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新型水蛭素嵌合抗栓剂的构建表达与功能研究 总被引:1,自引:0,他引:1
水蛭素(Hirudin,HV)作为新一代抗凝剂,它是目前已知最强的天然凝血酶抑制剂,并有望在临床上完全取代肝素。虽然水蛭素有许多优点,但出血倾向是其在临床应用上的主要副作用。目前尚没有好的解决办法。针对水蛭素在临床应用中所出现的这个问题,依据血栓形成的生理生化机制,构建出了含FXa识别序列水蛭素嵌合抗栓剂,来降低水蛭素在非血栓部位的活性从而减小出血的危险。小鼠尾部血栓模型实验表明:此新型嵌合抗栓剂能在不减少水蛭素抗凝血活性的同时,又能大幅度地降低出血副作用。具有非常重要的临床意义。 相似文献
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啤酒酵母生产的重组水蛭素的纯化及脱色 总被引:5,自引:0,他引:5
对啤酒酵母生产的重组水蛭素变异体1(rHV1)进行多步骤的纯化。首先将分泌到培养上清液中的水蛭素进行硫酸铵沉淀和SephadexG-50凝胶过滤,再用Q-SepharoseHP阴离子交换层析分离,最后用HPLCSP-5PW阳离子交换柱脱色及HPLCC8柱反相层析。真空干燥后得到的水蛭素蛋白经SPS-PAGE、N端氨基酸序列分析、抗凝血酶活力分析鉴定,证明已获得高纯度的重组水蛭素HV1制剂,为利用基因工程方法生产重组水蛭素的规模化生产及临床应用提供了依据 相似文献
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水蛭素的分子生物学研究 总被引:12,自引:0,他引:12
本文从分子生物学的角度简述了蛋白酶抑制剂水蛭素的生物学和临床医学作用,结构特点,结构与功能关系,水蛭素与凝血酶之间的作用方式,以及水蛭素基因的克隆与表达。同时还指出了水蛭素基因的复杂性。水蛭素基因结构的阐明,基因的表达调控,将成为今后研究的重要方向之一。 相似文献
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水蛭素在噬菌体表面的展示 总被引:9,自引:0,他引:9
水蛭素是凝血酶强有力的天然抑制剂。通过改造噬菌质粒并构建水蛭素表达载体pCANTAB 5G8Hir,使水蛭素基因通过接头与噬菌体M13的gp3(197~406)基因片段融合。表达产物在gp8信号肽的引导下到达大肠杆菌周质,在辅助噬菌体M13KO7的帮助下组装到丝状噬菌体外壳上。展示在噬菌体表面的水蛭素仍然具有与凝血酶结合并抑制酶活性的作用,说明展示的水蛭素保持了正确的空间构象和生物学活性。水蛭素在噬菌体表面的功成展示为进一步开展其实验定向进化以及结构与功能关系的研究打下基础。 相似文献
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采用一种新的PCR定点诱变技术成功地对野生型水蛭素Ⅲ进行了定点诱变,这种方法快速、简便,有效。通过突变,将野生型水蛭素Ⅲ分子的活性功能非必需区的指状结构顶端第33~36位的氨基酸残基替换为RGDS序列,并进行了高效分泌表达,表达产物分泌到细胞外发酵液中。改构的水蛭素突变体与野生型水蛭素Ⅲ相比,两者的抗凝血酶活性基本一致,但体外抗血小板凝集试验结果表明,前者除原有的抗凝活性外还具有显著的抗ADP诱导的血小板凝集活性,该研究为水蛭素Ⅲ分子的结构功能关系研究以及新型抗凝药物的研制打下了基础。 相似文献
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美国Biogen公司在美国开始抗血栓蛋白水蛭素的临床试验.水蛭素是吸血希耳制造出来的血液凝固抑制肽.该公司以水蛭素的作用部分为基础设计的新肽“Hirulog”有水蛭素的约2倍的血液凝固作用.已结束第一阶段的临床试验,没有发现出血过多和引起过敏等严重副作用,最近将对抑制血栓形成的抗凝血酶药着手第二阶段临床试验. 相似文献
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本文报导了化学合成的水蛭素基因在酵母细胞中得到表达,井能分泌水蛭素到胞外。将该菌株培养物的上清液经硫酸铵沉淀和Sephadex G-50过滤后,用DEAE-SephadexA-25进行阴离子交换层析,进而用HPLC反相层析,得到表达产物重组水蛭素。经SDS-PAGE,氨基酸序列分析,抗凝血酶活力分析及血浆滴定实验等方法鉴定,证明该基因表达产物与天然水蛭素HV_2相同。 相似文献
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目的:采用反相高效液相色谱法(RP-HPLC)对聚乙二醇(PEG)修饰的水蛭素进行分析分离,用以分析修饰产物中不同修饰度水蛭素的组成和比例。方法:色谱柱为Hypersil C18,5μm,4.6mm×150mm;流动相A为H2O+0.01%的三氟乙酸,流动相B为乙腈+0.01%的三氟乙酸。40min内由10%-50%流动相B进行梯度洗脱,洗脱流速1mL/min,上样量50μL,检测波长为214nm。结果:在单甲基化PEG-丙酸琥珀酰亚胺和水蛭素摩尔比不同的的反应产物中,PEG1-水蛭素、PEG2-水蛭素均可以达到基线分离,且不同批次的反应产物进行RP-HPLC的重复性良好。结论:RP-HPLC可以有效地对PEG修饰的水蛭素产物进行分析分离,为PEG化水蛭素的长效、缓释剂型的开发提供技术支持。 相似文献
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水蛭素抑制人脐静脉内皮细胞基质金属蛋白酶-2的生成及活化 总被引:4,自引:0,他引:4
研究凝血酶对人脐静脉内皮细胞表达基质金属蛋白酶的影响及重组水蛭素的作用。将原代培养人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的第2~5代分组后与凝血酶(4.0ku/L)共同温育,同时分别加入水蛭素(6.0ku/L)和肝素(6.0ku/L),在不同时间,用逆转录聚合酶链反应和免疫组织化学分析的方法评价基质金属蛋白酶-2的表达情况。结果显示凝血酶促进血管内皮细胞产生和活化基质金属蛋白酶-2。重组水蛭素可以有效地阻断凝血酶的上述作用。 相似文献
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重组水蛭素的突变及突变体部分性质研究 总被引:4,自引:0,他引:4
以基因突变结合动力学分析的方法研究了水蛭素空间结构及其与凝血酶的相互作用.采用基因定点突变和随机突变的方法得到两个重组水蛭素突变体,并从抗酰胺水解活性,抗凝血酶活力和稳定性三个方面,比较研究了重组水蛭素rHV2中47位和11位两个氨基酸残基对其稳定性和抑制能力的影响.将rHV2中Gln11和Asn47分别突变为His11和Lys47后,rHV2-H11生物活力降低30%,rHV2-K47生物活力提高61%.测定抑制常数Ki表明,rHV2-H11突变体Ki值升高14倍,rHV2-K47突变体Ki值降低14倍,两个突变体的热稳定性均有所增强,rHV2-H11在酸性和碱性条件的稳定性降低.分析实验结果,可以认为:①47位的Lys可能是通过氢键和静电两种作用力同时影响着水蛭素的三维结构和其与凝血酶的结合.②11位氨基酸可能是水蛭素分子中另一个重要位点. 相似文献
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重组葡激酶和水蛭素融合蛋白的血栓靶向性机制 总被引:1,自引:0,他引:1
为解释以凝血因子Xa(FXa)的识别序列为连接肽的葡激酶和水蛭素的融合蛋白(命名为SFH)在体内的强溶栓和低出血的特征,研究分析了SFH的两个血栓靶向性作用机理.首先采用ELISA和免疫组化的方法在体外分析了由水蛭素游离的C末端赋予的SFH对血栓的靶向性,结果显示SFH对凝血酶和富含凝血酶的血栓具有更高的亲和力.为阐明SFH抗凝活性在血栓部位的靶向性释放,构建表达了仅在水蛭素N末端连接FXa识别序列的水蛭素衍生物(命名为FH).体外试验结果表明完整的FH无抗凝活性,在体内FH可以发挥抗栓作用,且出血副作用较低,这些结果说明FXa的识别序列可以封闭水蛭素的抗凝活性,在体内FH可以由于FXa的成功裂解而释放其抗凝活性,且其抗凝活性可能仅局限于血栓局部.这就间接说明了SFH的抗凝活性可以在血栓局部进行靶向性释放.以上两个血栓靶向性作用机理是SFH在体内发挥更高溶栓效率和降低出血副作用的重要机制. 相似文献
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目的:研究重组水蛭素抗血栓形成的作用及机制。方法:将60只雄性昆明小鼠随机分为对照组、模型组、阿司匹林组和重组水蛭素低、中、高剂量组(n=10)。除对照组外,其余各组小鼠分别腹腔注射角叉菜胶2.5 mg/kg,诱发小鼠尾部血栓形成。注射角叉菜胶前24 h、0.5 h和注射后24 h,阿司匹林组小鼠分别腹腔注射阿司匹林25 mg/kg,重组水蛭素低、中、高剂量组小鼠分别腹腔注射0.05、0.1、0.2 mg/kg重组水蛭素,对照组和模型组小鼠分别腹腔注射等体积生理盐水。注射角叉菜胶后48 h,观察小鼠黑尾长度并计算黑尾发生率;检测血浆凝血酶原时间(PT)、活化部分凝血活酶时间(APTT)、组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)、纤溶酶原激活物抑制因子-1(PAI-1)、6-酮-前列腺素F1α(6-keto-PGF1α)、血栓恶烷B2(TXB2)水平。结果:与对照组比较,模型组小鼠尾部形成血栓;血浆PT明显缩短(P<0.01),PAI-1、TXB2水平明显升高(P<0.01),t-PA、6-keto-PGF1α水平明显降低(P<0.01)。与模型组比较,重组水蛭素低、中、高剂量组和阿司匹林组小鼠尾部血栓长度明显缩短(P<0.05或P<0.01),PT明显延长(P<0.01),PAI-1、TXB2水平明显降低(P<0.01),t-PA、6-keto-PGF1α水平明显升高(P<0.01)。与阿司匹林组比较,重组水蛭素低剂量组小鼠尾部血栓长度明显增加(P<0.05),PT明显缩短(P<0.01),PAI-1、TXB2水平明显升高(P<0.01);重组水蛭素低、中剂量组6-keto-PGF1α水平明显降低(P<0.01,P<0.05);重组水蛭素中剂量组PAI-1、TXB2水平明显升高(P<0.01,P<0.05)。结论:重组水蛭素有明显抗血栓形成作用,其机制可能与影响外源性凝血系统、促进纤溶功能有关。 相似文献
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开发中的抗栓剂——水蛭素及其12肽 总被引:1,自引:0,他引:1
血栓病是严重危害人类生命与健康的疾病,多年来人们一直在致力于寻找和研制治疗血栓病的有效药物。至今,已有尿激酶、链激酶,组织型纤溶酶原激活剂以及尿激酶原等溶栓药物。与此同时人们也一直在寻找效果更好的抗栓药物。水蛭素就是一种正在开发的抗栓药物。早在1884年就发现了水蛭素,但直到 相似文献
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《中国生物工程杂志》2008,28(2):0-10
重组水蛭素;新型可吸收止血材料及创伤急救绷带;乙肝治疗性核酸疫苗;国家一类抗癌新药UTD1;兰馨亚洲投资集团寻求投资项目;西安新药评价研究中心项目; 相似文献