Nupr1调控非小细胞肺癌细胞迁移、凋亡机制的研究

目的:探讨核蛋白1(Nupr1)调控非小细胞肺癌细胞迁移、凋亡机制的研究。方法:肿瘤抑制剂盐酸素(salinomycin)不同时间处理非小细胞肺癌细胞A549后采用Western Blot法检测非小细胞肺癌细胞A549中Cleaved Caspase-3、Nupr1的蛋白表达;Transwell小室检测Nupr1基因沉默后非小细胞肺癌细胞A549细胞体外迁移、侵袭能力的变化;Western Blot法检测Nupr1沉默后非小细胞肺癌细胞A549 MMP-2、TIMP-1的蛋白表达;流式细胞仪检测Nupr1沉默后非小细胞肺癌细胞A549的凋亡情况。结果:与未经肿瘤抑制剂salinomycin处理对照组相比较,salinomycin处理后的非小细胞肺癌细胞A549中Nupr1蛋白表达量下降,Cleaved Caspase-3蛋白表达量升高,并且随着作用时间呈依赖关系。Nupr1-siRNA转染组的迁移能力相比对照组未转染组下降(64.4±7.2)%,Nupr1-siRNA转染组的侵袭能力相比对照组下降(58.7±7.3)%。与未转染Nupr1-siRNA对照组相比较,转染后TIMP-1的表达明显上调,而MMP-2的表达则明显下调。流式细胞仪检测结果显示Nupr1沉默后非小细胞肺癌细胞A549出现大量凋亡。结论:Nupr1基因沉默后通过上调TIMP-1的表达,下调MMP-2的表达降低肺癌A549细胞的侵袭和迁移能力,进而促进非小细胞肺癌细胞凋亡。     

香鳞毛蕨苷提取物E对人肺癌A549细胞增殖及凋亡的影响

目的:研究香鳞毛蕨苷提取物E(Fragranoside E)对人肺癌A549细胞增殖及凋亡的影响。方法:将体外培养的人肺癌A549细胞分为对照组(0.1%DMSO、100 nM紫杉醇)和实验组,通过CCK-8实验、克隆形成实验检测细胞增殖情况;检测乳酸脱氢酶(LDH)水平以探讨Fragranoside E的细胞毒性;透射电镜及流式细胞术检测A549细胞的凋亡情况。进一步采用5mM N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine,NAC)预处理A549细胞2 h后,采用荧光显微镜观察细胞内ROS的释放情况。结果:CCK8及克隆形成实验结果提示Fragranoside E呈浓度和时间依赖性抑制A549细胞增殖(P0.05);≤40μM Fragranoside E处理A549细胞对其LDH的释放无显著影响(P0.05);而40μM Fragranoside E可诱导A549细胞凋亡,细胞内ROS升高,NAC(5 m M)预处理2 h后,细胞内ROS(112.6%±12.3%)较Fragranoside E处理组显著降低(P0.05)。结论:Fragranoside E能够抑制A549细胞增殖,诱导其凋亡,其抗肿瘤活性可能与细胞内ROS释放有关。     

高表达精脒/精胺N1-乙酞基转移酶对人肺癌A549细胞株生长的影响

旨在研究人精脒/精胺N1-乙酰基转移酶(spermidine/spermine N1-acetyltransferase,SSAT)高表达对人肺癌A549细胞生长的影响。以pCR2.1-SSAT质粒为模板,PCR法扩增人SSAT基因并克隆至pcDNA3.1表达载体。重组质粒转染A549细胞后,RT-PCR法和Western blotting法筛选SSAT高表达的细胞株。MTT法检测细胞增殖,流式细胞仪检测细胞周期。成功构建pcDNA3.1-SSAT重组质粒,用该质粒转染A549细胞后,筛选获得稳定高表达SSAT的细胞株。SSAT高表达导致细胞生长抑制,S期细胞减少和自发性凋亡细胞增多。结果显示,稳定高表达SSAT可在A549肺癌细胞中部分模拟多胺类似物类抗癌药物的药理活性,导致瘤细胞生长抑制和细胞凋亡。     

EGCG对LPS刺激人肺腺癌A549细胞凋亡及CUGBP1蛋白表达的影响

目的:研究表没食子儿茶素-3-没食子酸酯(epigallocatechin-3-gallate,EGCG)对炎性刺激的人肺腺癌A549细胞增殖和凋亡的影响及与CUGBP1表达的关系。方法:MTT法检测EGCG和LPS刺激A549细胞增殖活性的影响;流式细胞仪检测细胞凋亡;免疫细胞化学检测EGCG对LPS刺激人肺腺癌A549细胞内CUGBP1蛋白的表达。结果:与对照组相比,LPS体外显著促进A549细胞增殖,其胞核胞质内CUGBP1表达明显增强(P0.01)。加入EGCG可拮抗LPS促A549细胞增殖的作用,促进其凋亡,明显抑制LPS刺激的A549细胞内CUGBP1的表达(P0.01)。CUGBP1蛋白定量分析可知EGCG和LPS共同孵育A549细胞4h、24h时,细胞中的CUGBP1蛋白表达量较单纯LPS作用时降低。但EGCG和LPS共同孵育A549细胞24h,A549细胞中胞核CUGBP1蛋白表达量(1210.565±3.46)较4h时胞核CUGBP1蛋白表达量(67.344±3.68)高,差异有统计学意义(t=927.164,P0.001)。结论:EGCG可能通过干扰CUGBP1基因的表达抑制炎症刺激人肺腺癌细胞A549的增殖,促进其凋亡。     

HSP70在放线菌素D所致肺腺癌细胞增殖抑制和凋亡中的作用

为探讨热休克蛋白70(heatshockprotein70,HSP70)在肺腺癌中的表达及其作用,首先采用免疫印迹检测经临床支纤镜确诊并行手术切除的肺腺癌组织标本中HSP70的表达,结果显示在癌旁正常组织中HSP70的表达量显著低于其在癌组织中的表达量.其次,采用HSP70反义寡核苷酸阻断A549细胞中HSP70表达后,经MTT和Hoechst33258检测发现,HSP70下调能显著促进放线菌素D(actinomycinD,ActD)所致的A549细胞增殖抑制及凋亡,反义寡核苷酸处理组与正义或随机寡核苷酸处理组比较P值均小于0.05.进一步构建HSP70真核重组质粒并瞬时转染A549细胞后,能显著增加A549细胞中HSP70表达,同时采用MTT和流式细胞术及基因组DNA琼脂糖凝胶电泳检测发现,HSP70过表达能显著抵消ActD所致细胞增殖抑制及凋亡,转染HSP70重组质粒组与转染空载体组相比P值小于0.05.上述结果提示,HSP70在肺腺癌组织中高表达,高表达的HSP70在降低肺腺癌细胞对ActD的敏感性及促进癌细胞增殖与抑制凋亡等方面发挥了重要作用.     

阳离子脂质体介导RNA干扰的效果评价

考察自制的肽型阳离子脂质体CDO14作为RNA转染载体的细胞毒性及其运载si RNA进行RNA干扰的效果。通过MTT法检测脂质体对稳定表达荧光素酶的肺癌A549(Luc-A549)细胞的毒性。以脂质体为载体将荧光素酶si RNA(Luc-si RNA)转染至Luc-A549细胞内,用发光仪检测转染细胞内荧光素酶含量,BCA法检测细胞内总蛋白含量。在裸鼠腋下接种Luc-A549细胞,成瘤后尾静脉注射Luc-si RNA和脂质体的复合物,利用活体成像系统检测模型小鼠体内荧光素酶的表达量。细胞毒性实验表明,自制脂质体的毒性与商品脂质体DOTAP相近,低于商品脂质体Lipo2000;细胞转染实验表明自制脂质体作为基因转染载体的转染效率高于DOTAP;体内转染实验表明CDO14作为载体转染效果优于DOTAP。结果表明,肽型阳离子脂质体CDO14具有毒性小、转染效率高等优点,有望作为转染载体用于基因治疗。     

MEKK3稳定表达细胞株的建立及其对A549细胞增殖的影响

目的 构建人MEKK3基因编码区序列（cDNA）的真核表达载体、建立其稳定表达细胞株并观察其对肺腺癌细胞增殖的影响.方法 从A549细胞中提取总RNA,应用RT-PCR扩增MEKK3 cDNA的全长序列后克隆入pcDNA3.1/hygro（＋）质粒中,构建成MEKK3基因的真核表达载体,然后转染入人肺腺癌A549细胞中,潮霉素筛选稳定转染克隆,通过MTT实验,研究转染MEKK3基因前后细胞增殖的变化.结果 重组载体经酶切鉴定和测序证实目的 基因正确无误,Western印迹检测结果显示MEKK3基因在A549细胞中具有良好的表达;荧光实时定量PCR结果表明MEKK3基因在其稳定转染的A549细胞克隆中表达上调,与空载体稳定转染及未转染细胞比较,差异具有统计学意义（P＜0.05）;MTT结果显示MEKK3表达上调的稳定克隆组,A549细胞的增殖活性显著增强（A570=0.876 1±0.074 5）,明显高于空载体稳定转染组（A570=0.582 8±0.070 3）及未转染亲代细胞组（A570=0.584 9±0.035 2）,差异具有统计学意义（P＜0.01）,而后两者之间差异无统计学意义（P＞0.05）.结论 MEKK3表达上调可导致肺腺癌细胞的增殖增强.     

LATS1过表达对肺癌A549细胞增殖及周期的影响

通过过表达手段上调大肿瘤抑制因子1（1arge tumor suppressor gene 1,LATS1）基因在A549细胞中的表达,研究LATS1对A549细胞生长和细胞周期调控的作用。构建过表达LATS1基因的慢病毒载体,转染A549N胞株,采用RT-PCR和蛋白质印迹法检测转染后A549细胞中LATS1、YAPmRNA和蛋白的表达效率;流式细胞术检测细胞凋亡、周期情况：CCK-8检测细胞的增殖水平变化。结果发现,过表达LATS1慢病毒载体转染A549细胞株后,LATS1mRNA及蛋白表达水平高于未处理组及转染空载体组,YAPmRNA及蛋白表达水平低于未处理组及转染空载体组;过表达LATS1慢病毒转染后,A549细胞增殖率从第五天开始低于对照组（P〈0．05）,过表达组细胞G1期比例明显增高（P〈0．05）,凋亡率明显增加（P〈0．05）,差异均有统计学意义。以上结果提示,LATS1可通过下调YAP的表达水平促进A549细胞的凋亡,诱导G1期阻滞,降低细胞的增殖能力。     

外源p21~(WAF1)转染对人成纤维细胞凋亡的影响

构建了有义和反义ｐ２１ＷＡＦ１ 逆转录病毒表达载体, 分别经脂质体包裹后转染人胚肺二倍体成纤维细胞（２ＢＳ）。Ｓｏｕｔｈｅｒｎ 印迹杂交证实转染细胞中外源ｐ２１ ＷＡＦ１ｃＤＮＡ 已整合入基因组中。与空载体转染细胞相比, 有义转染细胞的ｐ２１ＷＡＦ１ ｍ ＲＮＡ 表达上升; 细胞增殖速度明显减慢; 对丁酸钠诱导凋亡的敏感性降低, 表现在细胞存活率升高, 核ＤＮＡ 梯状断裂片段出现的时间滞后, 断裂片段浓度下降, 流式细胞计检测的凋亡峰面积缩小。而反义转染细胞的ｐ２１ＷＡＦ１ ｍ ＲＮＡ表达下降; 细胞增殖速度较快; 对丁酸钠诱导凋亡的敏感性上升, 有关表现与有义转染细胞相反。说明２ＢＳ细胞内ｐ２１ＷＡＦ１ 的表达量与其被丁酸钠诱导凋亡的能力呈负相关。     

EGCG对LPS刺激人肺腺癌A549细胞凋亡及CUGBP1蛋白表达的影响

目的：研究表没食子儿茶素-3-没食子酸酯（epigallocatechin-3-gallate,EGCG）对炎性刺激的人肺腺癌A549细胞增殖和凋亡的影响及与CUGBP1表达的关系。方法：MTT法检测EGCG和LPS刺激A549细胞增殖活性的影响;流式细胞仪检测细胞凋亡;免疫细胞化学检测EGCG对LPS刺激人肺腺癌A549细胞内CUGBP1蛋白的表达。结果：与对照组相比,LPS体外显著促进A549细胞增殖,其胞核胞质内CUGBP1表达明显增强（P〈0.01）。加入EGCG可拮抗LPS促A549细胞增殖的作用,促进其凋亡,明显抑制LPS刺激的A549细胞内CUGBP1的表达（P〈0.01）。CUGBP1蛋白定量分析可知EGCG和LPS共同孵育A549细胞4h、24h时,细胞中的CUGBP1蛋白表达量较单纯LPS作用时降低。但EGCG和LPS共同孵育A549细胞24h,A549细胞中胞核CUGBP1蛋白表达量（1210.565±3.46）较4h时胞核CUGBP1蛋白表达量（67.344±3.68）高,差异有统计学意义（t=927.164,P〈0.001）。结论：EGCG可能通过干扰CUGBP1基因的表达抑制炎症刺激人肺腺癌细胞A549的增殖,促进其凋亡。     

pcDNA3.1/myc-His-DJ-1^M26I重组载体构建及其对NIH3T3细胞增殖和凋亡研究

目的构建pcDNA3.1/myc-His-DJ-1和pcDNA3.1/myc-His-DJ-1M26I重组表达载体,为研究DJ-1M26I突变与细胞增殖、凋亡的关系及建立转基因动物模型奠定基础。方法采用突变试剂盒将DJ-1蛋白第26位氨基酸进行突变,分别构建pcDNA3.1/myc-His-DJ-1和pcDNA3.1/myc-His-DJ-1M26I重组表达载体,并采用脂质体介导的方法分别将其转染入NIH3T3细胞,500μg/mL G418压力筛选稳定克隆,对2种转染细胞在DNA水平、RNA水平和蛋白质水平进行鉴定,采用MTT染色方法和AnnexinV-FITC试剂盒进行转染阳性克隆细胞的细胞活力与细胞凋亡检测。结果 pcDNA3.1/myc-His-DJ-1和pcDNA3.1/myc-His-DJ-1M26I重组质粒转染NIH3T3细胞经G418筛选后,PCR方法检测分别获得1个和3个阳性细胞克隆,RT-PCR及western blot方法进行DJ-1-His基因表达检测,结果均证明外源插入基因的表达,MTT实验结果初步证明转染DJ-1M26I基因的NIH3T3阳性细胞组细胞增殖速率低于正常NIH3T3细胞组（P〈0.05）,转染DJ-1基因的NIH3T3阳性细胞组细胞增殖速率与正常NIH3T3细胞相比无明显差别;细胞凋亡检测表明转染DJ-1M26I基因的NIH3T3阳性细胞组细胞凋亡率高于正常NIH3T3细胞,转染DJ-1基因的NIH3T3阳性细胞组细胞凋亡率低于正常NIH3T3细胞（P〈0.05）。结论成功构建pcDNA3.1/myc-His-DJ-1和pcDNA3.1/myc-His-DJ-1 M26I重组表达载体,成功筛选出稳定表达人DJ-1及DJ-1 M26I的NIH3T3细胞。DJ-1 M26I基因突变更易导致NIH3T3细胞的凋亡。     

尘螨变应原Derf1真核表达载体的构建及转染CHO细胞

目的：构建尘螨变应原Der f1真核表达载体,转染真核细胞并进行蛋白表达。方法：根据Genebank中Der f1基因的核酸序列（AB034946）,设计引物,采用PCR法,从保存的JM109工程菌中扩增Der f1编码基因,克隆到真核表达质粒pcDNA3.1/myc-his A上,以脂质体法转染CHO细胞,经G418筛选,进行稳定表达细胞株的筛选和鉴定。结果：将目的基因Der f1成功连接到pcDNA3.1/myc-hisA-Derf1并转染CHO细胞,获得稳定表达的CHO细胞株。结论：成功构建了尘螨变应原Der f1真核表达载体,并转染CHO细胞表达蛋白质。     

口蹄疫病毒多基因重组质粒在BHK-21细胞中的表达

利用定点突变的原理,获得包含有口蹄疫病毒P1,2A,3C及部分2B编码区的目的基因片段,KpnⅠ和XbaⅠ双酶切后,定向克隆于真核表达质粒载体pcDNA3.1（+）,经筛选、鉴定及DNA序列分析后,将重组质粒pcDNA3.1/P12X3C转染BHK-21细胞,通过双抗体夹心ELISA方法和间接免疫荧光标记方法,检测细胞中表达的口蹄疫病毒抗原。结果表明,口蹄疫病毒基因片段正确克隆到真核表达质粒载体上,重组质粒pcDNA3.1/P12X3C可在BHK-21细胞中表达FMDV目的蛋白。     

反义CD151基因转染对大鼠血管平滑肌细胞迁移的影响

目的观察pcDNA3.1真核表达载体介导的反义CD151基因转染对培养的大鼠动脉平滑肌细胞(VSMCs)迁移的影响。方法构建携带全长正义和反义CD151的真核表达载体pcDNA3.1-CD151和pcDNA3.1-anti-CD151重组质粒,转染体外培养的VSMCs,以RT-PCR和Western blot方法检测CD151的表达,用Boyden趋化小室方法观察细胞迁移。结果与载体对照组、脂质体对照组和空白对照组3组均值比较,转染48h后,反义CD151组mRNA表达降低58%,蛋白表达降低51%,正义CD151组的VSMCs CD151mRNA表达增加171%,蛋白表达增加133%;趋化迁移的细胞数,反义CD151组为37.9±6.3,正义CD151组为86.5±12.4;载体对照组、脂质体对照组和空白对照组分别为60.3±7.1、61.8±7.6和67.3±9.6。反义CD151组显著低于其余各组(P<0.01),正义CD151组显著高于其余各组(P<0.01)。结论pcDNA3.1真核表达载体介导的反义CD151转染,通过抑制CD151的表达,能够显著抑制大鼠VSMCs的迁移。     

SREBP-1基因过表达促进人肾小管上皮细胞甘油三酯形成

目的 SREBP-1重组质粒转染人肾小管上皮细胞(HKC)检测SREBP-1基因表达和细胞内脂滴的关系。方法体外培养人肾小管上皮细胞并随机分为空白对照组、pcDNA3.1空质粒对照组和pcDNA3.1-SC1重组质粒转染组,采用阳离子脂质体法将SREBP-1特异性质粒pcDNA3.1-SC1及pcDNA3.1空质粒转染到细胞内并培养48小时,半定量RT-PCR和Westernblot分析目标基因表达丰度的变化,并采用油红O染色检测细胞内脂滴。结果 pcDNA3.1-SC1重组质粒转染的细胞内SREBP-1mRNA表达呈现明显升高,扩增条带积分光密度值分别是空白对照组和阴性对照组的6.158倍和4.194倍,SREBP-1蛋白也出现明显上调,条带积分光密度值为3.092±0.254。空白对照组和pcDNA3.1阴性对照组细胞内均未见有红染脂滴颗粒,而pcDNA3.1-SC1重组质粒转染组中出现了清晰的红染颗粒。结论 SREBP-1表达可增加人肾小管上皮细胞脂肪合成证实HKC细胞中SREBP-1表达和脂滴形成之间存在有直接关系。     

尘螨变应原Der f1 真核表达载体的构建及转染CHO 细胞

目的:构建尘螨变应原Der f1真核表达载体,转染真核细胞并进行蛋白表达.方法:根据Genebank中Der f1基因的核酸序列(AB034946),设计引物,采用PCR法,从保存的JM109工程菌中扩增Der f1编码基因,克隆到真核表达质粒pcDNA3.1/myc-hisA上,以脂质体法转染CHO细胞,经G418筛选,进行稳定表达细胞株的筛选和鉴定.结果:将目的基因Der f1成功连接到pcDNA3.1/myc-hisA-Derf1并转染CHO细胞,获得稳定表达的CHO细胞株.结论:成功构建了尘螨变应原Der f1真核表达载体,并转染CHO细胞表达蛋白质.     

人同源盒基因NKX3.1对前列腺癌细胞的诱导凋亡作用

构建人同源盒基因NKX3.1 cDNA真核表达载体,研究其在前列腺癌细胞PC-3、LNCaP 中的表达及对细胞的促凋亡作用.以人前列腺癌细胞LNCaP细胞中的总RNA为模板,RT-PCR扩增NKX3.1基因全长编码片段,将NKX3.1 cDNA重组到真核表达载体pcDNA3.1（+）中; 将pcDNA3.1-NKX3.1表达载体瞬时转染前列腺癌细胞PC-3和LNCaP 细胞,用RT-PCR和Western印迹检测NKX3.1 cDNA在转录水平和蛋白水平的表达;绘制细胞生长曲线,观察NKX3.1对前列腺癌细胞增殖的抑制作用;用DNA/ladder和流式细胞术检测NKX3.1对前列腺癌细胞凋亡的影响,进一步用RT PCR检测凋亡相关基因caspase3、caspase8、caspase9、Apaf1、survivin和Bcl2表达的变化.人同源盒基因NKX3.1 cDNA真核表达载体pcDNA3.1-NKX3.1经酶切及测序鉴定正确. pcDNA3.1-NKX3.1转染PC-3和LNCaP细胞后,经RT-PCR和Western印迹证明能有效表达NKX3.1.生长曲线显示,前列腺癌细胞转染NKX3.1 cDNA后细胞增殖受到抑制;前列腺癌细胞转染NKX3.1 cDNA 48 h后,DNA电泳呈现具有凋亡特征的DNA ladder;流式细胞术检测出现明显凋亡峰;RT-PCR检测凋亡相关基因.结果显示,caspase3、caspase8、caspase9基因表达明显增加,Bcl2基因表达明显减少.本研究成功构建了真核表达载体pcDNA3.1 NKX3.1, 转染PC3和LNCaP细胞后能有效表达,并对细胞具有诱导凋亡作用     

pcDNA3.1（＋）-LYVE-1真核表达质粒的构建及其在COS-7细胞中的表达

目的 构建人淋巴管内皮细胞特异标志物LYVE-1融合基因表达质粒,观察其在COS-7细胞中的表达,为进一步探讨该标志物在肿瘤淋巴转移中的作用提供工具.方法 从本院结肠癌根治术患者术所取组织中的淋巴结抽提总RNA,RT-PCR扩增LYVE-1基因片段,并将其插入pMD19-T Simple Vector进行测序,鉴定正确后构建pcDNA3.1（＋）-LYVE-1并转染COS-7细胞,RT-PCR、Western印迹检测目的 蛋白表达,间接免疫荧光检测该基因表达在COS-7细胞上.结果 成功获取了人淋巴管内皮细胞特异标志物LYVE-1全长cDNA,构建了其真核表达载体pcDNA3.1（＋）-LYVE-1,转染COS-7细胞后检测出目的 蛋白的表达,并且证明该基因表达在细胞上.结论 成功构建了pcDNA3.1（＋）-LYVE-1重组质粒,为进一步研究LYVE-1在肿瘤淋巴管转移中的功能提供了重要的实验材料.     

人sTNFR1基因的克隆以及在NIH3T3细胞中的稳定表达

以He1a细胞的总RNA为模板,用RT—PCR方法扩增sTNFR1全编码区基因片段,构建含有目的片段的T载体克隆及真核表达载体pcDNA3．1（-）重组质粒亚克隆,将重组质粒和脂质体共同转染NIH3T3细胞系,G418筛选稳定转染细胞株．经核苷酸序列测序和酶切鉴定,成功构建了pcDNA3．1（-）-sTNFR1真核表达质粒,脂质体法建立了高效表达sTNFRI的稳定转染细胞系,并经RT—PCR和Western Blotting鉴定．人sTNFR1基因能在NIH3T3细胞系中稳定表达,为今后的研究打下了基础．     

应用微阵列技术筛选PS1TP1基因转染细胞差异表达基因

阐明乙型肝炎病毒(HBV)前S1蛋白反式激活蛋白1(PS1TP1)的表达对于肝细胞的基因表达谱的影响。应用基因芯片技术对于pcDNA3.1()和pcDNA3.1()PS1TP1分别转染的HepG2细胞的基因表达谱进行分析。以肝癌细胞系HepG2基因作为模板,应用聚合酶链反应(PCR)技术扩增PS1TP1基因片段,以常规的分子生物学技术构建表达载体pcDNA3.1()PS1TP1。以脂质体技术转染肝母细胞瘤细胞系HepG2,提取总RNA,逆转录为cDNA,与转染空白表达载体pcDNA3.1()的HepG2细胞进行DNA芯片分析并比较。在4096个基因表达谱的筛选中,发现有8个基因表达水平显著上调,14个基因表达水平显著下调。PS1TP1基因的表达对于肝细胞基因表达谱有显著影响。DNA芯片技术是分析反式调节靶基因的有效技术途径。