限制和修饰酶基因Lla BⅢ的克隆及分析

pJW566是从丹麦乳酪生产菌株Lactococcus lactis subsp.cremoris W56中分离到的,一个22.4kb,具有限制和修饰作用的质粒,内切酶ClaⅠ和pJW566不完全消化,所得片段与来自于质粒pVC5的氯霉素抗性基因连接得到一个携带有完整限制和修饰酶基因的质粒pJK1。基因亚克隆分析发现该基因位于约5kb的Sph0Ⅰ-Hin dⅢDNA片段上。序列分析表明该片段包含一个4572bp的开放阅读框架、编码一个由1576／1584个氨基酸残基组成的蛋白质,该基因命名为Lla BⅢ。蛋白质同源性查询发现在该蛋白的N－末端有7个保守区域,与R／M系统Ⅰ型和Ⅲ型内切酶有较高同源性,在蛋白的中间区域有4个代表N^6-腺苷酰甲基转移酶的特征序列,而蛋白的C－末端不同于任何已知蛋白。这种具有限制、修饰和可能的DNA识别作用的多功能蛋白,可能是一新的R／M系统。     

限制和修饰系统LlaBⅢ在构建抗噬菌体菌株中的作用

限制和修饰(restriction and modification,R/M)系统是指由限制性内切酶和甲基化酶组成的单亚基或多亚基复合酶系统,两者通常成对出现,具有相同的DNA识别位点,其作用相反.R/M系统在原核生物中普遍存在,在保护细胞免遭外源病毒侵害方面具有重要作用[1].     

限制和修饰系统LlaBIII在构建抗噬菌体菌株中的作用

限制和修饰 (ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎａｎｄｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ,Ｒ Ｍ)系统是指由限制性内切酶和甲基化酶组成的单亚基或多亚基复合酶系统 ,两者通常成对出现 ,具有相同的ＤＮＡ识别位点 ,其作用相反。Ｒ Ｍ系统在原核生物中普遍存在 ,在保护细胞免遭外源病毒侵害方面具有重要作用[1] 。作为发酵剂的乳酸乳球菌在乳制品发酵中具有重要作用 ,但这类菌株极易遭受噬菌体感染 ,导致菌株产酸力降低 ,甚至发酵失败 ,造成严重的经济损失。所以在乳制品发酵过程中防止噬菌体感染就成为十分重要的问题。通过自然筛选或诱变处理等手段筛选噬菌…     

人铜锌超氧化物歧化酶基因的克隆和乳酸乳球菌中的表达

采用ＲＴ－ＰＣＲ技术从人肝总ＲＮＡ中分离扩增了０．４５ｋｂ的人铜锌超氧化物歧化酶（Ｃｕ／ＺｎＳＯＤ）基因的ｃＤＮＡ序列,首先克隆至大肠杆菌表达质粒ｐＥＴ２３ｂ,进行了序列测定和超高表达,将Ｃｕ／Ｚｎ,ＳＯＤｃＤＮＡ亚克隆至乳酸乳球菌表达载体ｐＭＧ３６ｅ,用电穿孔法将重组质粒ｐＭＧ３６ｅｓｏｄ转化到乳酸乳球菌,获得Ｃｕ／Ｚｎ ＳＯＤ的组成型表达,其表达量约占乳酸乳球菌可溶性蛋白的５％以上,活性染色表     

人铜锌超氧化物歧化酶基因的克隆和在乳酸乳球菌中的表达

采用RT-PCR技术从人肝总RNA中分离扩增了0.45kb的人铜锌超氧化物歧化酶(Cu/Zn SOD)基因的cDNA序列,首先克隆至大肠杆菌表达质粒pET23b,进行了序列测定和超高表达。将Cu/Zn SOD cDNA亚克隆至乳酸乳球菌表达载体pMG36e,用电穿孔法将重组质粒pMG36esod转化到乳酸乳球菌中,获得Cu/Zn SOD的组成型表达,其表达量约占乳酸乳球菌可溶性蛋白的5%以上,活性染色表明该工程菌表达的Cu/Zn SOD具有较好的酶活性。     

乳链菌肽前体基因（nisZ）在乳酸乳球菌中的克隆和表达

用PCR技术从克隆有完整乳链菌肽生物合成基因簇（来自于乳链菌肽高产菌株L.lactis AL2)的重组噬菌体λHJ-3中扩增了编码乳链菌肽的前体基因,与pMG36e连接得到重组质粒pHJ201,用电击转化法将pHJ201转化到L.lactis NZ9800中,经活性测定和Tricine－SDS－PAGE电泳证实乳链菌肽前体基因获得了功能表达。DNA序列分析表明乳链菌肽高产菌株L.lactis AL2产生的是NisinZ。发现pHJ201d L.lactis NZ9800 中有良好的稳定性。     

变形链球菌致龋抗原基因在乳酸乳球菌的表达

目的 克隆变形链球菌葡聚糖结合蛋白B(GbpB)功能区的基因片段,并在乳酸乳球菌中表达.方法 在实验中利用了分子克隆技术构建携带GbpB基因的重组原核表达质粒pNI1,将重组质粒转化乳酸乳球菌YF02株,筛选鉴定阳性菌落,诱导表达的GbpB蛋白用SDS-PAGE进行鉴定.结果 成功克隆了GbpB功能区的基因片段,并在乳酸乳球菌中得到其融合蛋白的表达.结论 利用分子生物学技术能够成功克隆GbpB功能区基因并获得乳酸乳球菌融合蛋白的表达,为后续研究奠定了基础.     

表达猪传染性胃肠炎病毒S基因的重组乳酸乳球菌的构建及免疫原性分析

根据猪传染性胃肠炎病毒纤突(S)蛋白的全基因序列及表达载体质粒的基因融合特点,设计一对引物,进行PCR扩增,获得含有TGEVS基因4个主要抗原位点的约2000bp的目的片段,将其与分泌表达的载体质粒pNZ8112进行连接,通过电击转化进入宿主菌乳酸乳球菌NZ9000细胞内,在乳链菌肽(Nisin)的诱导下进行表达,通过SDS-PAGE和Western blot分析,表明TGEVS蛋白在乳酸乳球菌中获得表达,所表达的TGEVS蛋白具有与TGE病毒一样的抗原特异性。间接免疫荧光试验表明重组菌表达蛋白定位于菌体表面。将表达TGEVS蛋白的重组乳酸乳球菌及空质粒菌株分别口服免疫BALB/c小鼠,收集粪便样品进行抗体检测,结果表明分泌型的重组菌pNZ8112-Sa/NZ9000免疫小鼠能够产生明显的抗TGEVsIgA抗体。     

16S rRNA和recA、groEL基因分类鉴定乳酸乳球菌乳酸亚种和乳脂亚种的比较

【目的】比较16S rRNA和recA、groEL基因部分序列用于乳酸乳球菌乳酸亚种和乳脂亚种分类鉴定的效果。【方法】对已鉴定的8株分离自传统发酵乳的乳酸乳球菌, 选取recA和groEL基因片段, 通过PCR扩增、测序, 将测序得到的序列比对后构建系统发育树, 并与16S rRNA基因序列分析技术进行比较。【结果】比较分析不同菌株16S rRNA和recA、groEL基因的亲缘关系, recA、groEL基因可以准确地完成乳酸乳球菌乳酸亚种和乳脂亚种的区分和鉴定。【结论】recA和groEL基因序列分析可以实现乳酸乳球菌乳酸亚种和乳脂亚种的区分, 因其具有快速、准确、稳定的特点, 可适合于乳酸乳球菌乳酸亚种和乳脂亚种间的快速分类鉴定。     

Nisin生物合成有关基因的遗传分析

乳链菌肽是某些乳酸乳球菌产生的细菌素,是目前发现的各种细菌素中最重要的一种。因其具有较大经济价值而研究最为深入,有关它的理化性质及其应用已有文献报道。细菌素这类抗菌物质都是多肽或蛋白质,有分子量小,且结构复杂的特点。Ｋｌｅａｎｈａｍｍｅｒ等依据细菌素的分子量大小,热稳定性及修饰氨基酸等因素,把乳酸菌产生的抗菌蛋白质分为三类：１．热稳定的小肽２．热敏感的大蛋白质３．修饰性朋肽。它们的生物合成方式有核     

限制和修饰系统的克隆及同源性研究

迄今已有１２４种完全和５４种不完全的限制和修饰系统基因成功地基隆于大肠杆菌,９０多种限制和修饰系统基因被测序。本综述了细菌内克隆限制和修饰基因的方法,并从分子遗传水平上讨论了它们的进化关系。     

酒类酒球菌苹果酸-乳酸酶基因的克隆

利用PCR方法从酒类酒球菌(Oenococcus oeni)基因组中扩增出651 bp的DNA片段,将之克隆到pUC19-T载体上并转化大肠杆菌(E.coli)JM109菌株.重组质粒的测序结果表明,克隆到了苹果酸-乳酸酶基因(mle),它含有527 bp的阅读框架,其核苷酸序列与文献报道相同.     

CglI基因在大肠杆菌中的功能活性分析

通过PCR技术从谷氨酸棒杆菌基因组中扩增CglI基因,克隆到载体pMD18-T Simple后测序。将CglI基因亚克隆到表达载体pJL23,构建重组质粒pJL23-CglI,转化大肠杆菌HB101菌株,通过PCR反应筛选鉴定阳性克隆。通过噬菌体感染实验,初步分析了CglI基因在大肠杆菌中的功能活性。     

产抑菌素菌株SM-A的分离和鉴定

自市售酸乳酪中分离到一株乳球菌SM-A菌株。该菌株产生的抑菌素能抑制或杀死芽孢杆菌、葡萄球菌、微球菌、链球菌、棒杆菌和梭菌等革兰氏阳性细菌,但对革兰氏阴性细菌、霉菌和酵母无效。SM-A菌株多为链球状,也有成对存在。革兰氏染色阳性,抗酸染色阴性,兼性厌氧生长,最适生长温度32℃,不形成芽孢,无荚膜和鞭毛,不运动;可从多种糖类产酸,但不产气;接触酶、苯丙氨酸脱氨酶和酪氨酸脱羧酶均为阴性,精氨酸双水解酶阳性;不液化明胶,还原石蕊牛奶并胨化,生长温度范围10～43℃,DNA中G+Cmol为36.4％。经鉴定,SM-A菌株为乳酸乳球菌乳酸亚种(Lactococcus lactis subsp.lactis)。     

乳酸乳球菌Nisin抗性基因nisI的克隆及作为筛选标记

情况良好,遗传性能稳定,这表明nisl基因赋予了宿主菌MG1363对Nisin的抗性.[结论]nisl可以作为筛选标记用于食品级表达载体的构建.     

CglI基因在大肠杆菌中的功能活性分析

通过PCR技术从谷氨酸棒杆菌基因组中扩增CglⅠ基因,克隆到载体pMD18-T Simple后测序.将CglⅠ基因亚克隆到表达载体pJL23,构建重组质粒pJL23-GglⅠ,转化大肠杆菌HB101菌株,通过PCR反应筛选鉴定阳性克隆.通过噬菌体感染实验,初步分析了CglⅠ基因在大肠杆菌中的功能活性.     

乳酸乳球菌食品级诱导表达系统的构建及异源蛋白的表达

以α-aga基因为食品级选择标记构建了乳酸乳球菌食品级高效诱导细胞内和细胞壁锚定表达系统,并用这一表达系统表达了铜绿假单胞菌融合外膜蛋白基因OprF/H。首先以pRAF800和pNZ8048构建了含有α-aga、PnisA-MCS-TpepN和θ复制子的乳酸乳球菌食品级细胞内诱导表达载体pRNA48,再以pRNA48和pVE5524为出发载体构建了含有α-aga、PnisA-SPUsp45-nucA-CWAM6-t1t2和θ复制子的乳酸乳球菌细胞壁锚定诱导表达载体pRNV48。然后以食品级载体pRNA48和pRNV48为基础,构建了不含抗生素抗性选择标记的铜绿假单胞菌融合外膜蛋白基因的表达质粒pRNA48-OprF/H和pRNV48-OprF/H。利用nisin进行重组乳酸乳球菌菌株的诱导表达,通过SDS-PAGE和Western blot分析,检测到表达蛋白分别占细胞内可溶蛋白的9.6%和细胞壁锚定蛋白的9.8%,表达产物具有免疫原性,可与含OprF/H的乳球菌以及铜绿假单胞菌发生特异性的凝集反应。     

小鼠Nucleophosmin基因的克隆及基因组结构分析

Nucleophosmin(NPM)是主要的核仁磷酸化蛋白,在一些退行性大细胞淋巴瘤、骨髓增生异常综合征、急性髓性白血病等病人中可见累及NPM基因的染色体易位。建立NPM基因剔除的小鼠模型对于研究NPM基因的生物学功能及其在淋巴瘤及白血病发病中的确切作用有非常重要的意义。为获得包含NPM基因组全长序列的噬菌体克隆,以小鼠NPM cDNA为探针对129S1系小鼠λ噬菌体基因组文库进行筛选,经3轮筛选鉴定出一个包含小鼠NPM基因组全序列的噬菌体克隆。用鸟枪法对这个λ噬菌体克隆全长15．3kb进行了测序,序列经BLAST分析显示,该克隆所包含的129Sl系小鼠NPM基因组序列与GenBank中C57BL／6系小鼠序列约99．8％相同。根据测序获得的基因组序列,应用生物信息学方法对小鼠NPM的基因组结构及NPM基因5’启动子区可能的转录因子结合位点等进行了分析。     

产抑菌素菌株SM—A的分离和鉴定

自市售酸乳酪中分离到一株乳球菌SM-A菌株。该菌株产生的抑菌素能抑制或杀死芽孢杆菌、葡萄球菌、微球菌、链球菌、棒杆菌和梭菌等革兰氏阳性细菌,但对革兰氏阴性细菌、霉菌和酵母无效。SM-A菌株多为链球状,也有成对存在。革兰氏染色阳性,抗酸染色阴性,兼性厌氧生长,最适生长温度32℃,不形成芽孢,无荚膜和鞭毛,不运动;可从多种糖类产酸,但不产气;接触酶、苯丙氨酸脱氨酶和酪氨酸脱羧酶均为阴性,精氨酸双水解酶阳性;不液化明胶,还原石蕊牛奶并胨化,生长温度范围10～43℃,DNA中G Cmol为36.4％。经鉴定,SM-A菌株为乳酸乳球菌乳酸亚种(Lactococcus lactis subsp.lactis)。