NH_2却有較明显的活力。(5)半胱氨酸(10~(-3)M)和PCMB(10~(-4)M)对酶活力无影响,但能被DFP和胰蛋白酶抑制剂所抑制。DFP的抑剂随其与酶保温时間的增长而增大。lO~(-4)MDFP与酶液保溫10小时后能抑制酶活力达60%。胰蛋白酶抑制剂对此酶抑制的作用与抑制胰凝乳蛋白酶相类似。(6)从青魚腸胃道中找到有类胰蛋白酶抑制剂的存在。对魚本身蛋白酶有显著的抑制作用,对胰蛋白酶亦能抑制,但抑制能力較弱。     

水合牛血清白蛋白热稳定性的热力学研究

蛋白质的初级结合水对于蛋白质分子的构象及热稳定性有着重要影响。将不同吸附水量的牛血清白蛋白样品密封入铝制挥发型样品盘中,用P/E DSC_(-2)型差示扫描量热计对蛋白样品的变性温度、变性焓及变性前后的比热变化等热力学参数进行测量。实验证明,随水含量增多变性温度T_D下降,当含水量R(克H_2O/克BSA)>0.24时T_D的下降渐微,当R=0.5时T_D通过最小值后又略有增大。变性焓ΔH_D也与水含量密切相关,当R<0.5时ΔH_D渐趋恒值,为200千卡/克分子。本实验还观察到在低含水量范围内0.02相似文献   

蛋白质二硫键异构酶的纯化和活力测定

 从500g新鲜牛肝制得蛋白质二硫键异构酶(PDI,EC 5.3.4.1)98mg。该酶制剂在SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳中表现为亚基分子量62,000的均一条带。在260nm追踪,因二硫键错接而失活的牛胰核糖核酸酶A,经PDI作用使其二硫键重排恢复活力,从而催化酵母RNA的水解来测定PDI活力。这种单波长法比文献中介绍的追踪A_(260)—A_(280)的双波长法更为灵敏方便。酶的克分子消光系数ε_M=1.03×10~5(pH7.5),其比活性为1400单位/克蛋白质。     

花生四烯酸对大鼠顶叶皮层神经元延迟整流钾电流的抑制作用

目的和方法:采用全细胞式膜片钳技术,观察花生四烯酸(AA)对大鼠顶叶皮层神经元延迟整流钾电流(Ik)的影响。结果:①AA(10μmol/L)对大鼠顶叶皮层神经元Ik有抑制作用,抑制率为33.9%±8.74%(P<0.01)。②AA可使IK激活曲线的斜率因子变大且曲线向右移动,IK激活曲线的V1/2和k分别由给药前的(-55.3±0.9)mV和(10.3±0.4)mV,变为给药后的(-50.8±2.4)mV和(21.0±3.5)mV。③AA可使IK失活曲线斜率因子变大且曲线向左移动,IK失活曲线的V1/2和k分别由给药前的(-45.3±0.3)mV和(15.6±0.8)mV,变为给药后的(-70.9±1.9)mV和(36.5±2.1)mV。结论:花生四烯酸可抑制大鼠顶叶皮层神经元的延迟整流钾电流,并影响其动力学特征。     

咪达唑仑对hERG钾通道的作用

目的:观察咪达唑仑对人胚肾上皮细胞(HEK-293)中异源表达的人类相关基因(h ERG)钾电流作用及其机制。方法:利用全细胞膜片钳技术,观察咪达唑仑对h ERG钾通道的抑制作用,分析其对通道激活、失活动力学过程的影响以及咪达唑仑对Y652A和F656C突变型h ERG钾通道的作用。结果:咪达唑仑浓度依赖性地抑制h ERG钾电流,其IC50值为(1.31±0.32)μmol/L。1.0μmol/L的咪达唑仑加药前后半数激活电压V1/2由(2.32±0.38)m V变为(-1.96±0.83)m V;加药前后半数失活电压V1/2由(-49.25±0.69)m V变为(-57.53±0.53)m V(P0.05),失活曲线左移;与野生型(WT)比较,Y652A和F656C突变型可显著减弱咪达唑仑对h ERG通道的阻断作用。结论:咪达唑仑能阻断h ERG钾通道,失活速度加快,Y652和F656可能是咪达唑仑与h ERG钾通道结合的关键位点。     

大鼠海马CA1区神经元Na~+通道在出生后早期发育的变化

为了探索大鼠海马CA1区锥体神经元电压门控性Na+通道发育的关键期,本研究采用膜片钳技术,分别对急性分离的出生后0周、1周、2周、3周、4周的大鼠海马CA1区锥体神经元进行全细胞记录。结果显示,随着大鼠出生后周龄的增大,Na+通道的最大电流密度逐渐增大,出生后1~4周相对于出生后0周的最大电流密度的增幅分别为(42.76±4.91)%、(146.80±7.63)%、(208.79±5.28)%、(253.72±5.74)%(n=10,P<0.05),出生后1周与2周之间的增幅最为显著;Na+通道的稳态激活曲线向左移动,出生后0~2周的半数激活电压逐渐减小,分别为39.06±0.65、43.41±0.52、48.29±0.45(mV,n=10,P<0.05),出生后2~4周的半数激活电压变化不大,出生后0~4周的斜率因子没有显著变化;Na+通道的稳态失活曲线及半数失活电压没有显著变化,但出生后1~2周斜率因子减小,分别为5.77±0.56、4.42±0.43(n=10,P<0.05),出生后0~1周、2~4周之间的斜率因子没有明显变化;Na+通道失活后恢复曲线左移,出生后1~3周的恢复时间常数逐渐减小,分别为8.30±0.24、7.15±0.21、6.18±0.25(ms,n=10,P<0.05),而出生后0~1周、3~4周之间没有明显变化;随着出生后的发育,海马CA1区锥体神经元动作电位发生变化,超射值与最大上升速率增大,阈值降低,与Na+电流的变化一致。结果提示,出生后1~2周可能是电压门控性Na+通道发育的关键期,此期间Na+通道分布显著增加,激活曲线左移,失活速度变快,失活后恢复的时间缩短。     

蛇肌甘油醛-3-磷酸脱氢酶的研究——Ⅱ.蛇肌甘油醛-3-磷酸脱氢酶和兔肌甘油醛-3-磷酸脱氢酶稳定性的比较

本文比较了蛇肌GAPDH和兔肌GAPDH的稳定性。发现蛇肌Apo-GAPDH的热稳定性比兔肌Apo-GAPDH 和Holo-GAPDH 强。蛇肌Apo-GAPDH 的“熔点”为62.5℃。C,兔肌Apo-GAPDH 的“熔点”为52.5℃。55℃蛇肌Apo-GAPDH 的热失活速度比兔肌Apo-GAPDH 小得多,蛇肌Apo-GAPDH 活力损失一半的时间(t_(1/2)为1.2小时;兔肌Apo-GAPDH t_(1/2)为1.4分。Holo-GAPDH t_(1/2)为2.6分。热失活速度符合一级反应作图。底物存在热失活速度变小,NAD~ 对热失活的保护作用最大,当[NAD~ ]/[E]=240时,热失活速度蛇肌GAPDH 小32倍,兔肌GAPDH 小165倍,但蛇肌GAPDH 仍比兔肌GAPDH 稳定。蛇肌GAPDH 与兔肌GAPDH 的最适pH 相同,pH 稳定性蛇肌GAPDH 比兔肌GAPDH 强。蛇肌Apo-GAPDH 在pH4.9～9.4稳定,兔肌Apo-GAPDH 的pH 稳定范围在pH6.1～8.1。ATP 在0℃也引起蛇肌GAPDH 失活,失活速度比兔肌GAPDH 小。结果表明蛇肌GAPDH 比兔肌GAPDH 稳定性强、结构紧密、亚基间结合力强。     

三羟异黄酮对豚鼠心室肌细胞L-型钙通道电流的影响

本实验用全细胞膜片钳技术观察三羟异黄酮(genistein,GST)对豚鼠心室肌细胞L-钙通道电流(ICa、L)的影响。结果如下:(1)GST(10、50、100 μmol/L)可浓度依赖性地降低ICa,L(n=6,P<0.01)。GST的非活性结构类似物daidzein(100μmol/L),在同一浓度范围对ICa,L没有影响(n=5,P>0.05)。(2)GST使I-V曲线上移,但对ICa,L的电压依赖特征和最大激活电压无明显影响。(3)GST对ICa,L的激活动力学特性也无影响,但可使钙电流稳态失活曲线左移。V0.5从对照的-28.6±0.6 mV变为-32.8±1.1mV,κ值从对照的5.8±0.5 mV升至6.5±0.9 mV(n=6,P<0.05)。(4)GST明显使复活曲线右移,从而使ICa,L从失活状态下恢复明显减慢(n=7,P<0.01)。(5)酪氨酸磷酸酶抑制剂正钒酸钠(1 mmol/L)显著对抗GST引起的ICa,L抑制效应(n=6,P<0.01)。根据以上结果得出的结论是:GST抑制ICa,L加速钙通道失活和钙通道在失活状态下恢复减慢;GST对ICa,L的这种抑制作用与蛋白酪氨酸激酶(PTK)抑制有关。     

蛇肌甘油醛-3-磷酸脱氢酶的研究 Ⅱ.蛇肌甘油醛-3-磷酸脱氢酶和兔肌甘油醛-3-磷酸脱氢酶稳定性的比较

本文比较了蛇肌GAPDH和兔肌GAPDH的稳定性。发现蛇肌Apo-GAPDH的热稳定性比兔肌Apo-GAPDH和Holo-GAPDH强。蛇肌Apo-GAPDH的“熔点”为62.5℃,兔肌Apo-GAPDH的“熔点”为52.5℃。55℃蛇肌Apo-GAPDH的热失活速度比兔肌Apo-GAPDH小得多,蛇肌Apo-GAPDH活力损失一半的时间(t_(1/2))为1.2小时;兔肌Apo-GAPDH t_(1/2)为1.4分。Holo-GAPDH t_(1/2)为2.6分。热失活速度符合一级反应作图。底物存在热失活速度变小,NAD~ 对热失活的保护作用最大,当[NAD~ ]/[E]=240时,热失活速度蛇肌GAPDH小32倍,兔肌GAPDH小165倍,但蛇肌GAPDH仍比兔肌GAPDH稳定。蛇肌GAPDH与兔肌GAPDH的最适pH相同,pH稳定性蛇肌GAPDH比兔肌GAPDH强。蛇肌Apo-GAPDH在pH4.9～9.4稳定,兔肌Apo-GAPDH的pH稳定范围在pH6.1～8.1。ATP在0℃也引起蛇肌GAPDH失活,失活速度比兔肌GAPDH小。结果表明蛇肌GAPDH比兔肌GAPDH稳定性强、结构紧密、亚基间结合力强。     

甲状腺素心肌病大鼠血流动力学和心肌钠、钙电流的变化

本文旨在研究L-甲状腺素(L-thyroxine,L-thy)所致的大鼠心肌病模型上血流动力学及心室肌细胞钠电流(INa)、L-钙通道电流(ICa-L)的变化。实验大鼠随机分成两组:心肌病组和对照组。心肌病组以0.5mg/kg腹腔注射L-thy,连续注射10d,建模成功后测定血流动力学变化,然后急性酶解法分离心肌细胞,应用全细胞膜片钳技术记录心肌细胞INa和ICa-L。结果显示:(1)与对照组相比,心肌病组大鼠左心室收缩压(leftventricular systolic pressure,LVSP)、左心室发展压(left ventricular developed pressure,LVDP)和左心室舒张期室内压最大下降速率(-dp/dtmax)均显著降低(P0.01),左心室收缩期室内压最大上升速率(+dp/dtmax)也表现为降低(P0.05),左心室舒张末期压(left ventricular end-diastolic pressure,LVEDP)显著升高(P0.01);(2)与对照组相比,在去极化电位为-30mV时,心肌病组大鼠心肌细胞INa电流密度由(-21.1±6.3)pA/pF增大至(-26.2±3.2)pA/pF(n=12,P0.01),INa的激活曲线左移,失活曲线左移,去失活曲线右移;(3)与对照组相比,在去极化电位为-10mV时,心肌病组大鼠心肌细胞ICa-L电流密度由(-5.4±0.6)pA/pF增至(-7.9±0.8)pA/pF(n=12,P0.01),ICa-L的激活曲线左移,失活曲线左移,去失活曲线左移。以上结果表明,甲状腺素心肌病模型心功能与心力衰竭相似,其INa和ICa-L功能明显增强,尤其是ICa-L,提示在INa和ICa-L功能异常增强的心肌病治疗中若使用的钙通道拮抗剂带有降低心肌对Na+通透性的药物效果应更佳。     

差示扫描量热法分析Ca2+对嗜热菌来源的α-淀粉酶热稳定性的影响

采用毛细管差示扫描量热法,分析Ca~(2+)对嗜热菌Anoxybacillus sp.来源的α-淀粉酶AGXA的热稳定性的影响及其机制。脱气后的蛋白样品和缓冲液,分别加入对应的样品池和缓冲液池中,测量温度为10℃～120℃,升温速率为1℃/min。测量结果中,纵坐标为C_p,横坐标为温度,去折叠变化曲线峰最高点对应的横坐标为蛋白质去折叠温度T_m,去折叠变化曲线与对应温度的积分值为热焓变化值ΔH,范特霍夫焓变化值ΔH_v由去折叠变化曲线峰形状决定。根据改进的吉布斯-亥姆霍兹方程计算AGXA的自由能变化值ΔG,绘制AGXA自由能变化与温度关系的稳定性曲线。结果表明:有Ca~(2+)和无Ca~(2+)存在时,AGXA的ΔH_v与ΔH的比值都约等于1.0;有Ca~(2+)时,AGXA的T_m、ΔH和ΔC_p值,分别为77.8℃、292.5 kcal/mol和2.76 kcal·mol~(-1)·℃~(-1);无Ca~(2+)时,AGXA的T_m、ΔH和ΔC_p值,则分别为67.3℃、238.3 kcal/mol和3.81 kcal·mol~(-1)·℃~(-1);有Ca~(2+)时的AGXA,其T_m、ΔH值分别比无Ca~(2+)时的高,ΔC_p值则比无Ca~(2+)时的低。有Ca~(2+)和无Ca~(2+)的α-淀粉酶AGXA的热变性过程皆为不可逆的双态模式,有Ca~(2+)的AGXA,通过增大ΔH和降低ΔC_p的方式提高其热稳定性。研究揭示了Ca~(2+)提高AGXA的热稳定性机制,为进一步扩大该酶的应用提供了理论和实践支撑。     

棕色固氮菌固氮酶铁蛋白的研究(五)

应用微热量计研究了棕色固氮菌固氮酶铁蛋白与MgATP或MgADP络合的热力学状况。在25℃,1大气压下铁蛋白与MgATP饱和络合时的焓(⊿H~0)变化为-4.78千卡/摩尔,自由能(AGO)变化为-6.66千卡/摩尔,熵(⊿S~0)变化为+6.31卡·度/摩尔。在铁蛋白与MgATP络合时,随着MgATP浓度的增加,-⊿H~0也随之增加呈S型曲线,铁蛋白与MgADP饱和络合时⊿H~0为-5.45千卡/摩尔,AGO为-6.89千卡/摩尔,⊿S~0为+4.82卡·度/摩尔。熵的增加表明MgATP或MgADP与铁蛋白络合后,引起铁蛋白构型的变化。铁蛋白与MgATP或MgADP饱和络合时的TASO分别为+1.88千卡/摩尔和+1.44千卡/摩尔。     

MS/MS技术在确定清香桂碱A和A_1混晶结构中的应用

清香桂(Sarcococca ruscifolia)植物中得到一个清香桂碱A和A_1的共晶,我们通过化学及光谱方法确定了清香桂碱A_1及B的化学结构,并用MS/MS技术证实了这个混晶的结构。这几个生物碱的结构为,碱A(1)为Δ~(14,16)-3α-二甲胺孕甾二烯;碱A_1(2)为Δ~(16)-3α-甲基甲酰胺孕甾烯;碱B(5)为Δ~(16)-3α-二甲胺孕甾烯-20-酮。     

呼吸作用方程式的正确写法

有些植物生理学教科书和参考书中常将呼吸作用的反应方程式写成:C_6H_(12)O_6+6O_2→6CO_2+6H_2O+能量(686千卡),或写成:C_6H_(12)O_6+6O_2→6CO_2+6H_2O △G~0'=-686千卡。这两条写法都不够确切,因为式中前面指的都是1分子葡萄糖参加反应,而后面产生的自由能为686千卡,前后不相符。因为每摩尔葡萄糖(1摩尔葡萄糖分子含有6.023×10~(23)个葡萄糖分子)完全氧化时产生的自由能为686千卡,所以方程式应写成C_6H_(12)O_6+6O_2→6CO_2+6H_2O+能量(686千卡/摩尔);或C_6H_(12)O_6+6O_2→6CO_2+6H_2O △G~0'=-686千卡/摩尔。教师在教学中应提醒学生,切莫误解。     

烟曲霉孢子对肥大细胞活化作用的研究

目的研究烟曲霉孢子对人肥大细胞系HMC-1的活化作用。方法用加热灭活的方法制备烟曲霉孢子抗原,体外培养人肥大细胞系HMC-1细胞,检测热灭活烟曲霉孢子诱导HMC-1细胞脱颗粒β-氨基己糖苷酶释放比,酶联免疫吸附测定(ELISA)法检测HMC-1细胞培养上清中白细胞介素-5(IL-5)的释放,Realtime-PCR检测热灭活烟曲霉孢子诱导的HMC-1细胞IL-5mRNA的表达变化。结果与阴性对照组相比,热灭活烟曲霉孢子刺激后HMC-1细胞的β-氨基己糖苷酶释放比升高[(11.3%±1.2%)VS(0.5%±0.1%),P0.05],IL-5释放增加[(11.96±1.09)VS(9.00±1.36),P0.05],IL-5mRNA表达上调[(2.47±0.12)VS(0.00±0.26),P0.05]。结论热灭活烟曲霉孢子诱导HMC-1肥大细胞活化,引起细胞活化脱颗粒、合成和释放IL-5增加。