FXYD6 shRNA表达载体的构建及其在体外对胰腺癌细胞增殖的影响

目的：构建FXYD6短发夹RNA（shRNA）表达载体,体外评价其对胰腺癌细胞sw1990的增殖与FXYD6蛋白表达的抑制效果。方法：基于microRNA mir-30天然结构,设计表达4对FXYD6 shRNA的互补DNA序列,克隆入pCGM30质粒载体,连接产物转化感受态大肠杆菌DH5α,PCR法筛选阳性克隆,经酶切和基因测序鉴定;利用LipofectAMINE2000将pCGM30-FXYD6shRNA转染至胰腺癌细胞sw1990,MTT法检测转染后胰腺癌细胞增殖的变化,Western blot检测胰腺癌细胞中FXYD6蛋白表达水平的变化。结果：设计合成了4对表达FXYD6 shRNA的互补DNA序列,构建了4个表达FXYD6 shRNA的重组质粒;基因测序证实shRNA编码序列与设计的片段完全一致,酶切鉴定证实载体构建成功;体外实验表明,转染胰腺癌细胞sw1990的增殖能力和FXYD6蛋白表达水平明显降低（P〈0．05）,FXYD6蛋白表达水平随时间延长逐渐降低（P〈O．01）,但细胞增殖能力无明显变化（P〉0．05）。结论：构建了4个表达FXYD6 shRNA的重组质粒载体,可有效抑制FXYD6的表达;抑制胰腺癌细胞sw1990中FXYD6的表达可以抑制细胞的增殖,提示FXYD6可能是一个具有潜在临床应用价值的基因治疗靶点。     

neuronatin shRNA真核表达载体的构建及其生物学功能

目的:获得能持续干扰neuronatin（nnat）基因表达的细胞,观察nnat基因沉默对神经细胞发育与分化的影响,为研究基因功能奠定基础。方法:构建含nnat基因短发夹RNA(shRNA)表达质粒,将质粒转染大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞PC12,RT-PCR方法筛选出最有效干扰质粒,稳定转染PC12细胞后观察细胞表型变化,免疫荧光检测nnat蛋白表达,NGF诱导观察nnat表达下调对细胞分化的影响。结果:成功构建并筛选出有效的靶向nnat基因的shRNA真核表达载体;载体稳定转染PC12细胞之后能特异性沉默nnat基因的表达,PC12细胞长出突起,向神经元方向分化,加入诱导因子NGF后能促进突起生长。结论:nnat可能是作为神经分化抑制因子在神经发育与成熟过程中发挥作用。     

RNA干扰抑制结肠癌细胞血管内皮生长因子表达

目的 应用RNA干扰技术抑制结肠癌血管内皮生长因子（VEGF）表达。方法 将VEGF基因作为RNA干扰的靶区,通过E-RNAi网上提供的服务,设计两个特异的RNA干扰序列,将其装入含U6启动子的载体上,构建成抗VEGF基因的小发夹样RNA（shRNA）表达载体,再转染人结肠癌细胞HT29,通过RT-PCR、Northern杂交、免疫荧光和Western杂交,观察VEGF表达受抑的程度。结果 成功构建了两种抗VEGF基因的shRNA表达载体,RT-PCR、Northern杂交、免疫荧光和Western杂交,均发现其能明显抑制HT29细胞VEGF基因的表达,抑制率分别达42%、88%、73%和82%。结论 针对VEGF基因的shRNA表达载体能够明显抑制结肠癌细胞VEGF基因的表达。     

AAV介导的RNAi对SARS-CoV-2 S基因表达的抑制作用

旨在研究AAV介导shRNA在体内、体外特异性抑制SARS-CoV-2 S基因的表达,为抑制SARS-CoV-2感染提供参考。设计了7条靶向SARS-CoV-2 S基因的shRNA,分别构建了shRNA1-7的质粒表达载体,与S基因表达载体共同转染体外培养细胞,通过qRT-PCR和Western blot分析其对S基因表达的抑制作用,筛选出抑制效率最高的shRNA1;构建包装表达shRNA1的重组腺相关病毒(rAAV)载体,将rAAV-shRNA1与S基因表达质粒共同转导293T细胞,S基因表达的抑制率为65.6%;两者通过滴鼻或肌肉注射方式共同转导小鼠,qRT-PCR检测其在体内对S基因表达的抑制率分别为36.8%和90.3%。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF2～4特异siRNA的筛选及其抑制病毒复制效果的研究

RNA干扰（RNAi）技术是基因功能研究的有效工具,为了了解猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）次要结构蛋白GP2、GP3、GP4在病毒复制中的作用,针对各自的编码基因ORF2、ORF3、ORF4分别选取4个小干扰RNA（siRNA）位点（共12个）,构建相应的短发夹RNA（shRNA）表达载体,转染MARC-145细胞后,通过荧光定量PCR和病毒滴度检测干扰效果。筛选了可以减少GP2、GP3、GP4相应基因mRNA含量的ORF2、ORF3、ORF4特异shRNA表达载体,病毒效价滴定表明shRNA表达载体处理细胞可以减少GP2、GP3、GP4相应基因mRNA含量,细胞培养上清中的病毒滴度比对照低184～4.65倍。     

Livin shRNA质粒载体的构建及评价

目的:构建有效的Livin shRNA重组质粒.方法:设计、合成Livin shRNA,与pGenesil-1质粒载体链接构建重组质粒,通过酶切电泳、基因测序证实是否正确构建,通过转染高表达Livin的大肠癌HT-29细胞检测Livin mRNA下降水平,筛选出最佳的shRNA.结果:重组质粒pGenesil-shRNA经酶切电泳、基因测序证明寡核苷酸片段成功插入预计位点,且序列与我们设计合成的完全一致;重组质粒载体转染HT-29细胞后,肿瘤细胞Livin mRNA含量较转染前及对照组均有明显的下降(p＜0.01),其中尤以Livin1抑制作用明显,抑制率达到66%.结论:我们正确构建了Livin ShRNA重组质粒,且制备的shRNA能有效抑制Livin基因的表达,为探讨针对Livin基因的RNAi对肿瘤的治疗奠实验基础.     

针对核因子-κBP65基因的短发夹干扰RNA逆转录病毒载体构建与鉴定

目的：构建针对人核因子κB亚基P65基因mRNA的短发夹干扰RNA（shRNA）逆转录病毒表达载体,并探讨小干扰RNA（siRNA）靶向抑制NF—κB P65基因表达的作用。方法：根据shRNA设计原则,在人NF-κB P65全长序列中选取含19个核苷酸靶序列,设计形成siRNA的DNA模板并克隆到shRNA表达载体pSUPER．retro．neo中,构建针对NF—κB P65基因的shRNA表达载体。经293A细胞包装,并感染NIH3T3细胞进行病毒滴度测定后,感染THP-1细胞。分别采用RT—PCR和Western blot从mRNA和蛋白水平检测干扰效果。结果：限制性酶切和基因测序证实针对人NF-κB P65亚基的shRNA表达逆转录病毒载体成功构建;其感染THP-1细胞后,NF—κB P65的mRNA和蛋白表达明显抑制。结论：成功构建了NF-κB P65 shRNA逆转录病毒表达载体,该载体能高效感染THP-1并明显抑制NF—κB P65的表达。     

维甲酸受体β基因RNAi表达质粒的构建及其对A549细胞增殖和分化的影响

目的：利用RNA干扰（RNAi）技术,构建针对维甲酸受体（RAR）β基因的小干扰RNA（siRNA）表达质粒,诱导RARβ基因沉默,并观察其对肺癌细胞A549株的细胞周期和增殖的影响。方法：依据设计siRNA的原则。针对人RARβ的mRNA序列,设计并合成编码siRNA的2条寡核苷酸序列,经退火成互补双链,再克隆到pSUPER-NEO-GFP真核表达载体中构建重组体pSUPER-RAR[β转染至A549细胞中,以空质粒和RARβ高表达质粒转染为对照,用Western印迹检测RARβ基因的表达,并采用M1Tr试验检测转染后细胞株的增殖和细胞分化情况。结果：表达人类RARβ基因的siRNA重组表达质粒构建成功;MTT试验结果表明,转染的A549-RARβ-si细胞增殖能力降低。结论：采用RNAi技术特异阻断RARB基因表达,通过转染A549细胞,可使其细胞形态发生变化,并抑制其细胞生长。     

RNA干扰Ezrin体外对肾癌细胞株786-0增殖、凋亡的影响

目的：构建膜- 细胞骨架联接蛋白Ezrin 基因特异性短发卡RAN 表达载体（small hairpin RNA,shRNA）,探讨其对肾癌细胞株786-0 细胞凋亡、增殖的影响。方法：以Ezrin 为靶基因,以Pgenesil-1 质粒为载体,设计和构建重组体,设计2 条发夹式RNA（shRNA）,合成后克隆入载体Pgenesil-1,扩增并中量提取质粒,应用脂质体Lipofectamine 2000 转染进786-0 细胞,重组质粒转染786-0 肾癌细胞株,用运实时荧光定量PCR 进行筛选鉴定,筛选出抑制率较高的重组质粒载体shRNA-Ezrin1,用shRNA-Ezrin1转染786-0 细胞,采用MTT、流式细胞仪、电镜检测,观察RNA干扰Ezrin 后肾癌细胞株786-0 细胞增殖能力的改变。结果：shRNA干扰后786-0 细胞增殖活性减弱,G0/G1时段明显延长（P〈0.01）,PI缩短（P〈0.01）,细胞凋亡率增加（P〈0.01）。结论：Ezrin与肾癌细胞凋亡、增殖有关,有望成为肾癌基因治疗的一个新靶点。     

靶向bmi-1真核表达载体的构建及对SW480细胞的增殖研究

目的:构建针对原癌基因bmi-1的shRNA逆转录病毒表达载体,检测它对大肠癌细胞株SW480增殖的影响.方法:利用载体介导的RNA干扰技术,设计、合成靶向bmi-1基因、编码短发夹RNA的寡核苷酸序列,并设计无义对照序列,构建重组载体pSIREN-bmi-1及pSIREN-bmi-1-c,载体经脂质体2000介导转染SW480细胞,经MTT检测,观察bmi-1表达受抑后对细胞增殖的影响.结果:成功构建了针对bmi-1基因的shRNA表达载体.结论:针对bmi-1基因的shRNA表达载体能够明显抑制结肠癌细胞SW480的增殖能力.     

DLC-1基因表达对结肠癌细胞侵袭转移能力的影响

目的:研究DLC-1基因对结肠癌细胞侵袭迁移能力的影响.方法:将DLC-1 shRNA(短发夹状RNA,short hairpin RNA)序列克隆到质粒pGCsi-U6/Neo载体,采用脂质体介导的转染方法将构建的DLC-1 shRNA表达质粒转入结肠癌细胞系LoVo细胞.采用RT-PCR技术和Western Blot技术分别检测LoVo细胞中DLC-1mRNA和蛋白表达水平的变化.Transwell小室人工重组基底膜侵袭转移实验观察LoVo细胞侵袭迁移能力的改变.结果:结肠癌细胞系LoVo细胞表达DLC-1分子.所构建质粒表达载体能有效地干扰LoVo细胞DLC-1 mRNA和蛋白质表达水平;Transwell小室人工重组基底膜侵袭转移实验结果显示,转染后LoVo细胞侵袭转移能力明显增强(p＜0.05).结论:结肠癌细胞系LoVo细胞表达DLC-1基因,应用RNAi技术可特异性降低其表达.DLC-1的表达水平与结肠癌细胞侵袭转移相关.     

小干扰RNA靶向EGFR基因逆转卵巢癌细胞顺铂耐药的研究

目的：探讨载体表达的小干扰RNA（siRNA）影响卵巢癌耐药细胞株EGFR基因的表达并逆转其顺铂耐药的可行性。方法：体外构建EGFR小发卡状RNA（shRNA）的表达质粒,脂质体法介导将其转染入SKOV3/DDP细胞。实验分为正常对照组、空质粒转染组、非特异性转染组和特异性转染组。采用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测EGFR mRNA的表达;使用免疫细胞化学法（ICC）检测EGFR蛋白的表达;使用四甲基偶氮唑蓝法（MTT）测定各组细胞对顺铂的半数抑制浓度（IC50）。结果：EGFR shRNA转染组细胞EGFR mRNA的表达与其他两组相比明显减弱（P〈0.01）,EGFR蛋白表达明显下调（P〈0.01）;顺铂敏感性比正常对照组提高了约2.5倍。结论：针对EGFR合成的siRNA能够有效地抑制EGFR mRNA和蛋白的表达,并能恢复其对顺铂的敏感性。应用RNAi技术,能够逆转卵巢癌细胞对化疗药物的耐药性。     

靶向白介素-1α基因沉默的Hela229稳定细胞系的构建

目的：构建针对IL-1α基因的shRNA表达载体,筛选能够抑制Hela229细胞内源性IL-1α表达的shRNA,建立无内源性IL-1d表达的Hela229稳定细胞系.方法：根据shRNA的设计原则,以IL-1 αcDNA oligo为模板设计一段21 bp核苷酸目标序列,构建成siRNA的DNA模板并克隆到shRNA表达载体pRNAT-U6.1/Neo中,获得靶向抑制IL-1α基因的重组shRNA质粒,转染Hela229细胞,经G418筛选后获得单克隆稳定细胞株,用ELISA方法在蛋白水平上检测IL-1α基因的沉默效果.结果：经酶切鉴定和测序分析确定IL-1 α-shRNA重组质粒构建正确,ELISA筛选出能够显著抑制内源性IL-1α表达的shRNA,获得沉默内源性IL-1 α表达的单克隆稳定的Hela229细胞株.结论：靶向IL-1α基因的重组shRNA表达质粒可显著抑制Hela229细胞内源性IL-1α的表达,成功构建靶向IL-1α基因沉默的Hela229稳定细胞系.     

人类成肌发育候选基因ASB12 RNAi稳定细胞系的构建与鉴定

目的:利用siRNA表达载体构建抑制人类成肌发育候选基因ASB12表达的pSUPER RNAi载体(pSU-PER-ASB12),筛选构建C2C12-pSUPER-ASB12稳定表达细胞系。方法:化学合成一对编码短发夹RNA序列的、靶向成肌发育候选基因ASB12的寡核苷酸链60个碱基,退火,克隆到经BglⅡ、XhoⅠ双酶切的pSUPER质粒上,构建重组RNAi质粒(pSUPER-ASB12)。通过酶切鉴定及测序分析检测构建效果。将正确构建的质粒转染小鼠骨骼肌细胞C2C12,通过G418筛选,免疫荧光检测,RT-PCR分析,建立稳定表达pSUPER-ASB12的细胞系C2C12-pSUPER-ASB12。结果:pSUPER-ASB12载体经酶切鉴定及测序分析,结果表明60个碱基成功插入到预计位点,并且序列完全一致。C2C12-pSUPER-ASB12稳定表达细胞系可表达绿色荧光蛋白,RT-PCR检测结果显示C2C12-pSUPER-ASB12细胞中ASB12表达量明显降低。结论:靶向ASB12的pSUPER RNAi载体和C2C12-pSUPER-ASB12稳定表达细胞系构建成功,为进一步从分子水平探讨ASB12在成肌发育中的功能奠定了基础。     

Bcl-2/C-Raf双基因“敲低”抑制人结肠癌细胞增殖

 RNA干扰是一种具有序列特异性的基因沉默,能够触发具有相应序列的mRNA的降解.构建具有双靶点的RNAi质粒表达载体,与单靶点表达载体比较,探讨其对结肠癌细胞增殖的抑 制作用.本研究分别构建了针对Bcl-2、C-Raf 和Bcl-2/C-Raf靶基因的质粒表达载体,通过Lipofectamine TM2000介导转染人结肠癌细胞系HCT-8后,检测相应转染组靶基因的mRNA和蛋白质表达量,测定各组细胞活性,研究RNAi对各组癌细胞增殖的抑制率.结果表明,分别转染3种质粒表达载体后,3组结肠癌细胞中相应靶基因的mRNA和蛋白质表达量均降低;转染双靶点干扰质粒的试验组;其细胞活性低于单靶点组;对于针对Bcl-2, C-Raf和Bcl-2/C-Raf基因的3组干扰实验,RNAi对结肠癌细胞增殖的抑制率分别为43.87%,40.64% 和63.85%.RNAi是结肠癌细胞中的一种功能途径,以质粒作为表达载体,同时具备Bcl-2/C-Raf双靶点的表达载体,对结肠癌细胞增殖的抑制作用要明显优于单靶点表达载体,双靶点质粒表达载体在结肠癌的基因治疗中是有潜力的.     

RNA干扰PLCε诱导人膀胱癌BIU-87细胞凋亡的实验研究

目的探讨以RNA干扰沉默人源磷脂酶Ce(phospholipase Cepsilon,PLCε)基因表达后诱导人膀胱癌细胞株BIU-87细胞凋亡的作用和机制。方法脂质体介导重组阳性质粒pGenesil-PLCε(以下简称P)和阴性质粒pGenesil-NP(以下简称NP)转染BIU-87细胞48h后,用RT-PCR和Western blot检测转染前后PLCεmRNA和蛋白表达,流式细胞术检测细胞周期和细胞凋亡率,电镜观察细胞形态改变。结果转染P质粒后可明显抑制PLCεmRNA和蛋白表达水平,抑制率分别为78.7%和76.6%;流式细胞术显示P质粒转染组细胞周期发生改变呈明显G0/G1期阻滞,并出现亚二倍体凋亡峰,细胞凋亡率增加(P0.05);电镜观察P质粒转染组细胞可见凋亡小体。结论:RNA干扰沉默PLCε基因表达可诱导膀胱癌BIU-87细胞凋亡,其作用机制与细胞周期分布的改变有关。     

人sTNFR1基因的克隆以及在NIH3T3细胞中的稳定表达

以He1a细胞的总RNA为模板,用RT—PCR方法扩增sTNFR1全编码区基因片段,构建含有目的片段的T载体克隆及真核表达载体pcDNA3．1（-）重组质粒亚克隆,将重组质粒和脂质体共同转染NIH3T3细胞系,G418筛选稳定转染细胞株．经核苷酸序列测序和酶切鉴定,成功构建了pcDNA3．1（-）-sTNFR1真核表达质粒,脂质体法建立了高效表达sTNFRI的稳定转染细胞系,并经RT—PCR和Western Blotting鉴定．人sTNFR1基因能在NIH3T3细胞系中稳定表达,为今后的研究打下了基础．     

反义细胞周期蛋白E真核表达载体的构建及其对体外人乳腺癌细胞的抑制作用

 为了探讨细胞周期蛋白 E(cyclin E)与人乳腺癌细胞恶性特征间的相关性 ,利用反义 RNA抑制基因表达的技术 ,构建了细胞周期蛋白 E反义 RNA的真核表达载体并转入人乳腺癌细胞中 .通过 G41 8筛选出阳性克隆 ,经 PCR和 Western印迹检测 ,确定细胞中含有重组质粒 ,并且细胞周期蛋白 E蛋白的水平明显降低 ,由此获得了反义 RNA表达载体导致的细胞周期蛋白 E表达受抑制的细胞 .细胞模型建立后 ,观察分析了细胞形态 ,细胞生长的血清依赖性以及软琼脂成集落能力 ,与对照细胞相比所发生的变化 .结果显示 ,细胞周期蛋白 E受抑制后 ,乳腺癌细胞体积变大 ,细胞生长对血清依赖性增加 ,低血清培养到第 6d时 ,细胞密度约为对照细胞的五分之一 ,细胞成集落能力也显著下降 ,软琼脂中克隆形成率下降 57% .这些变化都表明乳腺癌细胞恶性程度由于细胞周期蛋白 E表达受抑制而减弱 ,可以推测 cyclin E与乳腺癌细胞的恶性增殖及非锚定依赖性生长有着明显的关系 .     

人CD46 RNAi 逆转录病毒载体系统的构建与鉴定

目的:构建并筛选携带针对CD46基因的pSUPER retro RNAi逆转录病毒载体,从而特异、有效地抑制人CD46mRNA水平。方法:利用DNA重组技术,将2条60nt能转录产生靶向CD46小发夹RNA(shRNA)的寡核苷酸序列,定向克隆入逆转录病毒载体pSUPER retro,并转化大肠杆菌JM109。结果:重组载体经PCR及限制性内切酶酶切鉴定初步成功后送测序,结果表明序列正确。结论:特异性沉默CD46基因的pSUPER retro RNAi逆转录病毒载体构建成功,为后续转染Jurkat细胞,研究CD46在T细胞的信号转导中的作用奠定了基础,对进一步研究T细胞相关疾病及开展细胞免疫缺陷的治疗方面提供了新的思路与方向。