大肠杆菌表达的人IL-6复性条件研究

采用稀释法复性,筛选重组人白细胞介素-6(rhIL-6)包涵体蛋白的复性条件。结果显示,复性液的浓度、pH值、复性时间和复性蛋白浓度,对重组人白细胞介素-6复性效果有很大影响。在复性液为2mol/L尿素、pH8.5、复性时间为24h和复性蛋白浓度50μg/ml条件下,重组人白细胞介素-6包涵体蛋白的复性效果最佳。     

提高大肠杆菌分泌表达重组蛋白的研究进展

大肠杆菌是表达重组蛋白的常见宿主之一。重组蛋白分泌到周质空间或胞外培养基中较之在胞内以包含体形式表达有许多优势。主要讨论大肠杆菌Ⅰ、Ⅱ型分泌机制,并总结近年来在提高重组蛋白分泌表达的策略方面取得的进展。     

大肠杆菌外膜蛋白酶T及其突变体的表达、复性及生物活性分析

外膜蛋白酶T(Outer-membrane protease T,OmpT)是定位于大肠杆菌外膜,具有高度底物特异性的蛋白水解酶。本文旨在建立克隆表达膜蛋白OmpT和体外复性的方法,考察其蛋白酶活性。首先以大肠杆菌基因组DNA为模板,PCR扩增ompT基因,连接至pET28a(pET-ompT),引入点突变Asp85Ala,构建表达质粒pET-ompT85。然后将两种重组质粒转化入BL21(DE3),均以包涵体形式大量表达。纯化后的蛋白经稀释法复性,并加入粗制脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)恢复蛋白酶活性。通过SDS-PAGE、鱼精蛋白水解试验及生长曲线观察表明,重组蛋白OmpT在体外能水解抗菌肽鱼精蛋白和兔肌肉肌酸激酶,而OmpT突变体则无上述功能。上述结果表明本文获得了具有蛋白水解酶功能的重组蛋白OmpT,该蛋白在体外可保护大肠杆菌抵抗鱼精蛋白的杀菌作用。     

人IL-6和TNF突变体重组融合蛋白表达质粒的构建及在大肠杆菌中的表达

本文利用PCR技术,对人肿瘤坏死因子α(hTNFα)基因进行了改造,并将其与人白细胞介素-6(hIL-6)成熟肽编码区cDNA进行融合,构建了5′IL-6-TNF△融合蛋白的表达质粒pBVIL6-TNFA△。DNA序列分析证明,PCR扩增片段核苷酸序列与引物设计序列及相应的cDNA序列完全一致;重组子用限制性内切酶酶切鉴定,含有正确的IL6-TNF△融合cDNA片段;表达产物经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,分子量约为37kD,与预计的相符合;生物学活性分析初步表明,该融合蛋白具有抗肿瘤活性。     

重组人IL-4大肠杆菌表达与纯化

根据大肠杆菌密码子偏爱性优化并合成人白细胞介素4基因,以pET30a( )为载体构建了重组表达质粒pET30a( )/rhIL-4,将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,诱导表达并超声破菌检测重组蛋白的表达形式。采用5L发酵罐培养工程菌,发酵液OD600为0.6时诱导3.5h收集菌体,检测目的蛋白的表达量。收集的菌体经压榨破菌获得包涵体,通过包涵体变性、层析、透析复性等方法对rhIL-4进行纯化。采用人红细胞白血病细胞(TF-1)测定纯化的rhIL-4的生物活性。测序表明目的基因已插入载体pET30a( )中,重组蛋白以包涵体形式表达,单位体积重组蛋白的表达量达200mg/L发酵液,建立了对包涵体形式表达的rhIL-4纯化方法,最终得率为40mg/L发酵液,纯度大于98%,回收率为20%以上。免疫印迹法检测诱导表达的重组蛋白和纯化的蛋白为IL-4,N端氨基酸序列测定结果与理论相符,生物活性检测纯化的蛋白比活性达2.5×106AU/mg。这为rhIL-4进一步产业化研究建立了基础。     

大肠杆菌外膜蛋白OmpW的克隆及在外膜上高表达

目的: 利用表达载体pLLP-OmpA实现大肠杆菌K12外膜蛋白OmpW在外膜上高表达。方法: PCR扩增ompW基因,构建重组表达载体pLLP-OmpA-ompW,然后转化大肠杆菌K12,得到在外膜上高表达的菌株。提取该菌外膜蛋白,利用免疫小鼠制备得到的抗血清进行Western blot分析验证高表达的OmpW是否定位于外膜。结果: 成功构建了重组表达载体,经转化后成功筛选到高表达菌株,并经Western blot证实高表达的OmpW定位在外膜上。结论: 首次成功获得OmpW在外膜上的高表达,该高表达菌株可为深入研究OmpW在细菌致病机制中的作用及其它功能提供研究基础。     

大肠杆菌的蛋白分泌机制

大肠杆菌的分泌蛋白定位于内膜、外膜、周质空间和胞外环境,它们在N端或C端带有一定的结构包含着分泌信号,这两类分泌蛋白在各自特定的一组蛋白因子的协助下跨越内膜,再通过目前尚不清楚的方式实现其最终定位.N端带有信号肽的分子在跨越内膜时得到Sec家族蛋白因子协助,信号肽在跨膜过程中可能被切除,该过程由ATP和电化学势提供能量.C端带分泌信号的分子主要受到Hly家族分子协助,一次穿过内膜和外膜而不经过周质空间.     

重组蛋白在大肠杆菌周间腔的分泌表达

大肠杆菌是用于生产重组蛋白的重要工程宿主菌。但是,要获得足够的正确折叠的蛋白还存在一定的缺陷,其中一种解决此问题的方法就是使重组蛋白分泌到大肠杆菌的周间腔里。在这篇综述中,主要讨论了使重组蛋白分泌表达至大肠杆菌周间腔的近期的研究进展。     

大肠杆菌表达的人重组IL-3的纯化

本文继大肠杆菌表达含凝血酶切点的人重组IL-3融合蛋白成功的基础上进一步探讨了天然型rhIL-3的纯化。超声破碎细菌细胞得包涵体,经洗涤处理可使包涵体纯度达90％,用8mol/L尿素变性溶解包涵体沉淀后直接稀释复性,再超滤浓缩、凝血酶消化,释放天然型rhIL-3。经DEAE Sepharose Fast Flow和Sepharcyl-100 HR层析得到天然型IL-3,纯度达96％,回收率20％以上,具有刺激正常人骨髓细胞形成集落的活性。本实验为大批量重组IL-3的生产创造了条件。     

重组人载脂蛋白AI米兰突变体在大肠杆菌中的高表达

用RT-PCR法从人肝总RNA库中克隆出人载脂蛋白Al的cDNA序列,再通过重叠PCR将载脂蛋白AI的第179位精氨酸密码子突变成半胱氨酸密码子,即载胎蛋白AI米兰突变体基因。将此目的基因克隆至表达载体pQE30,重组质粒转化JMl09宿主菌,经表达试验筛选出高表达克隆;工程菌经诱导后表达出含6个氨基酸前肽的载脂蛋白AI米兰突变体。表达产物主要以可溶形式存在,但也有部分为包涵体。     

利用大肠杆菌表达禽流感病毒聚合酶酸性蛋白

目的：通过在大肠杆菌中分段表达禽流感病毒聚合酶酸性蛋白（PA蛋白）,探索PA基因中可能影响表达的区域。方法：构建分段缺失的PA蛋白突变体,用IPTG在大肠杆菌RosettaGamiB（DE3）中诱导表达,比较各突变体的表达效率。结果：N端缺失长度在143～408个氨基酸残基之间的9个突变体在大肠杆菌中的表达水平较高;而突变体PA/K（Δ1-40aa）、PA/M（Δ1-56aa）、PA/N（Δ41-56aa）和PA/P（Δ57-75aa）的表达水平很低;全长PA蛋白和缺失N端20个氨基酸残基的突变体PA/L则检测不到表达。结论：PA基因的61～225bp和325～426bp可能是影响PA蛋白表达的2个重要区域,为下一步表达全长PA蛋白奠定了基础。     

重组人载脂蛋白AI米兰突变体在大肠杆菌中的可溶性表达

载脂蛋白AI米兰突变体(apoliproteinA-I-Milano ,AIM)是载脂蛋白AI的天然突变体,具有比载脂蛋白AI更强的抗动脉粥样硬化症的作用。将AIM基因N_末端的氨基酸密码子优化后,克隆至表达载体pET2 2b ,重组质粒转化BL2 1(DE3)宿主菌,用IPTG诱导表达。AIM以可溶形式表达,约占菌体总蛋白的38%。表达产物经ButylSepharose 4F .F疏水层析和QSepharoseH .P .阴离子交换层析后,再用Vivaspin2 0 (30 0 0 0MW)进行超滤,AIM单体的纯度达95 %以上。AIM单体与脂结合活性表明,AIM单体结合脂的速度比apoA_I慢,但结合脂的量比apoA_I高。这项研究为AIM的结构和功能,特别是临床应用研究奠定了基础。     

人转化生长因子β1在大肠杆菌中的分泌表达

为了研究双体形式生长因子的原核基因工程,尝试了人转化生长因子β１（ｈＴＧＦβ１）基因的分泌表达．通过缺失突变,构建了能表达具有天然一级结构的ｈＴＧＦβ１单体蛋白的周质分泌表达质粒．采用双顺反子表达系统,使ＴＧＦβ１在周质中获得了高效可溶性表达．研究了改善转运通路对重组蛋白分泌表达的影响,发现共表达σ３２基因和ｄｓｂＡ基因,可促进周质中ＴＧＦβ１双体分子的形成;而共表达ｓｅｃＥ／Ｙ基因对ＴＧＦβ１的分泌表达则没有明显影响．通过共表达ｋｉｌ基因,使ＴＧＦβ１在胞外培养基中获分泌表达,并在胞外折叠、组装形成具有生物活性的双体分子     

禽病原性大肠杆菌外膜蛋白的研究进展

大肠埃希氏富是家禽最常见的病原菌之一,可引起家禽胚胎死亡、脐炎、败血症、肉芽肿、卵黄性腹膜炎和全眼球炎等一系列疾病,给养禽业带来重大损失。禽病原性大O杆菌大部分属O1：K1、O2：K1和078：Kwlj以往国内外对禽源性大肠杆菌主要根据O抗原分型［1～3］。最近的研究结果显     

大肠杆菌周质和外膜蛋白的定位

大肠杆菌周质和外膜蛋白发挥功能必须首先到达其特定亚细胞分区.大肠杆菌通过一系列与蛋白质分泌有关的蛋白（Sec蛋白）将周质和外膜蛋白转运至内膜.在切除了信号肽后,与周质蛋白的定位不同的是,外膜蛋白的最终定位还需要其他因子的协助.外膜蛋白的定位近来认为是以周质作为中介的.     

利用非经典分泌蛋白质实现脂肪酶A的分泌表达

【目的】以枯草芽孢杆菌脂肪酶A(Lipase A)为报告蛋白,尝试利用4种非经典分泌蛋白质及其前50个氨基酸作为分泌信号以实现其分泌表达。【方法】我们扩增了脂肪酶A的编码基因和非经典分泌蛋白质的编码序列,构建了8种针对脂肪酶A的分泌表达载体,并转化至枯草芽孢杆菌WB800菌株,通过测定重组菌株的酶活、利用蛋白质电泳和免疫印迹等技术检测脂肪酶A的分泌情况【结果】以Pdh A的氨基酸序列和Sod A、Eno的前50氨基酸序列作为分泌信号的重组菌株较好的实现了脂肪酶A的分泌表达。【结论】部分非经分泌蛋白质的编码基因或其前50个氨基酸序列能够引导脂肪酶A分泌至细胞外。     

人骨形成蛋白2A活性片段在大肠杆菌中的高效表达

将编码人骨形成蛋白２Ａ（ＢＭＰ２Ａ）Ｃ端１７３个氨基酸（ＢＭＰ２３）和１３４个氨基酸（ＢＭＰ２４）的ＤＮＡ基因片段分别重组克隆进入ＰＬ启动子控制下的表达载体,构建了表达质粒ｐＢＬＢＭＰ２３和ｐＢＬＢＭＰ２４,分别转化大肠杆菌进行表达研究．ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析温敏诱导的表达菌,可以分别观察到分子量为２０ｋＤ和１５．５ｋＤ的高表达条带,与理论计算的分子量一致,表达量分别占细菌蛋白质总量的１０％和２０％左右。表达产物经包含体制备达到８０％以上纯度。Ｎ端序列测定的１５个氨基酸,与重组ｃＤＮＡ基因编码的序列相同．ＢＭＰ２３和ＢＭＰ２４包含体经复性处理后,得到二聚体分子蛋白质条带,与骨基质胶原重组后在大鼠体内测活,观察到ＢＭＰ２３诱导软骨细胞生成,ＢＭＰ２４刺激丰富的骨样胶原组织合成．     

革兰阴性菌外膜蛋白A研究进展

外膜蛋白A是革兰阴性菌主要的外膜蛋白,是细菌入侵细胞的作用蛋白,也是宿主免疫系统清除细菌的靶向识别蛋白;介导多种疾病的产生,同时也激活机体的免疫机制对抗细菌的感染;与细菌生物膜的形成有关;并且在动物疫苗上有较好的应用前景。此外,对人类健康、畜禽养殖,以及水产养殖影响巨大。该文将就OmpA蛋白结构分类、性质、作用、实际应用等方面作一综述。