大粉瘤菌小亚基rDNA片段的克隆测序

对大粉瘤菌Lycogalaflavofuscum的19SrDNA片段进行了克隆测序,序列长度为1443bp。同时将之与多头绒泡菌的相应序列进行了比较,其序列同源性为58.16%。     

大粉瘤菌小亚基rDNA片段的克隆测序*

对大粉瘤菌Lycogalaflavofuscum的19SrDNA片段进行了克隆测序,序列长度为1443bp。同时将之与多头绒泡菌的相应序列进行了比较,其序列同源性为58.16%。     

稻瘟菌突变体T-DNA插入位点的精细定位和插入模式的研究

随机挑取已构建的37个稻瘟菌T-DNA突变株,利用TAIL-PCR技术扩增出T-DNA插入位点的侧翼序列,测序并进行比对分析。结果显示:成功获得扩增产物并测序的序列共有39条,T-DNA边界序列为稻瘟菌序列的有19条,其余20条为载体主干序列。在这有效扩增为稻瘟菌序列的19条中,有10条是T-DNA右侧翼序列与稻瘟菌序列,9条为左侧翼序列加稻瘟菌序列。分析T-DNA剪切位点,10条右侧翼序列中有9条的剪切位点相同,这与农杆菌介导T-DNA转化植物一样。而左边界的剪切位点就没有这种规律性。研究也精细确定了17个不同突变株的T-DNA插入位置,为后续的基因功能研究奠定基础。     

一种褐飞虱病原真菌的分子生物学鉴定

从田间褐飞虱Nilaparvata lugens( St(a)l)罹病虫体分离得到一株绿僵菌,以该菌为供试菌体,采用氯化苄法、CTAB法以及裂解液法分别提取了该菌的基因组DNA;以ITS1和ITS4为绿僵菌通用引物,对供试菌株的rDNA ITS序列进行PCR扩增、琼脂糖凝胶电泳检测和序列分析,并在核酸序列数据库中进行同...     

黑发菌核糖体DNA小亚基片段的序列测定

用Rusketal 于 1995年设计的引物SMNUR10 1和Whiteetal 1990年设计的引物NS4对黑发菌 (Co matrichanigra)的rDNA小亚基片段进行了PCR扩增 ,并将扩增产物克隆到大肠杆菌JM10 9中进行测序 ,测得的序列长度为 115 4bp。同时将其与多头绒泡菌的相应序列进行了比较 ,其序列同源性为 6 6 %。     

球毛壳菌60S核糖体蛋白L10a基因克隆与特性分析

用粗糙脉孢菌（Neurospora crassa）XP_322380和赤霉菌（Gibberella zeag）PH-1（EAA76971）的60S核糖体蛋白L10a基因（60S ribosomal protein L10a,RPL10a）蛋白序列对球毛壳菌（Chaetomium globosum）ESTs序列数据库进行tBlastn检索,获得了球毛壳菌RPL10a cDNA序列。cDNA序列长765bp,开放阅读框654bp,编码217个氨基酸组成的多肽,蛋白分了量为23．9kD。BlastP分析表明该基因氨基酸序列与粗糙脉胞菌相似最高为89％;与玉蜀黍黑粉菌（Ustilago maydis）相似性最低为78％。cDNA序列及推测的氨基酸序列在GenBank登录（登录号分别为AY669070,AAT74578）。     

临床常见镰刀菌的鉴别

目的从分子生物学角度寻找一种快速准确鉴定临床常见镰刀菌的方法。方法将受试镰刀菌接种于PDA培养基,观察其菌落及镜下形态,在此基础上PCR扩增受试镰刀菌的rDNA ITS并测其序列,在GenBank核酸序列数据库进行同源序列搜索及分析。选择限制性内切酶Dra Ⅱ和Cfr13 Ⅰ进行RFLP。设计了茄病镰刀菌的种特异性引物Sol1、Sol2,初步验证其特异性。结果形态学鉴定结果显示,茄病镰刀菌所占比例最高,除2株串珠镰刀菌外,其余镰刀菌ITS序列分析的结果与形态学鉴定结果一致。茄病、层生和串珠镰刀菌的Dra Ⅱ、Cfr13 I酶切带形互不相同。用Sol1、Sol2扩增受试菌的rDNA ITS,只有茄病镰刀菌为阳性。结论rDNA ITS序列测定及其PCR-RFLP可用于初步鉴别几种临床常见镰刀菌,合适的种特异性引物可以初步快速鉴定茄病镰刀菌。     

黄翅大白蚁后肠优势菌大白蚁营发酵菌的全基因组序列分析

【目的】营发酵单胞菌属Dysgonomonas是黄翅大白蚁后肠的第二优势微生物。前期研究中,我们从黄翅大白蚁后肠分离出一种命名为大白蚁营发酵菌的新菌。为深入了解大白蚁营发酵菌在宿主白蚁体内发挥的作用和功能,有必要解析大白蚁营发酵菌的基因组序列信息。【方法】使用Illumina Miseq测序平台获取该菌的全基因组序列,将其全基因组序列经过注释的基因蛋白质序列提交COG和KEGG数据库进行BLASTp比对分析,确定该菌潜在的重要酶类和代谢途径,并对个别纤维素酶活进行检测。【结果】大白蚁营发酵菌整个基因组大小为4655756 bp,GC含量为38.54%,DDBJ数据库登录号为BBXL01000001–BBXL01000078。生物信息学分析结果表明菌株大白蚁营发酵菌具有多个木质纤维素降解酶基因,且具备完整的木质纤维素降解和乙酸、乳酸生成通路。此外发现该菌株中存在与氮源代谢和抵御病原体相关的基因。【结论】本研究首次解析大白蚁营发酵菌的全基因组序列,了解其基因组基本特征,初步探讨了该菌降解木质纤维素的过程,为细菌协助宿主白蚁降解木质纤维素提供了理论基础,同时为该菌可能参与宿主白蚁氮源代谢和抵御病原体入侵提供了依据。     

一株具有广谱抗菌活性炭样小单孢菌的全基因组序列测定

【目的】炭样小单孢菌JXNU-1是一株具有广谱抗菌活性的放线菌,研究揭示该菌的基因组序列信息。【方法】采用高通量测序技术对炭样小单孢菌JXNU-1的基因组DNA测序,利用SOAPdenovo软件组装,人工PCR修补基因组部分缺口,然后进行生物信息学分析。【结果】对炭样小单孢菌JXNU-1的全基因组序列进行了测定和注释,得到基因组精细图,相关序列已提交GenBank,获得登录号为JXSX00000000。【结论】研究为揭示炭样小单孢菌JXNU-1抗生素产生机制及其抗菌机理提供了基础数据,对进一步研发其抗生素具有重要的理论意义和巨大的应用价值。     

基于形态特征和ITS序列对7个鹅膏菌属菌株的分类鉴定

以采自浙江省丽水地区的7个鹅膏菌属菌株作为研究材料,在基于形态特征进行初步鉴定的基础上,对7种鹅膏菌的rDNAITS区段进行克隆测序和序列特征比较分析。进一步对ITS序列进行核酸序列数据库GenBank同源性检索比对,将从GenBank检索获得的9个最相似物种的ITS序列连同7种鹅膏菌的ITS序列一起作系统发育分析。结果表明:基于ITS序列对f6、f9和f493个菌株的分子鉴定支持了基于形态特征的鉴定结果,对f5的分子鉴定不支持形态鉴定的结果,f8为鹅膏菌属内某种,f66为鹅膏菌属内某种,并与Amanitafulva,A.atrofusca,A.orientifulva3种鹅膏菌的亲缘关系较近,f7与另外6种鹅膏菌的亲缘关系相差甚远。研究结果提示基于分子水平上的ITS序列分析不能单方面作为大型真菌分类鉴定的可靠依据,可以作为基于传统形态学分类鉴定的辅助参考依据。     

产甲烷古菌中CRISPR簇的研究

【目的】通过对51个产甲烷古菌基因组中成簇的规律间隔短回文重复序列(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)的组成和来源进行研究,推测产甲烷古菌与环境中其他微生物的物质交换和相互作用,在基因组水平上阐述产甲烷古菌之间的遗传差异。【方法】利用CRISPRdb和CRISPRFinder,找出产甲烷古菌基因组中所有潜在的CRISPR簇。对CRISPR簇的基本组成部分进行分析:利用BLASTCLUST对重复序列(Repeat)进行分类;分别将间隔序列(Spacer)与Refseq病毒基因组、Refseq质粒基因组和Refseq产甲烷古菌基因组进行比对,从而获得间隔序列的物种来源和功能信息的注释。【结果】在51个产甲烷古菌中共找到了196个CRISPR簇,这些CRISPR簇中包含了总共4 355条间隔序列。在这些产甲烷古菌中,CRISPR簇的分布是不均匀的,且每个物种的间隔序列数量与其CRISPR簇数量是不成正比的。在对重复序列进行分类之后,发现Mclu1是分布最广且最具代表性的一类重复序列。在4 355条间隔序列中有388条具有物种注释信息,266条具有功能注释信息。从CRISPR簇间隔序列的来源来看,产甲烷古菌曾受到来自Poxiviridae、Siphoviridae以及Myoviridae属病毒的攻击,并且产甲烷古菌之间存在比较广泛的遗传物质交换。【结论】产甲烷古菌基因组中的CRISPR簇在组成和来源上存在较大的差异,这些差异与它们的生存环境有较大的关系。从CRISPR簇的角度阐述了产甲烷古菌之间基因组序列的差异。     

球毛壳菌组蛋白H3基因克隆与特性分析

构建了球毛壳菌菌丝的cDNA文库,并获得了1410条ESTs序列,用里氏木霉(Hypocrea jecorina,AAM76068)和粗糙脉胞菌(Neurospora crassa,CAA25761)的组蛋白H3基因(Histone H3)蛋白序列对球毛壳菌(Chaetomium globosum)ESTs序列本地数据库进行tBlastn检索,获得了球毛壳菌组蛋白H3cDNA序列。cDNA序列全长739bp,开放阅读框411bp,编码136个氨基酸组成的多肽,蛋白分子量为15.4kD。BlastP同源性分析表明该基因与里氏木霉同源性最高为100%;与地钱(Marchantia polymorpha)同源性最低为95%。三级结构预测表明,该蛋白C端为球状结构域,而N端结构对其发挥调控作用起重要作用。该基因的cDNA序列及推测的氨基酸序列在GenBank登录(登录号分别为AY669068,AAT74576)。     

一株基因克隆干扰菌的鉴定及其发酵液降解DNA活性分析

旨在寻找导致基因克隆失败的原因,检测整个电泳环境中是否存在对DNA有强降解力的菌株。依据菌体形态,革兰氏反应以及16S rDNA序列对DNA降解菌株进行鉴定,琼脂糖凝胶电泳分析菌株对DNA的降解活性。结果显示,从DNA电泳槽中分离到了一株菌,革兰氏染色鉴定为阴性菌,对该菌进行液体培养,利用质粒pUC19作为底物,检测该菌发酵液对DNA的降解能力,发现该菌发酵液能够迅速并彻底地降解DNA,其最佳降解温度为45℃,将该菌命名为DD(DNA degrading)。对该菌的16S rDNA进行测序比对后,发现其与粘质沙雷氏菌(Serrtia marcescens)的16S rDNA序列同源性高达100%。结合菌体形态,革兰氏反应以及16S rDNA序列结果,DD菌株为一株粘质沙雷氏菌,DNA降解活性分析显示其具有很强的DNA降解能力。     

志贺菌CRISPR的检测及其与耐药的关系

【目的】检测志贺菌成簇规律间隔的短回文重复序列(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR),并分析其与志贺菌耐药的关系。【方法】根据CRISPR DB数据库公布的志贺菌确定的CRISPR结构序列CRISPR-S2、CRISPR-S4和可能的CRISPR结构序列CRISPR-S1、CRISPR-S3设计四对引物,对60株志贺菌进行PCR扩增。采用CRISPR Finder分析CRISPR,采用改良K-B药敏纸片法检测志贺菌耐药情况,并分析CRISPR-S4与耐药的关系。【结果】确定的CRISPR结构的总阳性率为95%,四个CRISPR位点组成12种CRISPR谱型(A-L),除K型外均含确定的CRISPR结构,新发现1种重复序列和12种间隔序列。60株志贺菌的多重耐药率为53.33%。CRISPR-S4阳性菌株与阴性菌株之间,耐药的分布差异无统计学意义,但多重耐药菌株和耐TE菌株CRISPR-S4的重复序列多为R4.1,其3’末端缺失碱基AC;多重耐药菌株CRISPR-S4的间隔序列多为Sp5.1、Sp6.1和Sp7。【结论】CRISPR在志贺菌中广泛分布。CRISPR重复序列的变异和间隔序列的多样性可能与志贺菌耐药有关。     

基于全基因组序列的弯曲菌特征分析

空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni)和结肠弯曲菌(Campylobacter coli)是引起人类腹泻的主要致病菌。传统生化方法在鉴定弯曲菌时存在步骤多、耗时长、通量低等问题。本研究通过利用生物信息学方法对弯曲菌全基因组进行序列、基因注释、耐药基因、多位点序列分型以及CRISPR-Cas系统等分析,挖掘能够有效区分空肠弯曲菌和结肠弯曲菌的高分辨力特征。实验结果表明,空肠弯曲菌和结肠弯曲菌在基因组序列长度、GC含量、基因数量、多位点序列分型以及CRISPR-Cas系统等方面存在显著差异。同时,研究还发现了一段在空肠弯曲菌基因组中广泛存在的高分辨力CRISPR重复序列。这些特征可用于构建能够准确鉴别空肠弯曲菌和结肠弯曲菌的生物信息学方法。     

1株产漆酶白腐真菌的筛选和鉴定

从不同的生境采集生物样品,利用Bavendamm反应反复筛选产漆酶的白腐真菌。利用真菌通用引物对ITS1/ITS4扩增菌株rDNAITS区序列,对扩增产物进行测序。测序结果在GenBank中进行同源性搜索,下载部分具有代表性种的ITS序列进行序列比对,利用软件MEGA4构建分子系统发育树,通过序列分析,并结合形态学鉴定出4220为香栓孔菌(Trametes suaveolens)。     

中国小型猪空肠弯曲菌的首次分离及其鉴定

目的对中国小型猪空肠弯曲菌进行分离鉴定。方法采集发病小型猪标本,采用细菌学分离培养、生化鉴定、药敏试验、血清学试验、PCR检测等方法进行鉴定,并对细菌的分子生物学特征进行分析。结果分离到1株细菌,经鉴定为空肠弯曲菌（CJp0812）。用空肠弯曲菌flaA基因特异引物对CJp0812细菌的PCR扩增为阳性,经核苷酸序列测定分析证实上述序列与空肠弯曲菌NCTC11168基因序列（GenBank登录号：NC002163）同源性高达99%。结论首次从中国小型猪中分离到了空肠弯曲菌,为进一步研究该菌及开展流行病学调查提供了科学依据。     

基于编码序列、基因间序列和氨基酸序列构建的系统发生关系比较

以7种古菌、46种细菌和10种真核生物的基因组为样本,考虑碱基间的短程关联和长程关联作用,得到编码序列的密码对和基因间序列的三联体对中不同位点的二核苷酸频率,据此构建了基于编码序列和基因间序列的系统发生关系。无论是基于编码序列还是基因间序列对信息进行聚类,古菌或真核均被聚在一支上,表明聚类参数的选择是合适的;与基于氨基酸序列构建的系统发生关系进行两两比较,发现大部分硬壁菌的编码序列与基因间序列之间,以及编码序列与氨基酸序列之间的进化都存在较大差异。通过分析认为,只有综合考虑这三类序列的进化信息,才可能得到更自然的系统发生关系。     

PCR结合酶切-序列比对法鉴定B群脑膜炎奈瑟菌菌株

目的用PCR结合酶切-序列比对法对B群脑膜炎奈瑟菌菌株进行鉴定。方法用玻片凝集法对不同来源的15株B群脑膜炎奈瑟菌菌株进行初步检定,再用PCR结合酶切-序列比对法对上述15株菌株进行进一步鉴定,即用PCR结合酶切法扩增菌株的唾液酸转移酶sia D基因并对PCR产物进行酶切后,用BLAST软件将PCR产物测序结果与Gene Bank中原始sia D序列比对。结果 15株菌株玻片凝集结果均为阳性;15株菌株的PCR产物片段大小均为460 bp;TaqⅠ酶切后,13株菌株的酶切产物片段大小仍为460 bp,其PCR产物测序比对结果与B群脑膜炎奈瑟菌原始sia D序列同源性均达到99%;其余2株酶切产物片段大小约200 bp,与C群脑膜炎奈瑟菌sia D原始基因序列同源性分别为98%和99%。结论 15株菌株经PCR结合酶切-序列比对法鉴定,13株为B群脑膜炎奈瑟菌菌株,2株为C群脑膜炎奈瑟菌菌株;该方法可准确鉴定B群脑膜炎奈瑟菌菌株。     

兼性厌氧纤维素菌的分离与系统发育分析

从四川卧龙中国保护大熊猫研究中心提供的野外放归大熊猫“祥祥”的粪样中,分离到一株产纤维素酶的兼性厌氧菌株。该菌株经初步生理生化鉴定为肠杆菌科沙雷氏菌（Serratia）,命名为Serratia JF-1116。用PCR技术扩增了该菌的16S rDNA全序列,并对其进行了克隆和测序,对该序列在GenBank中的BLAST结果表明,所有与该序列高度同源的序列均为肠杆菌科的16SrDNA基因序列,选取同源性高的菌株的16SrDNA基因序列进行系统发育分析,菌株与3株Serratia聚类在一起。