基于线粒体DNA序列的广西蜜柑大实蝇与日本蜜柑大实蝇的比较研究

测定了广西蜜柑大实蝇Bactrocera(Tetradacus)cheni(Zhao)的线粒体COⅠ-COⅡ及16S rDNA的部分序列,与日本蜜柑大实蝇Bactrocera(Tetradacus)tsuneonis(Miyake)及其它近缘实蝇的序列进行了比较分析,用最大简约法及邻接法构建了系统树.结果显示广西蜜柑大实蝇和日本蜜柑大实蝇为近缘种,属于同一单源分支,自展检验置信度均为100%.二者之间的HKY85遗传距离为0.01705,大于昆士兰实蝇和小昆士兰实蝇、桔小实蝇和菲律宾实蝇、具条实蝇和石垣岛实蝇之间的遗传距离,接近于黑肩角桔实蝇与短条面包果实蝇的种间遗传距离.支持广西蜜柑大实蝇与日本蜜柑大实蝇为两个形态学和遗传学上非常接近的不同种.     

橘小实蝇快速检疫鉴定方法

采用形态学观察与PCR技术相结合的方法,针对台湾水果中截获的可疑橘小实蝇Bactroceradorsalis(Hendel)幼虫和蛹进行快速鉴定。采用异硫氰酸胍方法快速提取昆虫基因组DNA,并根据特异性引物,采用PCR技术从截获的可疑橘小实蝇幼虫和蛹样本中均扩增得到224 bp的特异性条带,经测序比较发现,扩增产物序列与橘小实蝇目的基因序列完全相同,由此证明可疑样本为橘小实蝇的幼虫和蛹。该方法解决了橘小实蝇幼虫和蛹等未成熟虫态的快速检疫难题,大大缩短了检测周期,值得口岸检验检疫借鉴应用。     

橘大实蝇的产卵行为观察

2005年6月,在湖北省清江河谷地区早熟蜜柑园内观察了橘大实蝇Bactrocera(Tetradacus)minax(Enderlein)的产卵行为。整个产卵过程可分为定位、准备、穿刺、排卵和结束5个阶段。产卵1次所需的时间和排卵的数量与天气状况有关,一般需时14~46min。产卵深度因柑橘的品种和处在产卵期的果实直径大小而不同,在脐橙、柚、早熟蜜柑上的平均产卵深度分别为7.2,13.3和8.1mm。每雌的怀卵量平均71粒。雌成虫在产卵过程中有多头雄成虫在其周围活动或者是等待与其交尾,产卵和交尾在同一时段内多次交替进行。     

瓜果上主要实蝇类害虫PCR-RFLP分子鉴定技术的建立及应用

[目的]建立一种针对实蝇幼虫快速鉴定的技术方法,并应用该技术以明确我国瓜果上主要实蝇类害虫的优势种.[方法]以我国瓜果蔬菜上危害最为严重的瓜实蝇Bactrocera cucurbitae(Coquillett)、南亚果实蝇Bactrocera tau Walker和橘小实蝇Bactrocera dorsalis(Hendel)为对象,基于3种实蝇种间存在线粒体细胞色素氧化酶亚基Ⅰ因子(mtCOⅠ)基因的序列差异,利用3种限制性内切酶SapⅠ、BsmⅠ和Sac Ⅰ酶切识别这些差异序列的特异性酶切位点,根据酶切后mtCOⅠ基因片段大小不同,对3种实蝇进行快速的鉴定识别,并进一步应用此技术对来自我国7省11市的7种瓜菜和2种水果上的21份实蝇幼虫样本进行鉴定.[结果]通过单独或组合酶切的方式建立了一套针对瓜实蝇、南亚果实蝇和橘小实蝇的PCR-RFLP快速分子鉴定技术,并将此方法应用于田间监测.田间鉴定结果表明,湖北、湖南、浙江等地区危害瓜菜的实蝇主要是南亚果实蝇,广东、广西、海南等地区瓜菜上的实蝇种类主要是瓜实蝇,且瓜实蝇和南亚果实蝇存在寄主重叠现象,云南危害火龙果和芒果等水果上的实蝇主要是橘小实蝇.[结论]本研究建立的瓜实蝇、南亚果实蝇和橘小实蝇的识别鉴定方法,因不受虫体、虫态的影响,且具有低成本、高效、快速、重复性好的特点,适用于田间瓜果上实蝇样本的快速诊断检测.依据田间鉴定结果,预测近年来瓜实蝇可能有逐渐向北扩散的趋势.     

橘小实蝇和番石榴实蝇卵的提取物对两种实蝇行为的影响及化学成分分析

[目的]探究橘小实蝇Bactrocera dorsalis和番石榴实蝇Bactrocera correcta卵提取物对2种实蝇雌虫行为的影响,以及2种实蝇卵表面化合物的差异,为2种实蝇的化学生态防治提供理论依据.[方法]利用Y型嗅觉仪测定了橘小实蝇交配雌虫和番石榴实蝇交配雌虫对卵表提取物的行为反应,并利用EthoVision XT软件分析雌虫在Y管内的运动轨迹;利用气相色谱-质谱联用仪(GC-MS)鉴定分析橘小实蝇卵和番石榴实蝇卵的化合物成分,并利用标准曲线法测定了各组分的含量.[结果]橘小实蝇卵提取物对橘小实蝇交配雌虫具有显著引诱作用(x2=9.383,P=-0.002),对番石榴实蝇交配雌虫具有显著驱避作用(x2=6.737,P=0.009),番石榴实蝇卵提取物对番石榴实蝇交配雌虫(x2=4.235,P=0.040)和橘小实蝇交配雌虫都具有引诱作用(x2=5.818,P=0.016).从橘小实蝇卵表提取物中共鉴定出11种化合物,分别是茴香脑、十五烷、十二烷酸、十二酸乙酯、(Z)-11-十四碳烯酸、十四烷酸、十四酸乙酯、(E)-9-十六碳烯酸乙酯、十六烷酸、十八碳烯酸、(Z)-9-十八碳烯酸乙酯.从番石榴实蝇卵表提取物中仅鉴定出7种化合物,而且这7种化合物在橘小实蝇的卵提取物中都存在.仅存在于橘小实蝇卵表的4种化合物是茴香脑、十二烷酸、十二酸乙酯、(Z)-11-十四碳烯酸.在2种实蝇卵提取物的相同成分中,十四烷酸、(E)-9-十六碳烯酸乙酯、十六烷酸在橘小实蝇卵表的含量显著高于番石榴实蝇.[结论]番石榴实蝇具有通过卵表化合物识别同种卵和异种卵的能力,2种实蝇的卵表化合物具有明显的差异.     

橘小实蝇与番石榴实蝇卵及蛹的种间竞争

【背景】实蝇的竞争可能发生在生活史的各个阶段,但未见卵和蛹的种间竞争的相关报道。【方法】将橘小实蝇与番石榴实蝇的卵及蛹按照相应的比例或龄期分别进行混合培养,分析2种实蝇的卵或蛹混合后的发育历期和存活率是否受到彼此影响。【结果】橘小实蝇与番石榴实蝇的卵同龄等量混合,对彼此卵的历期和孵化率无影响。当橘小实蝇和番石榴实蝇的蛹为新鲜蛹时,分别与比它们蛹龄大1 d的对方蛹混合,蛹的羽化率分别为(87.67±3.61)%和(84.33±2.56)%,显著小于对照,说明在此混合蛹处理中,后化蛹者的发育可能受到先化蛹者的抑制。【结论与意义】总体上,在卵和蛹期,橘小实蝇与番石榴实蝇未产生竞争作用;但不排除蛹期竞争的可能性,这种竞争可能存在于特定的蛹期。     

橘大实蝇对三种寄主植物的偏好比较

比较取食3种不同寄主植物脐橙、杂柑、蜜橘对橘大实蝇Bactrocera(Tetradacus)minax(Enderlein)的蛹特征、卵量及为害率的影响,研究橘大实蝇对寄主植物的选择性。结果表明,取食蜜橘的橘大实蝇其蛹长及蛹宽显著大于取食脐橙的;取食杂柑的与取食脐橙的无显著差异。三者之间蛹重差异显著。取食蜜橘的雌成虫卵量显著大于取食脐橙的,取食杂柑的雌成虫卵量与取食脐橙的其无显著差异。对寄主植物的为害率顺序为:脐橙>杂柑>蜜橘。     

基于种特异性SS-COⅠ技术快速鉴定瘤胫实蝇

[目的]瘤胫实蝇为我国进境植物检疫性有害生物。寄主范围广、危害大,形态与其同属近缘种相似,传统鉴定方法是将果蔬上的各虫态饲养至成虫后进行分类鉴定,鉴定周期较长,影响口岸进境果蔬快速通关,而采用分子鉴定不仅快速且不受虫态影响。[方法]选用瘤胫实蝇为鉴定靶标,番石榴实蝇、锈红果实蝇等19种实蝇作阴性对照,应用种特异性技术,基于mtDNA COⅠ线粒体基因序列,研究筛选并设计一对种特异性引物(SS-COⅠ) LJF400和LJR564,进行PCR扩增并将PCR产物进行电泳检测。[结果]种特异性引物仅对靶标种瘤胫实蝇的COⅠ基因有扩增能力,能扩增出一条单一的长度约165 bp清晰的条带,而对其余阴性对照种均不具有扩增效果,未出现任何条带。[结论]设计的种特异性引物具高特异性,能够快速准确鉴定瘤胫实蝇,适用于各种虫态,对瘤胫实蝇的检疫鉴定和进境果蔬的快速通关具有重要意义。     

橘小实蝇的风险分析

从地理评估和管理标准、传人的可能性、传播途径、定殖、定殖后扩散的可能性及橘小实蝇危害性评估等方面对橘小实蝇传人中国风险进行定性分析,筛选了橘小实蝇传人中国的风险因子。根据我国各气候大区的30a（1961—1990）的平均气温、月最高平均气温、月最低平均气温及年降雨量等气候因子和橘小实蝇的发生规律,将我国地域划分为适生区、次适生区、非适生区,明确了南亚热带湿润大区、边缘热带湿润大区、边缘热带亚湿润大区为橘小实蝇的适生区;暖温带湿润大区、北亚热带湿润大区、南亚热带亚湿润大区、高原亚温带湿润大区为橘小实蝇的次适生区。提出了降低橘小实蝇风险的管理措施,为制定检疫政策提供依据。     

利用PCR-RFLP技术鉴定传粉榕小蜂隐种混合样品的物种组成

隐种(cryptic species)是指形态上几乎完全相同但遗传组成存在显著分化的物种。在榕树–榕小蜂一对一共生系统中, 传粉榕小蜂隐种的发现对协同进化、物种共存等重要的生态和进化理论提出了严峻的挑战。因为很难从形态上直接区分隐种, 所以, 相关研究中的一个迫切需要解决的问题就是如何快速而准确地鉴定隐种。本文采用PCR-RFLP方法分析了mtDNACOI基因片段, 对木瓜榕(Ficus auriculata)和鸡嗉果榕(F. semicordata)的传粉榕小蜂隐种进行了区分。结果表明为木瓜榕传粉的大果榕小蜂(Ceratosolen emarginatus)存在两个隐种(A和B), 分别包含1个XhoI和1个BssSI酶切位点。将两个隐种的样品按不同比例混合, 提取基因组DNA, PCR扩增mtDNA COI片段, 经XhoI和BssSI分别酶切, 均能通过酶切图谱准确检测出混合样品的隐种组成。鸡嗉果榕小蜂(C. gravelyi)两个隐种的mtDNA COI基因序列也存在较大差别, 分别包含1个BmrI和1个AvaI酶切位点, 隐种混合样品经BmrI和AvaI分别酶切的结果也能准确鉴定混合样品的物种组成。我们的结果表明基于PCR和DNA酶切技术能快速而准确地区分传粉榕小蜂的隐种。     

Simultaneous identification of species and molecular forms of the Anopheles gambiae complex by PCR-RFLP

For differential identification of sibling species in the Anopheles gambiae Giles complex (Diptera: Culicidae), including simultaneous separation of M and S molecular forms within An. gambiae Giles sensu stricto, we describe a PCR-RFLP method. This procedure is more efficient, faster and cheaper than those used before, so is recommended for large-scale processing of field-collected larval and adult specimens to be identified in malaria vector studies.     

Presence of Anopheles culicifacies B in Cambodia established by the PCR-RFLP assay developed for the identification of Anopheles minimus species A and C and four related species

Abstract A polymerase chain reaction‐restriction fragment length polymorphism (PCR‐RFLP) assay developed for identification of five species of the Anopheles minimus Theobald group and a related mosquito species of the Myzomyia Series (Diptera: Culicidae) was applied to morphologically identified adult female specimens collected in Ratanakiri Province, north‐eastern Cambodia. In addition to finding An. aconitus Dönitz, An. minimus species A and An. pampanai Büttiker & Beales, some specimens showed a new restriction banding pattern. Siblings of specimens that exhibited this new PCR‐RFLP pattern were morphologically identified as An. culicifacies James sensu lato. Based on nucleotide sequences of the ribonuclear DNA internal transcribed spacer 2 region (ITS2) and the mitochondrial cytochrome oxidase I gene (COI), these specimens were recognized as An. culicifacies species B (sensu Green & Miles, 1980 ), the first confirmed record of the An. culicifacies complex from Cambodia. This study shows that the PCR‐RFLP assay can detect species not included in the initial set‐up and is capable of identifying at least seven species of the Myzomyia Series, allowing better definition of those malaria vector and non‐vector anophelines in South‐east Asia.     

中国常见仓储书虱PCR-RFLP快速识别

应用PCR-RFLP技术,对我国4种常见仓储书虱即嗜虫书虱Liposcelis entomophila(Enderlein)、嗜卷书虱L.bostrychophila(Badonnel)、无色书虱L.decolor(Pearman)和小眼书虱L.paeta(Pearman)开展快速识别方法的研究。采用CTAB法从上述4种书虱体内提取基因组DNA,选用1对引物扩增16S rDNA基因区域,分别用5种限制性内切酶对PCR产物进行酶切。结果表明,PCR扩增片段大小约为500bp,用限制性内切酶DraI酶切得到的片段可将供试书虱区分开。该方法不受4种供试书虱地理种群、虫态(成虫、若虫)和性别的影响,可用于4种书虱的快速识别。     

Simultaneous identification of Bulbus Fritillariae cirrhosae using PCR-RFLP analysis

Bulbus Fritillariae (BF) is the most commonly used antitussive herb in China. There are nine species of Fritillaria recorded as the drug BF in the Chinese Pharmacopoeia. Bulbus Fritillariae cirrhosae (BF cirrhosae) is a group that includes four species of BF; these four species come from wild sources with higher efficiency and lower toxicity compared to the other five species of BF. Due to reasons of carelessness and reduced costs, the other five species are often sold as BF cirrhosae. Analysis through appearance, microscopic and chemical techniques has limitations. Identifying botanical resources is a primary step in the standardization of herbal medicine. In the present article, the internal transcribed spacer 1 (ITS1) regions of the nuclear ribosomal DNA (nrDNA) of nine species and one variety of Fritillaria genus have been sequenced. A mutation site in the ITS1 region among BF cirrhosae and other species of BF has been found and can be recognized by the restriction endonuclease SmaI. Polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism (PCR-RFLP) analysis of the nuclear ribosomal ITS1 region was used to differentiate BF cirrhosae from other species of BF and is a successful method in distinguishing the subgroups.     

PCR-RFLP和多重PCR技术检测常见病原性丝状真菌的实验研究

目的建立检测常见丝状真菌感染病原菌的PCR-RFLP和多重PCR方法。方法建立以PCR技术为基础的限制片段长度多态性(RFLP)方法 ,首先用真菌通用引物扩增丝状真菌的ITS区,然后用限制性核酸内切酶对PCR产物进行酶切。用4种丝状真菌的特异性引物建立多重PCR体系,用该体系检测单模板、双模板和三模板的扩增情况,并测定该体系的特异性和敏感性。结果用PCR-RFLP技术能够鉴别5种常见丝状真菌,多重PCR能够根据扩增片段的不同鉴别菌种,在合适的反应条件下,对单模板、双模板和三模板均能扩增出目的片段。结论 PCR-RFLP和多重PCR技术能够快速鉴定丝状真菌感染病原菌,有临床应用的良好前景。     

Rapid detection ofRhizoctonia species, causal agents of rice sheath diseases, by PCR-RFLP analysis using an alkaline DNA extraction method

Restriction fragment length polymorphism (RFLP) analysis for DNA products amplified by the polymerase chain reaction (PCR) was used for the direct detection ofRhizoctonia solani AG 1 IA and AG 2-2 IIIB,R. oryzae, R. oryzae-sativae andR. fumigata from the diseased rice sheaths. A rapid DNA extraction method with a solution of sodium hydroxide was conducted to extract parasite DNA from diseased rice sheaths. 28S ribosomal DNA (rDNA) derived from fungal genomic DNA extracted by the alkaline method was specifically PCR-amplified. The results of PCR-RFLP analysis for DNA samples from artificially inoculated rice sheath tissues with eachRhizoctonia spp. and the corresponding culture on the medium using two restriction enzymes.HhaI andMspI, showed identical polymorphisms. PCR-RFLP analysis using DNA samples from naturally infected rice sheath tissues also revealed the possibility of direct diagnosis ofR. solani AG 1 IA,R. oryzae andR. oryzae-sativae.     

民猪的SLA-DRB基因的PCR-RFLP多态性分析

采用克隆测序和PCR-RFLP相结合的方法,对民猪的SLA-DRB基因的整个编码区进行了扫描和多态性分析.结果表明该基因的第2外显子是整个基因的高变区,突变率达到5.6%,其中80%为有效突变,但没有发现新的等位基因;PCR-RFLP结果表明外显子1用内切酶Alu Ⅰ酶切可获得3种基因型;外显子2用内切酶Taq Ⅰ酶切可获得3种基因型;外显子3用内切酶Bcn Ⅰ酶切可获得3种基因型;外显子4用内切酶Mbo Ⅰ酶切可获得2种基因型;外显子5用内切酶Hin1 Ⅰ酶切可获得3种基因型.Hardy-Weinberg平衡分析表明民猪在Alu Ⅰ和Hin1 Ⅰ处于平衡状态(P＞0.05),在Taq Ⅰ、Bcn Ⅰ和Mbo Ⅰ处于不平衡状态.     

利用mtCOI PCR-RFLP技术鉴别草地贪夜蛾与其他3种形态相近昆虫

【目的】田间调查发现草地贪夜蛾与甜菜夜蛾、斜纹夜蛾、粘虫常混合发生,传统的形态学鉴定方法不能快速鉴别出该虫,当前亟需快速鉴别该虫的方法。【方法】本研究分析了草地贪夜蛾与甜菜夜蛾、斜纹夜蛾、粘虫mtCOI基因序列的酶切位点,根据目的片段设计上游引物并进行PCR-RFLP验证。【结果】草地贪夜蛾个体在mtCOI片段的556~561 bp处均存在Sbf I内切酶酶切位点,斜纹夜蛾、甜菜夜蛾、粘虫均无Sbf I酶切位点。草地贪夜蛾PCR产物经过Sbf I内切酶酶切,可出现420 bp左右的特征带,斜纹夜蛾、甜菜夜蛾、粘虫种群均不能被Sbf I内切酶酶切。【结论】基于新设计引物扩增的mtCOI片段的PCR-RFLP方法可有效鉴别草地贪夜蛾与其他3个形态相近昆虫,研究结果为草地贪夜蛾的快速鉴别提供了方法。     

用PCR-RFLP方法研究藏族HLA-DQA1和-DQB1基因多态性

应用目前HLA研究领域中成熟的,有效的PCR-RFLP基因分型技术,从DNA水平对藏族健康群体进行了HLA-DQA1(49人)和-DQB1(49人)基因分型,这在国内外属首次。所采用的PCR-RFLP基因分型技术是在HLA-DQA1和-DQB1各等位基因全部序列已知的情况下,对其第2个外显子碱基序列扩增进而进行RFLP分析的方法。这种方法得到的RFLP的所有片段都是已知序列,因而精确度很高,同时为发现新的等位基因提供了成熟而有效的分析方法。研究结果表明,在藏族DQA1的8个等位基因,DQA1*0301的基因频率最高(36.74％)。DQA1*0601(4.08％)、*0103(4.08％)和*0401(5.10％)最低。在DQB1的16个等位基因中,OQB1*0302(16.33％)、*0303(15.31％)和*0602(15.31％)为最常见,没有观察到*0504。统计分析表明,在DQA1各等位基因分布上,藏族与新疆汉族、北方汉族、上海汉族十分相近;与维吾尔族和哈萨克族也没有明显差异。在OQB1各等位基因的分布上,藏族与汉族、维族、哈族之间略有差异,而汉族、维族、哈族之间也存在一些差异。