椰心叶甲CYP4基因的克隆及绿僵菌侵染后的诱导表达研究

根据细胞色素P450家族4（CYP4）的氨基酸保守序列设计1对简并引物,从椰心叶甲Brontispa longissima成虫总RNA中扩增得到5个cDNA片段（GenBank登录号: DQ238840－DQ238844）。以3′-RACE法获得片段BLWH4的3′端序列,推导的氨基酸序列表明其结构中含有CYP家族的特征性保守序列： 螺旋K区的ETLR和血红素结合区的F××G×××C×G。以18S 为对照的RT-PCR分析表明,BLWH4在成虫的mRNA表达量远大于幼虫。绿僵菌Metarhizium anisopliae菌株MA-3和MA-4侵染椰心叶甲成虫及5龄幼虫后,BLWH4的mRNA表达增强,提示BLWH4可能具有增强椰心叶甲抵抗绿僵菌侵染的作用。     

海南椰心叶甲病原菌金龟子绿僵菌的分离、鉴定及其生防潜力

椰心叶甲[Brontispa longissima（Gestro）]是椰子的重要害虫,近年来,该虫在海南岛发生普遍,椰子受害严重。由于椰心叶甲受到自然界中某些致病微生物的侵袭,在受害的椰子树心叶上常可发现椰心叶甲僵虫,并发现大部分僵虫表面长出了霉菌,本研究的目的在于从椰心叶甲僵虫表面的霉菌中分离出绿僵菌,并对分离菌株进行鉴定和致病性测定。从僵虫表面刮下孢子或菌丝体,置于绿僵菌选择性培养基（DOA）上培养,挑出真菌菌落,经纯化后,进行生物学特性、菌落生长速率及产孢量的测定,并从PPDA、OMA、VSA和PDA中筛选菌落生长及产孢最适培养基,同时对所分离的菌株进行对椰心叶甲的致病性测定。结果表明,所有分离菌株均鉴定为金龟子绿僵菌[Metarhizium anisopliae（Metschnikoff）],PPDA是菌落生长及产孢的最适培养基,大多数菌株对椰心叶甲有较强的致病力。选取强毒菌株MA4在田间进行防治效果的初步测定,结果表明,该菌株能显著降低椰心叶甲成虫的虫口密度。这些金龟子绿僵菌菌株是首次从海南的椰心叶甲僵虫中分离到的昆虫病原真菌,该菌对海南的椰心叶甲具有很好的生防潜能。     

椰心叶甲的生物防治

椰心叶甲是近年来传入我国的危险性有害生物.1994年,我国内陆将椰心叶甲列为禁止入境的二类植物检疫危险性害虫.目前椰心叶甲在我国海南省、广东省、台湾省和香港地区危害严重并有蔓延趋势,严重危害了椰子、槟榔等棕榈科植物.针对椰心叶甲的危害特征,在实际防治应用中,化学防治,物理防治等方法不能起到很好的效果,生物防治是比较重要的防治方法.本文综述了对于椰心叶甲生物防治常用的几种防治方法:释放寄生蜂、病源微生物和生物农药等.椰心叶甲的生物学防治措施,关键是开发新的防治措施和提高现有方法的防治技术,达到持续有效控制.     

入侵害虫椰心叶甲的研究进展

近30年来,椰心叶甲Brontispa longissima(Gestro)在亚太椰子产区扩散蔓延,成为棕榈植物上主要害虫。2002年,该害虫入侵我国海南并暴发成灾。化学防除是控制椰心叶甲危害的首要措施,其中包括挂药包等农药缓释技术,而生物防治是控制该虫扩散蔓延的经济有效措施。从感病椰心叶甲虫体上分离的微生物杀虫剂绿僵菌Metarhizium anisopliae被我国和其他多个国家应用。椰心叶甲天敌寄生蜂的引进利用是可持续控制该害虫发生的重要措施。幼虫寄生蜂椰甲截脉姬小蜂Asecodes hispinarum和蛹寄生蜂椰心叶甲啮小蜂Tetrastichus brontispae是椰心叶甲的两种重要天敌。2004年,椰甲截脉姬小蜂和椰心叶甲啮小蜂被引入到我国,经扩繁释放后,取得了良好的控害效果,其中有些地区的椰甲截脉姬小蜂寄生率可达90%,椰心叶甲啮小蜂寄生率可达100%。连续放蜂,且椰心叶甲种群有合适虫龄被寄生蜂寄生是控害效果的关键。气候等生态因子也可能是影响寄生蜂控制靶标害虫效果的因素,应进一步加强研究。论文最后提出了未来椰心叶甲防控的研究的方向。     

绿僵菌属的三个新种

作者从广东、贵州、北京等地收集的虫生真菌中,发现在我国具有绿僵菌属特征的真菌可分为四个种。根据菌落颜色、分生孢子团块大小、紧密和牢固程度、孢子链连接方式、分生孢子形状等,将我们收集的属于本属的菌株分为四个种。本文报道绿僵菌属三个新种的描述。金龟子绿僵菌Metarhizium anisopliae(Metsch.)Sorokin为最常见的甘蔗金龟子致病菌,是本属的模式种。平沙绿僵菌Metarhizium pingshaense Chen et Guo sp.nov.、柱孢绿僵菌Metarhizium cylindrosporae Chen et Guo sp.nov.和贵州绿僵菌Metarhizium guizhouense Chen et Guo sp.nov.是三个新种。     

椰心叶甲危害对椰树心叶挥发物的影响

[目的] 探讨椰心叶甲取食危害对椰树心叶挥发物的影响,探讨两者之间入侵前后的相互机制,通过化学生态学的方法对椰心叶甲-寄主-天敌（或其他害虫）三级关系加以理解。[方法] 采用自动热脱附仪-气相色谱仪-质谱仪（TD-GC-MS）技术测定椰树健康心叶和受害心叶中挥发性物质。[结果] 椰心叶甲取食诱导椰子心叶挥发物发生明显变化,挥发物烃类化合物及其衍生物变种类有不同程度增加,其中环烃和无环烃变化最明显,椰心叶甲取食明显提高寄主植物心叶挥发物中的1,2,4-Metheno-1H-indene,octahydro-1,7a-dimethyl-5-（1-methylethyl）-,[1S-（1a,2a,3aβ,4a,5a,7aβ,8S^*）]-、Copaene、Caryophyllene、Muurolene含量,降低寄主植物心叶挥发物中的Heptadecane,2,6,10,14-tetramethyl-含量。[结论] 椰心叶甲危害寄主后,寄主产生挥发物变化可能导致对椰心叶甲天敌的吸引力减弱,也可能吸引其他害虫,如椰子织蛾,从而造成互利入侵。     

绿僵菌属的一个新种

本文报导从贵州省贵阳罹病梨虎Rhynchites Coreanus Kono幼虫虫尸分离的一种绿僵菌新种的鉴定结果,该菌与绿僵菌属模式种金龟子绿僵菌Metarhizium anisopliae (Metsch) s-orkin 有明显区别,根据菌落颜色、分生孢子团块大小、连接紧密和牢固程度、孢子链连接方式和分生孢子形态等,我们鉴定为新种——翠绿绿僵菌Metarhizium iadini chen、Guo et zhou sp.nov.     

低温贮存对椰心叶甲啮小蜂品质的影响

研究低温贮存椰心叶甲蛹Brontispa longissima(Gestro)和椰心叶甲僵蛹对椰心叶甲啮小蜂Tetrastichus brontispae Ferriere种群品质的影响。寄生10℃低温贮存1~4日龄椰心叶甲蛹结果表明,1日龄椰心叶甲蛹的寄生率、羽化率、出蜂率、单蛹出蜂数、后代寄生能力均优于其他日龄,其次为2、3日龄的椰心叶甲蛹,最差为4日龄的椰心叶甲蛹。1日龄椰心叶甲蛹在10℃下贮存5,10,15,20d后,上述生物学指标和种群参数均随贮存天数增加而降低,其中以5d和10d的净生殖率、内禀增长率和周限增长率较未经低温贮存的差异小。1~11日龄椰心叶甲僵蛹于10℃贮存10d的结果表明,8日龄椰心叶甲僵蛹的雌蜂寿命、羽化率、单蛹出蜂数、寄生能力均优于其他日龄僵蛹。8日龄椰心叶甲僵蛹在10℃下贮存5,10,15,20d后,上述生物学指标和种群参数均随贮存天数增加而显著低于对照。     

绿僵菌属的修订

本文报道绿僵菌属的修订和修订后本属区分种的主要标准。这对于自然界本属复杂类群的研究将起到新的推动和助益。     

椰心叶甲啮小蜂的繁殖生物学研究

对椰心叶甲啮小蜂羽化、求偶、交配、产卵、繁殖现象进行了观察研究。结果表明,补充营养对雌蜂的寿命和繁殖力均有影响。没有补充营养的情况下,雌蜂的平均寿命为2.48 d,一生可产21.43粒卵;每天补充10%蜜糖水,且雌蜂与寄主(椰心叶甲初蛹)比例为1:3时,雌蜂平均寿命为13.43 d,一生可产53.6粒卵;每天补充10%蜜糖水,且雌蜂与寄主(椰心叶甲初蛹)比例为1:1时,雌蜂平均寿命为14.78 d,一生可产42.5粒卵。椰心叶甲啮小蜂对水椰八角铁甲蛹的寄生率为82.25%,平均每寄主出蜂量为12.24头。     

阿维菌素对椰心叶甲的毒力和防治效果

试验研究阿维菌素对椰心叶甲Brontispa longissima(Gestro)各虫态的毒力以及田间防治效果。结果表明阿维菌素对椰心叶甲毒力作用强,对卵、幼虫、蛹、成虫的LD50分别为8·119×10-6,4·152×10-6,9·458×10-6,7·609×10-6,8·434×10-6μg/头,LD90分别为1·044×10-4,5·545×10-5,6·663×10-5,1·466×10-4μg/头。1·8%超强阿维菌素乳油对椰心叶甲防治效果好,且持效期长。使用后半个月到1个月1000倍液、2000倍液对各虫态的防治效果接近100%。     

椰心叶甲天敌垫跗螋的生物学研究

垫跗螋Chelisoches morio (Fabricius)是入侵害虫椰心叶甲Brontispa longissima (Gestro)的一种本地天敌.为了了解垫跗螋的生物学习性和控害潜能,本文对垫跗螋的形态特征、生长发育、重要生物学习性以及对椰心叶甲的捕食选择性和捕食量进行了观察研究.垫跗螋雌成虫将产的卵堆积在一起,抱孵在体下,且不时用口器翻动重排卵,受到惊扰时会吃掉卵,甚至初孵的若虫.在室温条件下(20±2)℃,以椰心叶甲2龄幼虫为食料,垫跗螋从卵至成虫的平均发育历期为(107.9±15.2)d;平均每头雌虫产卵量为(138.7±59.5)粒;垫跗螋成虫对椰心叶甲2龄幼虫的日平均捕食量为(6.7±1.1)头.寄主龄期选择性实验表明,垫跗螋成虫和4龄若虫喜欢取食椰心叶甲的2龄幼虫;3龄和2龄若虫喜欢取食椰心叶甲的1龄幼虫.     

棕榈科植物有害生物椰心叶甲的风险性分析

运用有害生物危险性分析(Pest Risk Analysis,PRA)的方法,从国内分布状况、潜在危害性、寄主植物经济重要性、传播扩散的可能性,以及危险性的管理难度等方面,综合评价了椰心叶甲的危险性。结果表明椰心叶甲对我国是具高度危险性的有害生物。     

金龟子绿僵菌原生质体的制备和再生及其羟化酶活性研究

对金龟子绿僵菌(Metarhizium anisopliae)原生质体的制备和再生的影响因素进行实验,并在此基础上考察了甾体底物对原生质体羟化酶的诱导作用。结果表明,原生质体制备的合适条件是:42 h的菌丝体用纤维素酶(10 mg/mL)和蜗牛酶(5 mg/mL)的混合酶在含有0.8 mol/L甘露醇的pH 5.8磷酸缓冲液中,28℃震荡(80 r/min)酶解3 h,原生质体产量可达到6.12×10~7/mL,在含有0.6 mol/L KCl的双层马铃薯培养基上再生率达到7.79%。经过6 h底物诱导的菌丝体制备的原生质体细胞色素P450的表达量比没经过诱导的菌丝体制备的原生质体高约40%,证明该菌羟化酶系统的可诱导性。由于没有细胞壁的阻碍经过底物诱导的原生质体能够高效的将底物转化为产物,且副产物相对较少。     

绿僵菌对小麦纹枯病菌的抑制作用研究

在实验室条件下,研究了金龟子绿僵菌（Metarhizium anisopliae）对小麦纹枯病菌（Rhizoctonia cerealis）的拮抗作用及其机理。结果表明,金龟子绿僵菌与小麦纹枯病菌对峙培养以及在培养基中加入金龟子绿僵菌孢子悬浮液,对小麦纹枯病菌菌丝生长均有较好的抑制作用。测定了培养不同天数的金龟子绿僵菌Ma55发酵液对小麦纹枯病菌菌丝生长、菌核产生量及菌核萌发率的影响。结果表明,液体振荡培养25 d的金龟子绿僵菌Ma55发酵液对小麦纹枯病菌的菌丝生长、菌核产生量及菌核萌发具有显著的抑制作用,且Ma55发酵液中的抑菌活性物质具有较好的热稳定性。在光学显微镜下,未观察到Ma55对小麦纹枯病菌的重寄生现象,但发现金龟子绿僵菌与小麦纹枯病菌对峙培养处小麦纹枯病菌营养菌丝的细胞质变稀薄、菌丝部分消解或断裂。上述结果显示,金龟子绿僵菌对小麦纹枯病菌的拮抗机制主要是营养竞争、空间竞争及抗生作用等。     

Water content and water activity for the production of cyclodepsipeptides in solid-state fermentation by Metarhizium anisopliae

Metarhizium anisopliae was grown by solid-state fermentation on a series of compositions of rice, rice bran, or rice husk media for the production of cyclodepsipeptides, destruxins A and B. The best yield for destruxin A and destruxin B were 2.9 mg kg^–1 substrate and 227 mg kg^–1 substrate, respectively, after 14 days cultivation with rice/bran/husk medium at 71% water content together with water activity of 0.921.     

绿僵菌Ma83几丁质酶的发酵研究

本实验从虫生真菌中筛选出金龟子绿僵菌M a83菌株,它的几丁质酶合成能力最强。其产酶的适宜条件是,碳源为胶体几丁质加葡萄糖,氮源为NaNO3,培养温度为28℃,培养基起始pH 6.0;接种量为5 mL液态种,最适装液量为5 mL,添加维生素C可以提高酶活;正交实验表明培养因子的最佳组合是:NaNO31 g/L,胶体几丁质0.6 g/L,酵母膏0.05 g/L,葡萄糖0.10 g/L。根据液态培养产酶过程结果可知,当M a83菌培养6天时,几丁质酶活力达到8.1 U/mL。     

Efficacy of Metarhizium anisopliae microsclerotial granules

The entomopathogenic fungus Metarhizium anisopliae has very recently been shown to produce microsclerotia (MS) – compact, heavily melanised, hyphal aggregates – in liquid media. Soil incorporation bioassays of dried MS preparations of three isolates of M. anisopliae were conducted using third instar Tetanops myopaeformis (sugarbeet root maggot) in clay and/or clay loam field soils as a model system to demonstrate efficacy. At rates as low as 23 mg MS granules/100 g dry soil, the biocontrol efficacy of MS granules of M. anisopliae Strain F52 produced in liquid media with a high carbon concentration (36 g/L) and high C:N ratios (30:1, 50:1) were superior to MS preparations produced in low carbon (8 g carbon/L) media and a high carbon medium with a 10:1 C:N ratio. Bioassays using MS formulations of M. anisopliae strains MA1200 and TM109 produced in high carbon and high C:N ratio media were superior in efficacy to the other MS production media tested. MS preparations of M. anisopliae F52 showed superior efficacy against the sugarbeet root maggot in comparison with more conventional, conidia-covered nutritive (corn grit) granules in a clay and clay soil. The MS granules were also highly efficacious against the sugarbeet root maggot at soil moisture levels as low as 0.983 A _w (?2.33 MPa). Granular preparations incorporating Metarhizium MS can serve as a viable formulation for the use of this fungus against soil insects.