H10N8禽流感病毒感染人的分子机制和跨种间传播趋势评估方面取得新进展

<正>继2013年先后在H5N1和H7N9禽流感病毒跨种间传播研究上取得重大进展后,中国科学院微生物研究所高福课题组在H10N8禽流感病毒感染人的分子机制和跨种间传播趋势评估上取得新的突破,研究结果已经于2015年1月9日被国际著名杂志《自然通信》(Nature Communications)在线发表。自从2013年2月我国报道首例人感染H7N9禽流感病毒后,我国已经发生多起人感染H7N9禽流感病毒病例。受体结合实验表明,H7N9病毒的主要流行株系安徽株(A/Anhui/1/2013)具有双受体结合特性,既能结     

禽流感病毒基因的密码子偏好性及聚类分析

目的:研究禽流感病毒基因的密码子偏好性及进化关系,为禽流感的防控和疫苗开发提供理论基础。方法:运用多种生物信息学分析软件,对17种流感亚型病毒基因进行密码子偏好性及聚类分析。结果:H7N9亚型禽流感病毒基因偏好使用UUC、CUU、CUC、AUA、UCU、ACU、CAA和UGC等8个密码子。聚类分析表明,H7N9病毒与H7N3、H5N1、H9N2、H11N9病毒的亲缘关系最近;不同年份的H7N9亚型禽流感病毒中,H7N9(2013)病毒与H7N9(2009)病毒的亲缘关系最近,而与其他年份发生的H7N9病毒的亲缘关系均较远。结论:H7N9亚型禽流感病毒在碱基组成上偏爱使用以A或U结尾的密码子,具有独特的密码子使用特性;H7N9(2013)病毒并不是起源于以往发生过的H7N9病毒的突变,而是随病毒进化出现的新重配病毒。     

一例混合感染中H3N2和H7N9流感病毒的分子遗传特性

【目的】揭示一例混合感染中H3N2和N7N9流感病毒的分子遗传特性。【方法】通过荧光定量PCR法对标本进行流感病毒分型检测。通过二代测序技术对病毒分离物进行全基因组测序分析。【结果】2013年4月在南京市检测到一例人季节性H3N2流感病毒和禽流感H7N9病毒混合感染,混合病毒分别命名为A/Nanjing/M1/2013 (H3N2) (M1-H3N2)和A/Nanjing/M2/2013 (H7N9) (M2-H7N9)。分离株M2-H7N9 HA蛋白的Q226L位点和PB2蛋白E627K位点发生突变,增强了病毒对人体的感染能力。【结论】报道了一起人混合感染H3N2和N7N9流感病毒病例,提示人可能成为流感病毒基因“混合器”,应高度关注H7N9病毒与人季节性流感病毒的基因重配现象。     

H7N9亚型禽流感病毒非结构蛋白1(NS1)基因序列分析及2013上海分离株NS1的原核表达

目的:对2013年3月发生的感染人的新型H7N9亚型禽流感病毒的非结构蛋白1(NS1)基因序列进行同源性分析,构建NS1重组质粒并表达。方法:从GenBank获得2006~2013年不同来源的H7N9亚型病毒NS1序列,并进行同源性比较;利用PCR方法从H7N9亚型禽流感病毒株A/Shanghai/4664T/2013(H7N9)基因组cDNA中扩增得到全长NS1基因,并将该片段定向克隆到原核表达载体pET28a上,构建重组质粒pET28a-NS1,经酶切鉴定,将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞后,IPTG诱导表达,且进行Western印迹分析。结果:经序列分析,2013年暴发的H7N9型禽流感病毒的NS1基因核苷酸序列同源性为95%~100%,与之前暴发的H7N9型流感病毒NS1基因序列的同源性为86.4%~90.7%,表明2次暴发的该型流感分离株属于不同的进化分支;PCR扩增得到约680 bp的NS1基因序列,所克隆的NS1基因在原核细胞中的表达产物主要以包涵体形式存在,SDS-PAGE检测结果表明重组蛋白相对分子质量为25×103,Western印迹分析证实表达产物为H7N9禽流感病毒NS1蛋白。结论:为进一步研究H7N9亚型流感病毒NS1蛋白功能及基于NS1蛋白的抗病毒药物奠定了基础。     

人用H7N9疫苗的研究进展

2013年3月,在中国首次出现低致病性H7N9病毒感染者并致死的病例。迄今为止,中国共出现5次H7N9病毒流行的疫情。其间,H7N9病毒不断发生变异,新的基因型以及高致病性H7N9病毒相继出现。变异的H7N9病毒对禽类养殖业和人类的公共卫生造成了严重的威胁,疫苗是预防H7N9病毒流行的有效措施。目前,全世界尚无临床可用的人用H7N9疫苗,但各类备选H7N9疫苗都在研究中,如灭活疫苗、减毒疫苗、亚单位疫苗、病毒样颗粒疫苗、核酸疫苗和病毒载体疫苗等。其中,一些H7N9疫苗已进入临床研究阶段。现对各类人用H7N9疫苗的研究进展作一概述。     

苏州活禽市场禽流感病毒(H7N9)季节变化及HA、NA、PB2基因系统进化分析

自2013年3月中国首次发现新型禽流感病毒H7N9以来,其于2013-2014年期间发生流行,2015年也有散发性感染。该病毒的流行不仅危及家禽养殖业,还对公共卫生安全造成严重威胁。为调查活禽市场中H7N9的进化史和季节性变化,本研究于2013年7-12月在H7N9主要流行地区之一江苏省苏州市活禽市场采集2 655份鸡、鸭咽拭子样本,对样本中流感病毒核酸进行检测。结果显示,冬季样本中H7N9阳性率显著高于夏季样本,同时发现样本中存在H5、H7和H9亚型毒株之间的混合感染。进一步对H7N9阳性样本的HA、NA和PB2基因序列进行分析,结果表明阳性样本中HA、NA和PB2基因序列与新型H7N9病毒的相应基因序列同源,其在家禽体内传代时也在继续进化。特别是一些样品中PB2基因序列与H5N1病毒PB2基因序列的同源性较高。结果提示,苏州存在一种新型H7N9病毒基因重排的可能性,建议在活禽市场对所有禽流感病毒亚型进行持续监控,从而有助于流感病毒的及时防控。     

H7N9禽流感病毒与其他流感病毒对雪貂致病性与传播力的比较

目的针对2013年3月中国爆发的人感染H7N9禽流感病毒,在雪貂体内进行致病性及传播力的研究,并与甲型H1N1流感病毒、H5N1禽流感病毒进行比较。方法对新发H7N9毒株、甲型H1N1流感病毒、H5N1禽流感病毒感染雪貂后的临床症状、体征,呼吸道排毒情况,组织病理学变化等进行评价和比较,并对H7N9毒株在雪貂群体中的传播力进行研究。结果雪貂模型的临床症状、死亡率、病毒传播以及组织病理学分析显示:H7N9病毒的致病性低于H5N1,与2009年起源于北美的甲型H1N1流感病毒相当。新发H7N9禽流感病毒可以在雪貂的呼吸道、心脏、肝脏以及嗅球进行复制。值得注意的是H7N9禽流感可以通过飞沫在雪貂间进行低水平的传播,并且在传播过程中,病毒基因组内有多个位点的氨基酸发生了替换。结论 H7N9禽流感病毒对雪貂的致病性较H5N1禽流感病毒低,与甲型H1N1流感病毒对雪貂的致病性相当,H7N9禽流感病毒可在雪貂间进行传播。     

科研快讯

<正>《病毒学杂志》:新型H7N9病毒起源研究获进展中科院上海巴斯德研究所病原诊断技术研发中心与浙江省湖州市疾病预防控制中心在新型H7N9病毒起源合作研究中获得新进展,发现浙江湖州或是新型H7N9起源地之一。日前,相关研究成果在线发表于《病毒学杂志》。2013年2月开始,我国长三角地区暴发了由新型H7N9禽流感病毒引发的严重疫情。湖州市位于浙江省北部,地处长三角腹地,与江苏、安徽     

H7亚型禽流感病毒与禽类和人类的关系

2013年在中国首次发生了H7N9亚型流感病毒感染人事件,已经证实H7N9型禽流感是一种新型禽流感,是全球首次发现感染人类的新亚型流感病毒,以往这种病毒只在野生鸟类存在和传播。H7N9型禽流感病毒属于H7亚型中的一种,全球感染人的H7亚型病毒主要分为两大支系,即北美支系和欧亚支系,感染人的流感亚型也主要集中在H7N7,H7N3,H7N2等亚型上。为了清晰的了解H7亚型病毒的来龙去脉,本文重点讨论了A亚型流感病毒的宿主分布、H7亚型病毒感染禽类和人类的历史、H7亚型病毒的生物学特性以及未来研究展望。     

研究揭示H10N8禽流感病毒感染人的分子机制

继2013年先后在H5N1和H7N9禽流感病毒跨种间传播研究中取得重要进展后,中国科学院微生物研究所高福课题组在H10N8禽流感病毒感染人的分子机制和跨种间传播趋势评估上取得新的进展,研究结果已经于2015年1月9日在国际杂志《自然通信》(Nature Communications)在线发表。2013年12月起,我国先后发生3例人感染H10N8禽流感病毒病例,并导致2人死亡。这种能感染人的     

重组人禽流感H7N9疫苗株在Vero细胞上的适应性和传代稳定性研究

本文主要研究重组人感染高致病性禽流感H7N9株作为主工作种子批在Vero细胞连续传代中的高产特性和传代稳定性,为疫苗开发提供前期研究。将重组获得的H7N9流感病毒Vero细胞适应株(A/Anhui/1/2013Va)按照病毒感染复数(MOI) 0. 01的病毒量接种于Vero细胞,并连续传15代。血凝试验检测每代病毒血凝效价,并绘制病毒在Vero细胞上的生长曲线;每代病毒用MDCK细胞检测病毒的感染性滴度;通过单向免疫扩散试验对重组病毒H7N9的第1及第16代进行型别鉴定;取第1、5及16代病毒,用鸡胚半数感染量及致死量检测病毒在传代过程中毒力变化;分别提取第1和16代H7N9流感病毒的RNA,反转录及克隆后测序,对比病毒在连续传代过程中血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)基因的变化。试验结果表明:在连续传代过程中,病毒效价越来越趋于稳定,血凝效价稳定维持在384～448;病毒感染性滴度维持在7 Log10TCID50/mL左右;病毒在传代过程中毒力未发生显著变化; HA和NA在连续传代过程中并未出现因基因变异导致的编码氨基酸改变的状况。H7N9安徽株病毒在Vero细胞传代过程中不仅产量稳定,其毒力和基因也很稳定,可以将其作为H7N9流感疫苗候选株。     

我国首例孕妇感染高致病性禽流感(H5N1)的病原学研究

对2005年11月8日安徽省铜陵市人民医院报告的一例孕妇不明原因肺炎病例的死亡病因进行研究。采集病人的气管吸出物及血液标本,用RT-PCR和Real-ti me PCR方法检测流感病毒A/M、A/H5N1、A/H7N7、A/H9N1亚型特异性核苷酸片段;气管吸出物接种SPF鸡胚进行病毒分离,并对分离物进行鉴定和序列测定及分析;利用血凝抑制试验检测血清标本抗体。结果表明病人气管吸出物可以检测到甲型流感病毒M片段及H5亚型的特异性HA基因。2005年11月9日采集的血清标本用Real-ti me PCR检测到甲型流感病毒M基因。从病人的气管吸出物中分离到H5N1病毒(A/Anhui/1/2005),对病毒的HA基因序列结果进行分析表明病毒是禽源的,其主要依据是受体结合位点第226~228位氨基酸位点(QSG)为禽流感病毒所特异,HA受体连接肽仍为9个碱性氨基酸(LRERRRKRP);基因进化树分析显示,HA基因与禽源病毒进化距离接近。发病后7、8、9d的血清H5N1禽流感病毒HI抗体小于20。对该病例的病原学研究证明,该病例为H5N1禽流感感染病例。     

序言

<正>2003年春天,我们经历了SARS。10年后的2013年,同样不平凡。3月31日,国家卫生和计划生育委员会通报,上海市和安徽省发现3例人感染H7N9禽流感病例,其中两名患者死亡。这是全球首次报告人感染H7N9病毒病例。李克强总理强调,要加强源头控制,加强科学研究,在早发现、早报告、早诊断、早治疗上下功夫,全力救治患者,努力降低死亡率,继续确保所有患者不因费用耽误治疗。     

新型H7N9禽流感病毒的病原学研究进展

2013年初在中国长三角地区首次发现一种新的H7N9禽流感病毒可导致人的感染和死亡。该病毒是由H7、N9以及H9N2禽流感病毒重配而成,病毒传播到其他地区之后仍与当地的H9N2病毒不断重配,产生不同的基因型。H7N9禽流感病毒特殊的双受体结合特性是其突破种属屏障感染人的重要机制,也是该病毒比H5N1禽流感病毒更容易感染人的原因,这种受体特性的分子基础主要与病毒HA蛋白的Q226L和G186V突变有关。H7N9病毒对禽类不致病,但人感染后的病死率超过30%。人群没有免疫力、病毒感染所导致的免疫病理以及病毒在肺部组织的高效复制是导致人感染H7N9病毒后高病死率的重要原因。雪貂动物模型研究也表明该病毒能够在雪貂中有效复制和接触传播。因此,H7N9禽流感病毒导致流感大流行的风险不容忽视,对动物和人群中H7N9禽流感病毒的监测不容松懈。     

人感染H7亚型禽流感事件

本研究综述了自1959年以来国内外发生的人感染H7亚型禽流感事件。大多数是在家禽爆发禽流感期间,农场工人在处置感染鸡群过程中被暴露而感染;也有曾接触活禽或曾到过活禽市场而感染;有经禽流感病毒致病的哺乳动物（海豹）感染于人或实验室感染（事故）所致。引起人感染的H7亚型中已知有H7N2、H7N3、H7N7以及2013年在中国发现的新的致病亚型H7N9。H7N2、H7N3、H7N7感染以结膜炎为主,大多为轻症;而H7N9感染以严重的呼吸道感染为特征,表现为重症肺炎,呼吸窘迫综合症,病死率高达33.6%。     

新型H7N9亚型禽流感病毒多重荧光RT-PCR快速检测方法的建立

为研制新型H7N9亚型禽流感病毒快速检测试剂盒,根据GenBank中公布的新型H7N9亚型(2013年)禽流感病毒血凝素抗原(HA)和神经氨酸酶抗原(NA)的基因序列,设计两套特异性的引物和探针,建立基于TaqMan探针的多重荧光RT-PCR快速检测新型H7N9亚型禽流感病毒方法。实验结果表明,该方法灵敏度高、特异性好,能够检测到最低浓度为10拷贝/μL数量级的阳性标准品,不但能够将禽流感病毒H7亚型与H1、H3、H5、H6和H9亚型区分开,而且可将新型N9亚型禽流感病毒与原有的N9亚型区分开。采用该方法对珠海市2 700份样品的检测结果与预期结果一致,证实该方法具有较好的推广应用前景。     

广州市两株人感染H5N6禽流感病毒全基因组序列特征分析

H5N6禽流感是重要的人兽共患病,给公共卫生带来严重威胁。为研究人感染H5N6禽流感病毒的基因特征,本文对广州市两株人感染H5N6禽流感病毒进行全基因组序列扩增,应用生物信息学软件分析分子变异和遗传进化特征。结果显示:两毒株各基因片段同源性存在差异,血凝素(Hemagglutinin,HA)基因同源性最高为98.3%,PB2基因同源性最低为85.2%。A/Guangzhou/41641/2014(H5N6)病毒的HA、神经氨酸酶(Neuraminidase,NA)、聚合酶碱性蛋白2(Polymerase basic protein 2,PB2)基因与猫源毒株A/feline/Guangdong/1/2015(H5N6)亲缘关系较近,推测可能起源于共同祖先。两株病毒均为禽源高致病性病毒,HA和NA表面蛋白受体结合位点、裂解位点和耐药位点未发生变异。内部基因重要位点均有不同程度的变异,其中以41641病毒变异较大,并发生PB2蛋白E627K突变。两株病毒均发生与不同亚型病毒之间的重组现象,41641病毒的内部基因分别与H5和H9N2/H7N9发生重组,其中PB2和PB1基因分别与2013年暴发的华南分支和华东分支H7N9禽流感病毒亲缘关系相近,A/Guangzhou/37845/2015(H5N6)病毒的内部基因与H5N1/H5N6病毒发生重组。因此,广州市两株人感染H5N6禽流感病毒进化起源不同,属于两种不同的基因型,本研究推测2013年暴发的H7N9禽流感病毒在新型H5N6重组病毒的进化过程中起到重要作用。     

H7亚型禽流感病毒概述

自2002年以来,全球报道的人感染H7亚型禽流感病毒病例超过100人,波及荷兰、意大利、加拿大、美国以及英国等国家。人感染H7亚型禽流感病毒的临床表现由结膜炎至轻微的上呼吸道疾病,甚至是肺炎。2013年3月31日,中国报道了上海市和安徽省两地共3例H7N9亚型禽流感病毒(AIVs)感染死亡病例。由于从家禽中分离到的H7亚型流感病毒不断增加,而且H7亚型AIVs感染人所导致的严重的临床症状,因此该亚型流感病毒对人类健康造成严重威胁,所以我们必须提高对H7亚型AIVs的认识,并要加强人群和动物中流感病毒的持续监测以及疫苗和药物的研究,以应对可能由于H7亚型AIVs引起的流感大流行。     

H9N2型禽流感病毒传播途径分子机制的研究

选择禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)A/chicken/Zhuhai/154/2003(H9N2)(AZHl54)株作为骨架病毒,与来自A/chicken/Guangdong/SS/94(H9N2)(SS94)AIV的NA基因和HA基因进行H9N2亚型重排.动物传播性实验发现:AZH154、SS94和3株重排的H9N2亚型AIV都可以经直接接触途径传播;5株H9N2 AIV都不经过粪便接触传播;且AZH154株和重组的H9N2亚型AZH154/SSHA能经过气溶胶传播.实验结果表明:AIV(H9N2)的NA基因与该病毒气溶胶传播途径有重要关系,即2003年珠海地区AIV(H9N2)的大流行可能是因为病毒获得气溶胶传播途径的特性,且病毒的NA基因发挥了重要的作用.     

甲型N9亚型流感病毒神经氨酸酶基因进化分析

通过对甲型N9亚型流感病毒神经氨酸酶(NA)核苷酸进化趋势的研究,进而探寻2013年新型H7N9亚型禽流感病毒产生的根源。本次研究选取美国国立生物技术信息中心(NCBI)的甲型N9亚型流感病毒的NA序列,采用生物软件ClustalX 2.0和MEGA 6.0建立进化树形图。对其欧亚分支,采用BEAST软件2.1.2和Datamonkey interface在线软件,计算和分析选择压力和进化速率。采用Bioedit软件对NA的氨基酸置换熵值计算并分析。系统进化树表明2013年新型H7N9亚型禽流感病毒可划分至现代欧亚分支之内,并且该分支的每位点每年核苷酸置换速率均值为3.8354×10-3,选择压力dN/dS均值为0.140413。16、19、40、53、81、84、112、256、335、359和401的氨基酸变异位点熵值0.5。研究分析表明2013年新型H7N9亚型禽流感病毒的NA片段基因可能来自甲型N9亚型流感病毒逐步进化的结果,最早可追溯到1996年的A/duck/Siberia/700/1996(H11N9)流感毒株,新型H7N9亚型禽流感病毒来源不是来自外界环境压力引起突变的结果。