不同调控序列控制下的GUS基因在水稻和毛白杨愈伤组织中的瞬时表达

用CaMV35S启动子、玉米Ubil启动子、TMVΩ增强子(Ω序列)以及拟南芥18S rRNA基因同源序列构建的6种GUS基因表达载体分别转化水稻和毛白杨愈伤组织,研究不同调控序列对外源基因表达的调控作用.结果表明:(1)在水稻中,以独立Ubil启动子驱动下的GUS基因表达水平为最高,CaMV35S启动子附加18SrRNA基因同源序列调控下的GUS基因为最低.而在毛白杨中,则呈相反趋势;(2)在水稻中,CaMV35S-Ubil复合启动子的表达活性比独立CaMV35S启动子提高了近1.5倍.而在毛白杨中,前者比后者的低;(3)Ubil启动子附加Ω序列,使GUS基因在毛白杨中的表达水平提高一倍以上.但CaMV35S-Ubil复合启动子附加Ω序列,对GUS基因在毛白杨及水稻愈伤组织中的表达活性均没有明显的增强作用.     

植物遗传工程

940312稳定转化的植物细胞中骨架连接区增强报道基因表达〔英〕/Allen,G.C.…/Plant Cell一1993,5(6)一603~613〔译自DBA,1993,12(17),93一09903〕 酿酒酵母自主复制片段ARS一1含有一个能离体与植物核骨架结合的骨架连接区(S AR)。为了试验对基因表达的效应,将一个位于该片段侧翼的、在CaMV 355启动子调控下的,GUS基因的构建物通过微轰击转送到烟草NT一1悬浮细胞中。在稳定转化的细胞系中,含两个侧翼SAR构建物的GUS活性比缺少SAR的对照平均高12倍。表达水平不与基因拷贝数成比例。而在某些含多基因拷贝的转化体中,该片段似乎是…     

基因标记、转化、表达与检测

821276大肠杆菌户葡枪普酸酶甚因作为鉴定酵母菌株的标记〔英〕/petering,J……了Am.J。Enol.Vitie一1991,42(i)一6一11〔译自DBA,1991,10(18),91一10239二 大肠杆菌介葡糖普酸酶(GUS)uidA基因(分离自质粒pKLG4的HindIH片段)经改造,即在其编码序列上连接酿酒酵母乙醇脱氢酶启动子和终止子序列,构成pAW220新质粒,用于在酵母中的表达。pAW220在转化酿酒酵母3A时,可整合至第13染色体的ILVZ基因中。筛选抗性除草剂甲基化Sulfometuron(10产g/ml)的转化株。用Southern杂交法筛选转化株中在ILVZ基因内含有GUS者(3 AM)。3 AM培养于1…     

水稻ADP-葡萄糖焦磷酸化酶小亚基Ⅰ基因的启动子分析

水稻(Oryaz sativa L.)基因组中的ADP-葡萄糖焦磷酸化酶小亚基(ADP-Glucose pyrophosphorylase smallsubunit,OsAgpS)由两个基因编码,即OsAgpS1和OsAgpS2.其中OsAgpS1基因产生两个转录本OsAgpS1a和OsAgpS1b,区别在第一个外显子的位置不同.通过RT-PCR方法分析了两个转录本在水稻组织和胚乳不同发育时期的表达特性;同时通过报告基因GUS检测了两个转录本上游转录调节区DNA片段的转录启动特性.结果表明,两个启动了与其下游转录本的表达模式完全一致,即OsAgpS1a转录本和OsAgpS1a 上游启动子控制的GUS基因主要在胚乳中高水平表达,在叶片中有很低水平的表达;而OsAgpS1b转录本和OsAgpS1b上游启动子控制的GUS基因主要在叶片和胚乳发育早期低水平表达.这说明OsAgpS1基因产生的两个转录本是由不同的启动子控制转录的,OsAgpS1a上游启动了可以作为胚乳表达用启动子.     

一个水稻高效表达启动子Os252的分离

植物基因的表达受启动子的控制,高效表达启动子的分离及功能分析不仅是植物基因工程研究的重要研究方面,也是表达调控研究的重要内容。根据EST数据克隆了一个预测在水稻茎中高效表达的启动子Os252。将该启动子与GUS基因构建成表达载体并转入水稻。转基因水稻PCR分析表明,GUS基因已经成功地整合进水稻基因组中。GUS组织化学分析表明,Os252能启动GUS基因在水稻叶、茎以及胚乳中表达。进一步GUS酶活性的测定表明,叶和胚乳中Os252启动子活性分别是35S启动子的1.9和2.5倍。由于Os252来自于水稻,在叶和胚乳中活性高于35S启动子,因此该启动子可望用于水稻基因工程研究。     

水稻rbcS启动子控制的外源基因在转基因水稻中的特异性表达

为将不同启动子用于转基因水稻的研究,从武运粳8号水稻中克隆了Rubisco小亚基基因(rbcS)的5'上游调控区,构建了由rbcS启动子引导的GUS融合基因,并经农杆菌介导导入到水稻中.对转基因水稻植株中GUS活性的定性与定量测定结果表明,rbcS启动子可驱动GUS报告基因在转基因水稻植株叶片和叶鞘内的叶肉细胞中特异性高效表达,而在茎、根和种子等器官中不表达或表达活性极弱,表现出明显的组织与细胞特异性.结果还表明,光诱导处理可明显提高rbcS启动子启动的外源基因的表达量.     

质粒研究与载体构建

920410可在蓝燕株系PCC7120中分析启动子的载体〔英〕/Tang,J.D.…了J.Baeteriol一1901,i了3 (s)一2729~2731〔译自DBA,1991,10(12),91一06654〕 构建了启动子探测载体pJL3,它含有一个多克隆位点、cat基因(不带启动子)以及转录终止子。经接合将其从大肠杆菌转移至Aoaba‘。a“P.PCC7iZo中。新质粒的成分来源于:质粒pRL25C (含大肠杆菌和兰藻复制子)、新霉素杭性标记、bom接合转移区、质粒pDUI(从丝态兰细菌分离到)以及pBR322的序列。描述了该载体质粒的详细构建过程。Aoaba。:a psbB基因编码光合系统n中的一种分子量47000的叶绿…     

基因标记、转化、表达与检測

920101检测金黄色葡萄球菌2,6一二甲基苯基青霉素钠抗性基因的非放射性探针〔英万L馆0221,M.一/Antimierob.Agents Che也other。一1991,35 (3)一575一575〔译自DBA,1991,10(9),91一04830〕 新探针用于检测2,6一二甲基苯基青霉素钠结合蛋白(PBP Za),并阐明抗性与金黄色葡萄球菌(Sta夕h歹lococC:。aore:。)内在基因型的关系。将一段长528bp的基因片段(编码s.a。”:8的内在户内酞胺抗生素抗性,即mec基因)插入质粒pBlueseript SK的Smal位点中,制成探针。在20ng/ml浓度下,该探针检测纯化刀.。仰”R 1 DNA有极高灵敏度。该探针还与刀.e夕…     

参与水稻光合作用的PsbR3基因启动子的功能分析

本实验旨在研究水稻光合作用蛋白中各基因的表达模式. 采用RT-PCR和定量real-time PCR数据分析水稻不同组织的mRNA表达水平.结果显示,PsaK和PsbR3基因仅在茎、叶等绿色组织表达,而胚、胚乳部分均不表达.通过其启动子克隆、植物表达载体构建,以及农杆菌介导转化后,GUS组织染化分析和GUS荧光定量分析表明,两启动子均为组织特异性优势表达,PsbR3启动报告酶GUS在叶片中的表达活性为Actin启动子的3.29倍,而PsaK启动报告酶GUS在叶片中的表达活性低于Actin启动子的.这些初步结果提示,PsbR3启动子决定水稻绿色组织茎叶的优势表达,PsbR3基因可能参与水稻光合作用.     

不同调控序列作用下GUS基因在烟草中瞬时表达活性

以pB1121为出发质粒,利用烟草泛素启动子Ubi．U4、CaMV35S启动子以及Kozak序列构建4种GUS基因表达载体,通过叶盘转化法转化烟草叶片,检测瞬时表达活性,研究不同调控序列对外源基因表达的调控作用。结果表明：CaMV35S启动子附加Kozak序列后使GUS活性比独立使用CaMV35S提高了近2倍：双CaMV35S启动子附加Kozak序列驱动GUS基因的表达活性与单CaMV35S附加Kozak序列相当;烟草泛素启动子附加Kozak序列的表达活性为CaMV35S启动子附加Kozak序列的1．5倍;Ubi．U4-CaMV35S复合启动子附加Kozak序列驱动GUS基因表达水平最高,其表达效率是双CaMV35S启动子附加Kozak序列调控下GUS表达效率的3倍,为CaMV35S独立作用时的10倍。     

不同调控序列作用下GUS基因在烟草中瞬时表达活性的研究

以pBI121为出发质粒, 利用烟草泛素启动子Ubi.U4、CaMV35S启动子以及Kozak序列构建4种GUS基因表达载体,通过叶盘转化法转化烟草叶片, 检测瞬时表达活性, 研究不同调控序列对外源基因表达的调控作用。结果表明: CaMV35S启动子附加Kozak序列后使GUS活性比独立使用CaMV35S提高了近2倍; 双CaMV35S启动子附加Kozak序列驱动GUS基因的表达活性与单CaMV35S附加Kozak序列相当; 烟草泛素启动子附加Kozak序列的表达活性为CaMV35S启动子附加Kozak序列的1.5倍; Ubi.U4-CaMV35S复合启动子附加Kozak序列驱动GUS基因表达水平最高, 其表达效率是双CaMV35S启动子附加Kozak序列调控下GUS表达效率的3倍, 为CaMV35S独立作用时的10倍。     

水稻CesA4基因启动子与GUS基因融合表达

目的:利用GUS报告基因,研究水稻CesA4基因在水稻组织和器官的定位.方法:克隆水稻的CesA4基因的启动子并用GUS组织化学染色检测启动子与GUS基因融合表达情况.结果:成功克隆了水稻的CesA4基因的启动子,并发现水稻的CesA4基因在水稻的根、茎、叶、鞘、穗的纤维均有表达.结论:通过将水稻CesA4基因的启动子与GUS基因融合来分析水稻此基因的表达部位,是一种简便和有效方法.     

质粒研究与载体构建

921607应用乳酸乳球菌的lacG基因构建乳酸菌的启动子探测毅体〔会,英〕/SimonS,G.“·,Dev.Ind.Mierobiol一i。。o,31一31一39〔译自DBA,1991,10(21),91一12056〕 用乳酸乳球菌(Laetococe。。laet名s)NCDO712的6一磷谓一D一半乳糖昔酶(lacG)的无启动子基因,构建了启动子探测载体pNZ336。将一个含多个限制位点及3个读码框终止密码子的DNA片段插入laeG基因的Shine一Dalgarno序列上游。作为选择标记,该载体含有金黄色葡萄球菌质粒pC194和pUBllo的氯霉素抗性及卡那霉素抗性基一23一因,二者在革兰氏阳性、阴性菌中均有功能。该载体还…     

组织与原生质体培养

920230田间试验阶段的体外转基因技术〔英刀Miller,D。R.…2 Bio/Teehnology一1。。1,9(2)一143~146〔译自DBA,1991,10(9),91-05082〕 从1986年到1990年,对高粱、黍、小麦(T石-“c。‘ae“玄”。。)、燕麦(A”eoa sp。)、水稻 (Or鱿za sa‘畜。a)、尖叶菜豆(p无aseol”5 ae移-‘玄fol‘。s)和木豆(Ca夕a,。5 eaja。)的13000种以上再生株系进行了田间试验,它们是正常、耐盐、耐低或高pH、耐旱、抗病虫害的。鉴别了以下若干问题:(1)试验所用的适宜后代,(2)筛选方法(检验单一特性或评估所有可能的体克隆变异、测定所需特性遗传性的统计学…     

獐茅HAK基因表达调控区的分离及其在水稻中的功能分析

獐茅高亲和性K+转运蛋白基因(AlHAK1)是从单子叶禾本科盐生植物獐茅(Aeluropus littoralis(Gouan)Parl)中克隆,对于细胞营养和离子渗透调节起关键作用。为了进一步了解AlHAK1基因的表达调控机制,文章采用基因组步移法分离了AlHAK1基因转录起始位点上游长度约1.3 kb的启动子区域。启动子顺式元件分析显示该序列具有典型的TATA和CAAT盒,以及一些与植物生长发育和环境响应相关的顺式元件。为了明确AlHAK1启动子的功能,将其与GUS基因融合构建到植物表达载体pCAMBIA1301上,通过农杆菌介导转化法导入水稻中。对转基因植株进行GUS组织化学染色,结果显示在转化AlHAK1启动子水稻的根、茎、叶、花药和内外稃部位均检测到GUS活性。GUS荧光定量分析显示AlHAK1启动子调节GUS表达活性低于组成型启动子CaMV35S和Ubiquitin,但其根部和茎部的GUS活性相对较高。对转化植株进行不同胁迫处理后检测GUS活性,结果表明受到ABA、干旱、高温的诱导后其茎部和根部GUS活性有所提高,推测位于该启动子-682 bp的HSE元件和-1 268 bp的MybBS元件可能在高温、ABA和干旱诱导的表达调控中起作用。     

烟草tga1a基因的表达对外源基因在植物中表达的影响

烟草DNA结合蛋白TGA1a可特异地作用于CaMV35S增强子的激活序列as-1(-83~-63), 并表现为转录激活功能. 为了研究tga1a基因的表达对外源基因在植物中表达的影响, 将它置于维管束特异性启动子rolC下游, 并与CaMV35S启动子控制的报道基因串联成一种反式调控系统, 构建了植物表达载体, 同时, 以CaMV35S和rolC分别控制的报道基因构建植物表达载体为阳性对照. 通过农杆菌介导方法转化烟草和分子鉴定, 证明报道基因存在于转化烟草基因组中, 分别测定了不同转基因单株的GUS活性, 结果表明: rolC控制下的tga1a的表达显著增强了CaMV35S控制下的报道基因表达, 其GUS活性明显高于CaMV35S或rolC单独调控报道基因的转化植株, 单株的最高GUS活性达到两个阳性对照的10倍以上. 组织化学定位证实该串联系统使GUS蛋白主要集中在维管束组织. 这一研究结果为提高外源基因在转基因植株中的表达水平和外源基因的组织特异性表达创立了一个新模式.     

内含子数量改变GUS基因的瞬时表达调控

内含子是基因的重要组成部分,它与功能基因表达之间的关系越来越被重视.本研究以pCAMBIA3301为载体,利用玉米泛素启动子Ubi1和水稻肌动蛋白启动子Actin1构建两个GUS基因表达载体p33U1和p33A1,同时设置3个对照载体.通过基因枪轰击法将上述载体转入水稻胚性愈伤组织,探讨内含子对外源目的基因表达的调控作用.组织化学检测结果表明:CaMV35S启动子调控下的iGUS (带内含子)基因能够顺利表达;同样,Actin1启动子(带内含子)调控下的不带内含子的GUS基因也可以正常表达,而当Actin1启动子(带内含子)驱动iGUS基因时,则导致GUS染色反应不能发生.Ubi1启动子(带内含子)调控GUS基因的瞬时表达也得出类似结果,证明表达框中内含子的数量为1个或两个时,对GUS基因的表达起到了不同的调控作用.本研究结果对植物表达载体构建及功能基因表达都具有指导意义.     

棉花曲叶病毒大基因间区启动子在宿主植物中的表达活性

棉花曲叶病毒(CLCuV)是一种单链DNA病毒,属于双生病毒亚组Ⅲ.为了研究其基因组大基因间区(LIR)的功能,以CLCuV侵染的烟草叶片组织总DNA为模板,通过聚合酶链反应扩增LIR并插入克隆载体.将LIR分别以互补链及病毒链基因转录方向与gus报告基因和nos终止子融合,构建了植物表达载体.通过农杆菌介导的方法转化烟草并测定转化植株的GUS活性,实验结果表明,LIR在互补链基因方向具有强启动子活性,GUS平均活性是CaMV 35S启动子的5～6倍,单株最高的GUS活性达到CaMV 35S启动子的10倍;组织化学定位证实其在叶肉及维管组织均有活性.LIR在病毒链基因方向的启动子活性较低.报道了CLCuV来源的分离的LIR在互补链基因方向可作为一种新型的强启动子元件应用于植物遗传操作.     

番茄rbcS3A启动子控制的GUS融合基因在转基因水稻中的表达

为研究不同启动子用于转基因水稻,克隆了番茄Rubisco小亚基rbcS3A基因的5′上游调控区,构建了由rbcS3A启动子引导的GUS嵌合基因,并经农杆菌介导导入到水稻中。对转基因水稻植株中GUS活性的定性与定量测定结果表明,rbcS3A启动子可驱动GUS报告基因在转基因水稻植株茎和叶组织中高效表达,而在根和种子等器官中不表达或表达活性极弱,表现出一定的组织特异性。在转基因水稻中,番茄rbcS3A启动子驱动外源基因的表达不受光诱导。     

水稻 ADP-葡萄糖焦磷酸化酶小亚基 I 基因的启动子分析

水稻（Oryce sativa L．）基因组中的ADP-葡萄糖焦磷酸化酶小亚基（ADP-Glucose pyrophosphorylase small subunit,OsAgpS）由两个基因编码,即OsAgpSl和OsAgpS2。其中OsAgpSl基因产生两个转录本OsAgpSla和OsAgpSlb,区别在第一个外显子的位置不同。通过RT—PCR方法分析了两个转录本在水稻组织和胚乳不同发育时期的表达特性;同时通过报告基因GUS检测了两个转录本上游转录调节区DNA片段的转录启动特性。结果表明,两个启动子与其下游转录本的表达模式完全一致,即OsAgpSla转录本和OsAgpSla上游启动子控制的GUS基因主要在胚乳中高水平表达,在叶片中有很低水平的表达;而OsAgpSlb转录本和OsAgpSlb上游启动子控制的GUS基因主要在叶片和胚乳发育早期低水平表达。这说明OsAgpSl基因产生的两个转录本是由不同的启动子控制转录的,OsAgpSla上游启动子可以作为胚乳表达用启动子。