用酵母双杂交系统筛选与痢疾杆菌侵袭素IPaC相互作用的蛋白

利用酵母双杂交技术筛选与IpaC相互作用的真核细胞蛋白。首先将IpaC全长基因克隆到诱饵蛋白载体pGBKT7中 ,以构建的pGBKT IpaC为靶蛋白质粒 ,筛选人HeLa细胞cDNA文库。在 2× 10 6个克隆中得到 2 2个阳性克隆。其中 2个阳性克隆编码人胶原酶蛋白片段。并且进一步证明与胶原酶片段相互作用的IpaC结构域在 6 2aa～ 170aa之间。提示IpaC可能在胶原酶参与的生物学过程中发挥作用。     

酵母双杂交筛选心脏cDNA文库中与人热激蛋白70相互作用的蛋白质

目的:利用酵母双杂交系统从人心肌cDNA文库中筛选与热激蛋白70(HSP70)相互作用的蛋白质。方法:从人心脏cDNA文库扩增Hsp70基因,克隆于pGBKT7载体上,酶切鉴定及序列分析,并检测pGBKT7-Hsp70酵母细胞AH109中的自激活活性;将构建的酵母表达诱饵质粒载体pGBKT7-Hsp70转化AH109酵母细胞,与转化有人心脏cDNA文库的酵母Yl87进行交配实验,筛选与HSP70相互作用的蛋白质,通过一对一的回复杂交实验排除假阳性,对阳性克隆进行序列测定和生物信息学分析。结果:构建了"诱饵"质粒栽体pGBKT7-Hsp70,并证明其在酵母双杂交系统中无自激活活性,筛选得到多个与Hsp70相互作用的阳性转化子,并最终得到HSP70的1个相互作用蛋白质HIP。结论:应用酵母双杂交系统筛选出与HSP70相互作用的1个蛋白质,它们的相互作用可能与HSP70发挥细胞分子伴侣作用有关。     

HCV截短型E2蛋白在酵母双杂交系统中的表达及自激活作用检测

目的：获得不包含C末端跨膜区的HCV包膜糖蛋白E2蛋白（E2 661）编码基因,构建酵母双杂交诱饵载体,并检测对报告基因的激活作用。方法：PCR扩增HCV E2661 cDNA片段,先克隆入pMD-18T载体中,经测序正确后,再亚克隆入诱饵载体 pGBKT7,将重组质粒pGBKT7-E2661用醋酸锂法转化入酵母菌AH109,检测目的蛋白在酵母细胞中的表达以及对报告基因有无激活作用。结果：成功构建含有HCVE2661基因片段的酵母双杂交诱饵载体,目的片段可在酵母细胞AH109中正确表达,对酵母菌无毒性且对报告基因无自主激活作用。结论：可利用所构建的pGBKT7-E2661作为酵母双杂交系统中的“诱饵”,进行相互作用分子的筛选研究。     

HeLa细胞cDNA文库及酵母双杂交诱饵载体pGBKT7-CPn0308的构建

旨在利用酵母双杂交系统构建HeLa细胞的cDNA文库,并构建酵母双杂交诱饵载体pGBKT7-CPn0308。从HeLa细胞中提取总RNA,应用SMARTTM技术,构建以pGADT7-Rec为载体的HeLa细胞酵母GAL4 AD融合cDNA文库。应用PCR技术扩增目的片段CPn0308,并成功克隆该基因到诱饵载体pGBKT7中,将重组质粒转化酵母菌株AH109后,检测诱饵载体有无自激活和细胞毒性作用。结果显示,文库展现良好的多态性,重组诱饵载体pGBKT7-CPn0308不具有毒性且未自主激活报告基因,说明该文库和诱饵质粒可用于酵母双杂交系统。     

应用酵母双杂交系统筛选新基因Collectrin相关蛋白

Collectrin是在小鼠 5 6肾切除后 ,在肾小球的高滤过、高增生期分离克隆的一个新基因 .通过酵母双杂交系统从人肾脏cDNA文库中筛选与collectrin相互作用的蛋白 ,可以为该基因的功能研究提供线索 .构建collectrin的真核表达载体collectrin pGBKT7 c myc ,转化酵母菌AH10 9.Western印迹证实 ,collectrin蛋白能够在酵母中正常表达 ,对酵母细胞无毒性 ,不存在自激活现象 .将AH10 9 collectrin pGBKT7 c myc与转化了成人肾脏cDNA文库的酵母菌Y187接合 ,共筛选到 5个与细胞代谢有关的蛋白 ,包括鞘磷脂激活蛋白、精氨琥珀酸合成酶、氨基酸转运蛋白XAT2、NADH脱氢酶 1和金属硫蛋白 2A .由此推论 ,collectrin可能通过与细胞内某些酶类相互作用而影响细胞代谢 ,为新基因collectrin的功能研究提供了重要线索 .     

酵母双杂交技术筛选并回转验证在胞内与PML-C结构域相互作用的蛋白

目的 利用酵母双杂交技术在活细胞内筛选并回转验证与PML-C结构域相互作用的蛋白质.方法 通过诱饵质粒pGBKT7-PML-C,利用酵母双杂交系统从白血病细胞cDNA文库中筛选与PML-C结构域相互作用的蛋白质.结果 利用酵母双杂交技术筛选到43个能与PML-C结构域相互作用的克隆;经进一步的归类与酵母回转试验得到9个阳性克隆.结论 在细胞内PML-C结构域能与多种蛋白质有相互作用.中性粒细胞弹性蛋白酶（neutrophil elastase,NE）介导的急性早幼粒细胞白血病的发生可能与这些相互作用所致的生物学功能改变有关.     

酵母双杂交技术筛选与hCLP46蛋白相互作用的蛋白

目的：利用酵母双杂交技术,筛选人类白细胞cDNA文库中能与人类CD34＋干/祖细胞异常表达蛋白hCLP46（Human CAP10-Like Protein46）相互作用的未知蛋白。通过对其相互作用蛋白的筛选和研究,深入探讨hCLP46的功能,为骨髓增生异常综合症MDS-AML的病理提供线索。方法：以pGBKT7-hCLP46为诱饵质粒筛选人类白细胞cDNA 文库,得到阳性克隆,并对验证后的阳性克隆的外源性片段进行测序及同源性分析。结果：从人类白细胞cDNA文库中得到86个阳性克隆,经过验证,最终得到5个阳性克隆。对验证后的阳性克隆的外源片断进行测序及同源性分析,最终得到4个不同的候选基因序列。结论：应用酵母双杂交系统,共筛选得到4个不同的基因,其编码蛋白与hCLP46 有相互作用,可能与MDS-AML发病机制相关。     

PML-C与GINS2蛋白相互作用的胞内验证

目的 通过胞内实验验证PML-C与GINS2蛋白之间的相互作用.方法 将诱饵蛋白质粒pGBKT7-PML-C和文库蛋白质粒pACT2-GINS2共转化AH109酵母菌,通过一对一的酵母双杂交技术验证两者在活细胞内的相互作用;构建pCMV-HA-PML-C及pCMV-Myc-GINS2真核表达载体并共转染人胚肾293细胞,利用免疫共沉淀技术验证二者之间的相互作用.结果 pGBKT7-PML-C诱饵蛋白质粒和pACT2-GINS2靶蛋白质粒共转化AH109酵母菌后,可见蓝色阳性克隆生长;pCMV-HA-PML-C及pCMV-Myc-GINS2真核表达载体构建成功,共转染293细胞,抗HA多克隆抗体沉淀与HA-PML-C相互作用的蛋白复合物后,用抗Myc单克隆抗体进行Western印迹检测,可以检测到Myc-GINS2蛋白.结论 利用酵母双杂交和免疫共沉淀技术在胞内验证了PML-C与GINS2间存在相互作用.     

转录因子X-box结合蛋白1相互作用蛋白的筛选和鉴定

X-box 结合蛋白 1 是一种重要的转录因子,参与体内多项信号转导过程. 为进一步研究 XBP1 的生物学功能,运用酵母双杂交技术在肝细胞文库中筛选 XBP1 的结合蛋白. 首先运用 PCR 技术扩增获得 XBP1 的编码序列,克隆至 pGEM-T 载体,经测序鉴定后,亚克隆至诱饵载体 pGBKT7 中,转化酵母 AH109(a type). 免疫印迹检测诱饵质粒 pGBKT7-XBP1 在AH109 酵母中的表达之后,含有诱饵质粒的酵母 AH109 与含有肝细胞 cDNA 文库质粒 pACT2 的酵母 Y187(αtype)配合,配合后的二倍体酵母生长在含有 X-α-gal 的营养缺陷型培养基上 (SD/-Trp-Leu-His-Ade) 进行选择和筛选,经测序和序列比对确定阳性克隆的开放读码框 ORF,得到 7 种不同的蛋白质. 为了进一步验证这些筛选蛋白质与 XBP1 的相互作用,克隆其中一种蛋白质 MT1E,并运用 GST pulldown 和免疫共沉淀技术成功检测了 MT1E 和 XBP1 的相互作用(体外 / 体内),结果提示,MT1E 可能是 XBP1 的一个新的调节蛋白. 通过酵母双杂交技术筛选得到的 7 种蛋白质分别与肝细胞基础代谢、蛋白质的合成与运输、细胞的增殖与凋亡密切相关. 上述结果有助于揭示 XBP1 的生物学功能,为进一步探讨 XBP1 的表达和调控机制提供新线索.     

酵母双杂交筛选与蛋白激酶CK2α′相互作用蛋白——泛素-52氨基酸融合蛋白的鉴定

蛋白激酶CK2是一种真核细胞中普遍存在的信使非依赖性丝/苏氨酸蛋白激酶. 为研究CK2α′亚基在精子发生中的作用机制,将构建于pACT2质粒的人睾丸cDNA文库和人蛋白激酶CK2α′为诱饵蛋白进行酵母双杂交实验. 以初步筛选与人蛋白激酶CK2α′相互作用蛋白的阳性候选克隆,筛选获得8个阳性克隆,其中1个与人泛素-52氨基酸融合蛋白基因（UBA52）的cDNA序列有高度同源性（100％）. GST pull-down实验在细胞外进一步证实了CK2α′与UBA52之间存在相互作用. 本实验证明,人泛素-52氨基酸（UBA52）融合蛋白是人CK2α′亚基的相互作用蛋白, 它们之间的相互作用对精子发生机制的影响尚不清楚,进一步分子机制研究正在进行中.     

酵母双杂交筛选与甲状旁腺素1型受体相互作用的蛋白

目的:采用Clontech公司第3套酵母双杂交系统,筛选与甲状旁腺素1型受体(PTH1R)相互作用的蛋白。方法:将全长PTH1R基因克隆到载体pGBKT7作为诱饵,用LiAc介导将诱饵蛋白质粒pGBKT7-PTH1R和人肾cDNA文库质粒转化到酵母菌AH109中,检测Mel1报告基因的表达,并进行相互作用的验证。结果:测序和相互作用验证结果表明SNAPIN在酵母系统中能特异地与PTH1R相互作用;根据对SNAPIN基因的功能分析,其可能与细胞内钙稳态的调控有关。结论:为进一步研究PTH1R促进骨肉瘤进展的机制提供了一定的线索。     

NLS-RARα蛋白相互作用蛋白的筛选与验证

急性早幼粒细胞白血病(APL)具有特征性染色体易位,产生的PML-RARα融合基因在其发生发展中有重要作用．PML-RARα融合蛋白在细胞内被中性粒细胞弹性蛋白酶(neutrophil elastase,NE)切割为PML突变蛋白(核定位信号NLS缺失)和RARα突变体 (NLS-RARα,包含有PML的核定位信号),这两段蛋白质在APL的发生中可能具有重要作用．为进一步研究NLS-RARα的生物学功能,运用酵母双杂交技术在白血病cDNA文库中筛选与其作用的蛋白质．首先PCR技术扩增NLS-RARα编码序列,克隆至诱饵载体pGBKT7,测序鉴定后将其转化酵母AH109．免疫印迹检测到诱饵蛋白表达后,将含有诱饵载体的AH109与含有白血病cDNA文库的酵母Y187交配,在含有X-α-gal的营养缺陷性培养基上选择和筛选二倍体酵母．经回转实验和测序分析验证得到8个与NLS-RARα相互作用的蛋白质．为进一步验证这些相互作用,克隆其中的JTV-1蛋白,利用间接免疫荧光,GST pull-down和免疫共沉淀技术成功验证了它与NLS-RARα的相互作用．为进一步探讨APL的发生机制提供了新的线索．     

Prelamin A相互作用蛋白Narf的鉴定和表达分析

目的:探讨A型核纤层蛋白前体( prelamin A)在细胞内堆积造成细胞早老的机理,筛选了prelamin A相互作用蛋白并研究其在早老细胞中的表达情况.方法:以prelamin A的C末端区域为诱饵蛋白,采用酵母双杂交方法从人骨骼肌cDNA文库中筛选prelamin A相互作用蛋白.构建了prelaminA识别因子(Narf)与绿色荧光蛋白融合表达载体pEGFP - Narf,与红色荧光蛋白- prelamin A融合表达质粒pDsRed - PLA共转染HEK293细胞,激光共聚焦显微观察共定位情况.Western blotting检测Narf在衰老表型HEK293PLA细胞的表达情况.结果:筛选得到包括Narf在内的7个候选相互作用蛋白.Narf与prelamin A能相互作用并共定位于核纤层,在prelamin A过表达的HEK293PLA细胞中Narf表达没有升高.结论:Narf在细胞内与prelamin A相互作用,且表达量不受后者影响.     

香蕉红素氧还蛋白基因在酵母双杂交系统中的自激活检测

利用PCR方法扩增香蕉红素氧还蛋白基因的保守结构域序列CdRD和开放性阅读框序列FRD,并在其上下游分别引入NdeⅠ和SalⅠ酶切位点,双酶切后与同样经NdeⅠ和SalⅠ双酶切的诱饵质粒载体pGBKT7连接,构建重组诱饵质粒pGBKT7-CdRD和pGBKT7-FRD,并将此两重组诱饵质粒转入酵母菌株AH109中进行营养缺陷型分析检测毒性及自激活。结果表明,成功构建了重组诱饵质粒pGBKT7-CdRD和pGBKT7-FRD,并且其无自激活报告基因作用,对酵母菌株也无毒性作用。这说明此两个重组诱饵质粒可用于酵母双杂交系统,为从香蕉叶片cDNA文库中筛选获得与香蕉红素氧还蛋白基因的保守结构域序列CdRD和开放性阅读框序列FRD相互作用的受体蛋白基因奠定了基础。