减毒沙门氏菌为载体在Vero细胞中表达新城疫病毒融合蛋白

RT PCR扩增了新城疫病毒 (NDV)F4 8E9株的融合蛋白 (F)基因并插入到 pcDNA3的CMV启动子下游 ,构建成真核表达质粒pcDNA3 F ,高压电转化dam和 phoP基因双突变株减毒鼠伤寒沙门氏菌 (ZJ111株 ) ,并直接感染Vero细胞 ,分别提取细胞总DNA和总RNA ,DIG标记探针均可检测到阳性杂交信号。FITC标记的羊抗鸡IgG进行间接免疫荧光试验 ,可检测到特异性的黄绿色荧光。ELISA检测F蛋白结果表明 ,转染后 4 8h开始表达 ,随后逐渐增多。SDS PAGE和Western印迹可检测到 5 5kD的蛋白质条带。上述试验结果证实减毒沙门氏菌不仅可将目的基因呈递给Vero细胞 ,而且还得到了转录和表达 ,表达的F蛋白具有免疫反应性 ,为研制减毒沙门氏菌为载体的口服NDVDNA疫苗创造了条件。     

减毒沙门氏菌用作重组口服活疫苗载体的研究

减毒沙门氏菌不仅被用于预防沙门氏菌的感染,还可以作为异源抗原的载体,构建成表达其它病原体保护性抗原的活疫苗,通过口服免疫获得相应局部免疫、体液免疫和细胞免疫反应。本文从其减毒机理、重组菌构建方法等方面进行综述     

6His-VP3融合蛋白的表达、纯化及其捕获细胞中相关蛋白的初步探讨

目的 研究人肝癌细胞HepG2与人胎肝细胞L-02中与VP3蛋白相互作用的蛋白组分,以探讨VP3特异性诱导肿瘤细胞凋亡的机制。方法 采用PCR方法克隆vp3的DNA片段,将其插入质粒pET-28a（＋）构建含6个组氨酸标签6His-VP3融合蛋白的原核表达载体。利用亲和层析技术制备纯化的6His-VP3融合蛋白作为诱饵,分别从肿瘤细胞HepG2及正常细胞L-02的总蛋白中,通过pull-down技术捕获与VP3相互作用的特异性蛋白质组分。结果获得了高纯度的6His-VP3融合蛋白;以其作为诱饵从HepG2细胞和L-02细胞中捕获到的与VP3作用的相关蛋白质组分存在差异。结论 肿瘤细胞HepG2及正常细胞L-02中,与VP3作用蛋白的差异与其在不同细胞中的生物学行为相对应。     

GST-HRB融合蛋白的表达与纯化

构建GST-HRB重组质粒,进行融合蛋白的表达、纯化及鉴定.利用PCR扩增及基因重组技术,以pcDNA-3.1-HRB为模板扩增出HRB全基因序列,并将其插入带有GST(谷胱甘肽巯基转移酶)标签的原核表达载体pGEX-6P-1中,构建GST-HRB融合蛋白表达质粒.然后,将重组质粒GST-HRB转化至大肠杆菌Rosseta进行融合蛋白的表达.利用GST琼脂糖珠进行融合蛋白的纯化,最后应用SDS-PAGE电泳和Western blotting鉴定纯化的融合蛋白.结果表明,成功构建pGEX-6P-1-HRB原核表达载体,表达及纯化了GST-HRB融合蛋白.     

拟南芥FT基因原核表达载体的构建、表达和蛋白纯化

FT基因是植物成花素,在植物的开花调控中起着重要作用。构建了用于原核表达的FT-eGFP表达载体,并在大肠杆菌BL21中进行重组蛋白的诱导表达。从IPTG诱导浓度、诱导时间和诱导温度等方面进行了细致的分析,最终建立了FT-eGFP融合蛋白诱导表达的优化体系:当菌液OD600=0.6-1.0时,采用IPTG1.0mol/L,在28℃诱导表达6h。摸索和建立了利用HisTrapKit标签,经过镍柱纯化,纯化目的蛋白的技术体系,为进一步研究FT基因在植物开花调控中的应用奠定了基础。     

重组人LIF融合蛋白表达纯化及其活性鉴定

目的:原核表达重组hLIF融合蛋白并进行诱导表达、纯化及活性鉴定.方法:将hLIF基因克隆至pThioHisA载体,构建融合表达载体pThioHisA-hLIF,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达.表达产物经亲和层析后,Western blot检测目的蛋白的特异性.用小鼠胚胎干细胞脱饲养层培养对纯化后的重组hLIF融合蛋白进行生物活性的鉴定.结果:降低诱导温度和延长诱导时间能增加hLIF融合蛋白的可溶性表达,纯化后的重组蛋白纯度大于95％,Western blot检测显示了良好的特异性.在脱饲养层细胞培养条件下,添加纯化的hLIF融合蛋白能够有效的维持小鼠胚胎干细胞的未分化状态.结论:重组hLIF融合蛋白可在大肠杆菌中高效表达,具有良好的特异性,为干细胞研究及hLIF蛋白的其他功能研究奠定了基础.     

含抑制素重组质粒的减毒猪霍乱沙门氏菌C500遗传稳定性研究

为了分析研究含抑制素重组质粒pVAX-IS-asd(以下简写为pXAIS)的crp(cAMP受体蛋白)和asd(天冬氨酸β-半乳搪脱氢酶)基因双缺失猪霍乱沙门氏菌C500菌株的遗传稳定性.方法:将现有的无抗性抑制素重组表达质粒pXAIS转化入crp和asd基因双缺失猪霍乱沙门氏菌C500菌株(简称"空质粒株")中,得"含质粒株".将"含质粒株"细菌在无选择压力条件下传代培养50代.利用酶切鉴定方法,分析"含质粒株"细菌中抑制素pXA/S质粒的稳定性;利用PCR方法扩增菌株("含质粒株"和"空质粒株")保守序列中invA基因,分析各代细菌的invA基因稳定性;通过比较传代培养后各代细菌的生长图型,分析"含质粒株"细菌传代后的生长规律.结果表明,"含质粒株"细菌连续传代50次后,仍能检出pXAIS质粒和invA基因,而且生长规律与"空质粒株"没有明显差异.说明含pXAIS质粒的猪霍乱沙门氏菌crp和asd基因双缺失株具有良好的遗传稳定性.     

重组GM—CSF／IL—3融合蛋白的纯化

重组粒细胞－巨噬细胞集落刺激因子／白细胞介素３（ＧＭ－ＣＳＦ／ＩＬ－３）融合蛋白是一种很有发展潜力与应用前景的重组药物,它在大肠杆菌中是以饱含体形式表达的,针对这一重组蛋白饱含体的洗涤、变性、复性以及最终的纯化过程,进行了深入地研究,重点分析和比较了不同条件及因素对于重组蛋白包含体变性及复性过程听影响。实验结果表明,８ｍｏｌ／Ｌ尿素及１０ｍｍｏｌ／Ｌ的ＤＴＴ可以使包含体充分溶解。在复性过程中,采用     

EGF-SEA融合蛋白在大肠杆菌中的表达和纯化

根据基因库中查到的金黄色葡萄球菌肠毒素A(SEA)基因序列和人体表皮生长因子(EGF)基因序列进行密码子优化,以适于大肠杆菌表达.人工合成SEA基因与EGF基因.将两目的基因克隆至原核表达栽体pFT22b中,经测序验证表明成功构建了重组表达质粒pET22b-EGF-SEA.将构建好的pET22b-EGF-SEA质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导进行表达;SDS-PAGE分析表明融合基因EGF-SEA在大肠杆菌BL21(DE3)中以包涵体的形式得到了高效表达,产物相对分子质量约为44kDa,与理论值大小一致.包涵体经洗涤,变性、复性后用His Bind Kit进行分离纯化,所得蛋白纯度≥95%.高纯度EGF-SEA融合蛋白的获得为进一步研究其生物学活性及肿瘤治疗奠定了基础.     

Memo蛋白的融合表达和纯化

目的:一些临床预后较差的恶性肿瘤一般具有很高的转移性和侵袭性,近来的研究表明,Memo蛋白与恶性肿瘤的这些特性有十分密切的关系。本研究拟克隆、融合表达和纯化Memo蛋白。方法:用PCR方法从乳腺文库中扩增Memo蛋白编码序列,并将其以正确相位与pGST载体中的GST编码序列融合,构建成重组质粒pGST-Memo。将此重组质粒转化大肠杆菌DH5α后,用谷胱甘肽-Sepharose4B纯化融合蛋白,并用Western印迹检测融合蛋白的表达。结果:构建了Memo蛋白的融合表达载体,并在大肠杆菌DH5α中得到表达,经谷胱甘肽-Sepharose4B亲和层析获得了纯化的GST-Memo融合蛋白。Western印迹检测表明,此蛋白可与GST抗体反应。结论:Memo蛋白的克隆、融合表达和纯化,为进一步研究恶性肿瘤的转移性、侵袭性及其相关机理提供了有用的材料。     

表达大肠杆菌LT-B/ST融合抗原的减毒鼠伤寒沙门氏菌株的构建

编码LT-B/ST融合抗原的基因插入pYA248载体中,构建了重组质粒pXZL66。该重组质粒转入无毒鼠伤寒沙门氏菌SR-11,ΔCya,Δcrp,Δasd菌株X4072。此无抗药性的杂合菌株X4072(pXZL66)表达的LT-B/ST融合抗原具有LT和ST抗原性而没有生物毒性,可望成为预防ETEC腹泻和相应的沙门氏菌病双价口服活疫苗候选株。     

表达SLTEC保护性抗原的重组猪霍乱沙门氏菌C500株的构建及生物学特性

摘要:【目的】 利用平衡致死系统构建表达产类志贺氏毒素大肠杆菌(Shiga-like toxin Escherichia coli , SLTEC)保护性抗原的减毒猪霍乱沙门氏菌。【方法】 构建表达SLT-IIeB－FedF的重组质粒 ,再将其电转入终宿主菌减毒猪霍乱沙门氏菌ΔasdC500株中构建成口服活疫苗株 ,经聚丙烯酰胺凝胶电泳检测SLT-IIeB－FedF融合蛋白的表达情况,并观察重组菌体外培养的稳定性。【结果】 　利用宿主-载体平衡致死系统构建了表达SLTEC保护性抗原的重组减毒猪霍乱沙门氏菌     

携带TGEV DNA疫苗减毒沙门氏菌的构建及安全性与免疫性分析

【目的】探讨以减毒沙门氏菌为载体,进行TGEV DNA疫苗口服免疫可行性。【方法】通过RT-PCR扩增TGEV四川株（SC-H）S基因5’端约2.1 kb的主要抗原位点片段,将其插入真核表达载体pVAX1,构建重组质粒pVAX-S,体外转染COS7细胞,间接免疫荧光检测S基因表达。通过电转化将pVAX-S转入减毒鼠伤寒沙门氏菌SL7207,构建SL7207（pVAX-S）重组菌,并在体外感染小鼠腹腔巨噬细胞,以RT-PCR、间接免疫荧光检测细胞内S基因的转录与表达情况。将SL7207（pVAX-S）重组菌以5×108、1×109、2×109CFU剂量口服接种BALB/c小鼠,分析其安全性,并以1×109CFU剂量的重组菌3次免疫BALB/c小鼠,通过间接ELISA检测免疫小鼠的血清IgG与肠道粘膜IgA抗体。【结果】成功构建重组质粒pVAX-S,且重组质粒能在COS7细胞中表达。重组菌SL7207（pVAX-S）感染巨噬细胞后检测到目的基因的转录、表达。小鼠口服接种不同剂量重组菌,具有良好的安全性。免疫小鼠于二免后两周可检测到针对TGEV S蛋白的特异性血清IgG与肠道粘膜IgA抗体,且三免后两周与SL7207（pVAX1）空载体免疫组间分别存在显著性差异（P<0.05）和极显著性差异（P<0.01）。【结论】携带TGEV DNA疫苗的减毒沙门氏菌小鼠试验显示了良好的免疫原性与安全性。     

Protection against murine tuberculosis by an attenuated recombinant Salmonella typhimurium vaccine strain that secretes the 30-kDa antigen of Mycobacterium bovis BCG

A recombinant (r-) Salmonella typhimurium aroA vaccine that secretes the naturally secreted protein of Mycobacterium bovis strain BCG, Ag85B, by means of the HlyB/HlyD/TolC export machinery (termed p30 in the following) was constructed. In contrast to r-S. typhimurium control, oral vaccination of mice with the r-S. typhimurium p30 construct induced partial protection against an intravenous challenge with the intracellular pathogen Mycobacterium tuberculosis, resulting in similar vaccine efficacy comparable to that of the systemically administered attenuated M. bovis BCG strain. The immune response induced by r-S. typhimurium p30 was accompanied by augmented interferon-gamma (IFN-gamma) and tumor necrosis factor-alpha (TNF-alpha) levels produced by restimulated splenocytes. These data suggest that the HlyB/HlyD/TolC-based antigen delivery system with attenuated r-S. typhimurium as carrier is capable of inducing an immune response against mycobacterial antigens.     

A recombinant Salmonella typhimurium vaccine strain is taken up and survives within murine Peyer's patch dendritic cells

The attenuated Salmonella typhimurium PhoP^c strain is avirulent but immunogenic via the oral route in mice and is attenuated in survival in macrophage cell lines. In this study, the fate of PhoP^c bacteria expressing green fluorescent protein was investigated in murine Peyer's patches. The survival of PhoP^c was monitored after orogastric inoculation of BALB/c mice. Bacteria persisted for several weeks in the Peyer's patches and were also recovered from the mesenteric lymph nodes and spleen. Confocal microscopy analysis identified dendritic cells as the Peyer's patch cell type that internalized PhoP^c expressing green fluorescent protein at early time points. In addition, live PhoP^c were found in Peyer's patch dendritic cells and not in B cells 3 days after orogastric inoculation. Taken together, these results provide strong evidence that PhoP^c is internalized and survives within Peyer's patch dendritic cells. As these cells are potent antigen-presenting cells, these data could explain the immunogenicity of S. typhimurium vaccine strains in vivo .     

携带新城疫病毒DNA疫苗的鼠伤寒沙门氏菌及其安全性与免疫效力

根据GenBank中发表的新城疫病毒(NDV)融合蛋白(F)基因序列,设计一对引物,通过RTPCR扩增出鹅源新城疫病毒分离株JS5F基因,测序确认后,将其克隆入真核表达载体pVAX1,获得重组真核表达质粒pVAX1F。将pVAX1F转化减毒鼠伤寒沙门氏菌SL7207,构建成携带DNA疫苗的重组沙门氏菌SL7207(pVAX1F)。重组菌以不同剂量口服免疫1日龄雏鸡,结果表明,细菌对雏鸡具有良好的安全性,且不影响鸡的增重。将SL7207(pVAX1F)分别以108CFU和109CFU的剂量3次口服免疫1日龄商品代伊莎褐蛋鸡,抗体检测结果显示,在三免后1周,SL7207(pVAX1F)109CFU剂量组的血清抗体效价与空载体组之间存在显著性差异(p<0.05)。重组菌两个剂量组在首免后2周开始出现粘膜抗体,并于二免后2周和3周达到较高水平。免疫保护试验结果显示,SL7207(pVAX1F)109CFU剂量组的保护率为77.27%,与空载体组之间存在显著性差异(p<0.05)。     

减毒鼠伤寒沙门菌三型分泌表达系统的构建及其特性

为开发新型重组减毒鼠伤寒沙门菌口服活疫苗载体,本研究以pYA3493质粒为基础,用鼠伤寒沙门菌sopE_(Nt100)基因及其启动子替代原有的P_(trc)启动子,构建沙门菌三型分泌表达载体pYA-sopE_(Nt100);再将质粒pYA-sopE_(Nt100)电转入沙门菌ΔcrpΔasd SL1344,构建减毒鼠伤寒沙门菌ΔcrpΔasd SL1344(p YA-sop E_(Nt100))三型分泌表达系统,研究其生物学特性,进一步将报告基因egfp克隆入sop E基因下游,构建重组菌株ΔcrpΔasd SL1344(p YA-sop E_(Nt100)-egfp),感染Vero细胞,用Western blotting分析该系统递呈外源抗原的能力。PCR、酶切及测序结果表明,减毒鼠伤寒沙门菌ΔcrpΔasd SL1344(p YA-sop E_(Nt100))三型分泌表达系统构建成功;生物学特性鉴定结果表明,其血清型与亲本株Δcrp SL1344及野生株SL1344保持一致;其生化特性与亲本株基本相近,但与野毒株相比发生明显变化;生长速度也更为缓慢;重组菌株ΔcrpΔasd SL1344(p YA-sop E_(Nt100))的LD50较野生株SL1344降低了7.0×104倍;Western blotting结果发现,重组菌培养上清中能检测到Sop E_(Nt100)-egfp融合蛋白(37 k Da);重组菌株感染Vero细胞后,可以同时检测到Sop E_(Nt100)-egfp融合蛋白(37 k Da)和EGFP蛋白(27 k Da)。以上结果证实,本研究成功构建了新型减毒鼠伤寒沙门菌ΔcrpΔasd(p YA-sop E_(Nt100))三型分泌表达系统,其能够有效递呈外源抗原,该重组菌株有潜力作为安全、稳定、高效表达外源基因的口服重组活疫苗载体。     

表达PEDV S和PoRV VP7蛋白的重组伪狂犬毒株构建

【背景】猪流行性腹泻、猪轮状病毒病与猪伪狂犬病是严重危害全球养猪业的3种重要传染病,混合感染往往导致猪场更严重的损失。【目的】利用同源重组技术构建共表达猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV) S蛋白和猪轮状病毒(Rotavirus,PoRV) VP7蛋白的猪伪狂犬三联基因工程疫苗株,并研究其部分生物学特性。【方法】通过序列比对、蛋白结构分析筛选s基因的475?804 aa和vp7基因的17?339 aa作为毒株构建的目的片段,依次构建了pMD-S、pMD-VP7、pMD-VP7.S克隆载体和pEGFP-VP7.S转移载体。将质粒pEGFP-VP7.S和PRV XJ亲本株同源重组,空斑纯化得到重组毒株PRV (CM),对其稳定性和增殖特性进行研究。【结果】构建了共表达S蛋白和VP7蛋白的伪狂犬基因工程病毒,连续传代20次,均能检测到vp7和s基因,而gE基因阴性;Western blotting证实2种外源基因在重组病毒中均能实现良好的表达;测定亲本毒株和重组毒株的TCID50分别是10?7.59/0.1 mL和10?7.25/0.1 mL。【结论】获得了伪狂犬基因工程重组弱毒株PRV (CM),外源基因稳定存在,毒力基因稳定缺失,增殖特性差异不大,为PRV、PEDV和PoRV基因工程三联苗研究奠定了基础。     

一种真核细胞分泌型重组融合蛋白rPC的构建、表达与纯化

抑制性免疫检查点PD-1或CTLA-4靶向治疗药物已用于肿瘤的临床治疗,但单一靶点药物会有耐药发生,联合使用同时封闭多个靶点可提高疗效,因此拟构建一个可封闭多个靶点的新型重组蛋白。首先设计并合成了一个由人类PD-1和CTLA-4两个受体的胞外功能域组成并且C端带6×His标签的分泌型重组融合蛋白rPC编码序列,插入真核细胞表达载体pLVX-IRES-ZsGreen1,稳定转染HEK293细胞,收集细胞培养上清,以亲和方法纯化重组蛋白rPC,通过实时荧光定量PCR检测多个人类肿瘤细胞系中PD-1配体PD-L1、PD-L2和CTLA-4配体CD80、CD86的表达,以选择相对高表达的细胞,利用细胞免疫荧光染色方法检验rPC与肿瘤细胞的结合能力,并用CCK-8法检测rPC是否对肿瘤细胞的生长有影响。结果表明,重组融合蛋白rPC可由稳定转染表达载体的HEK293细胞表达并分泌,纯化后的rPC可以与PD-1和CTLA-4配体表达相对较高的肺癌细胞NCI-H226结合,并且rPC处理对其生长并无直接影响,与预期一致。成功获得的重组融合蛋白rPC可用于进一步的体内外功能研究,也为今后研发新型多靶点肿...     

鼠伤寒沙门菌rtsB基因缺失株的构建及其生物学特性

【背景】鼠伤寒沙门菌(Salmonella typhimurium)是一种重要的人畜共患病原菌,严重危害养殖业及人类健康。调控蛋白在病原菌的生存及感染过程中发挥重要作用。【目的】构建鼠伤寒沙门菌调控基因rtsB缺失株和互补株,分析调控蛋白RstB对鼠伤寒沙门菌生物学特性和致病性的影响。【方法】利用Red同源重组的方法构建鼠伤寒沙门菌SAT52的rtsB基因缺失株,并利用互补质粒构建互补株。然后比较分析野生株SAT52、缺失株?rtsB和互补株C?rtsB的生长特性、运动性、生物被膜形成能力、黏附入侵能力、胞内存活能力及致病性的差异。【结果】缺失rtsB基因不影响SAT52的生长速度,但导致运动能力增强,生物被膜形成能力减弱。细胞感染试验结果表明,rtsB基因有助于鼠伤寒沙门菌对Hela细胞的黏附入侵及RAW264.7细胞内的存活。动物试验结果表明rtsB基因缺失显著降低鼠伤寒沙门菌的致病力。【结论】rtsB基因在鼠伤寒沙门菌感染过程中发挥重要作用,可为阐释鼠伤寒沙门菌的致病机制提供参考。