雷帕霉素对小鼠原代肝细胞脂滴形态和脂滴表面蛋白表达的影响

目的:探讨雷帕霉素(Rapamycin)对小鼠原代肝细胞脂滴形态和脂滴表面蛋白表达的影响。方法:采用胶原酶灌注方法分离和培养小鼠原代肝细胞,采用100μM油酸诱导肝细胞内脂肪的合成。采用0、10、20、50μM的雷帕霉素处理肝细胞12 hr后,利用中性脂肪染料Bodipy493/503对肝细胞内的脂滴进行染色,荧光显微镜下观察细胞脂滴形态和数量。定量试剂盒检测细胞内甘油三酯(TG)的含量利用Western blot检测不同浓度雷帕霉素处理的小鼠原代肝细胞脂滴表面蛋白ADRP的表达水平。结果:成功分离和培养了小鼠原代肝细胞,使用油酸处理能够明显增加原代肝细胞内脂滴的数量。随着体外雷帕霉素处理浓度的增加,荧光显微镜下观察发现原代肝细胞内脂滴的数量呈现明显的下降趋势,甘油三酯的含量也呈见明确的下降趋势,在20μM浓度下就表现出显著性差异。Western blot结果显示雷帕霉素能够在抑制肝细胞内脂肪储积的同时降低脂滴表面蛋白ADRP的表达水平,并且随着雷帕霉素处理浓度的增加,其对ADRP表达的抑制越明显。结论:雷帕霉素能够抑制肝细胞内中性脂肪的储积,同时降低脂滴表面蛋白ADRP的表达水平。也间接说明了mTOR信号通路能够影响肝细胞内脂肪的储积,也为脂肪肝的防治提供了一个新的实验基础。     

肝脏缺血预处理对肝细胞分离、冻存效果的影响

大量研究表明,对肝脏进行缺血预处理（ischemic preconditioning,IPC）对肝脏保护有重要意义,IPC能够提高肝脏对缺血再灌注损伤的耐受能力.但IPC对分离后的肝细胞是否具有同样的保护作用,目前尚无报道.本研究旨在明确在对大鼠肝细胞分离以前对大鼠肝脏进行缺血预处理是否可以提高肝细胞分离和冻存的效果.在本研究中,30只SD大鼠,随机分为3组（G1,G2,G3）,在对大鼠肝脏进行分离以前,对G2和G3组大鼠分别进行5和10min的缺血预处理,10min后再进行肝细胞分离,G1组大鼠则不进行特殊处理.分离后,比较各组肝细胞产量及存活率.将所得的肝细胞分别冻存14,28天后进行肝细胞的复苏,对各组肝细胞的存活率、细胞活性（四唑盐比色实验）、冻存液LDH漏出浓度3项指标进行对比分析.研究发现,缺血预处理组的大鼠肝细胞（G2,G3）在肝细胞的活率、MTT实验、冻存液的LDH浓度测定等方面均优于对照组.由此可见,在肝细胞分离之前,对肝脏实施缺血预处理能够明显提高所分离肝细胞的存活率,还可以提高肝细胞短期内的冻存效果.但相对大鼠肝脏进行缺血预处理的时间,5和10min并没有明显的统计学差异.     

胰岛素对小鼠原代肝细胞甘油三酯合成分解代谢的影响

目的：建立小鼠肝细胞体外培养的方法,研究不同浓度胰岛素对肝细胞甘油三酯合成代谢、分解代谢及甘油三酯含量的影响。方法：通过肝脏灌注和胶原酶消化分离小鼠肝细胞,密度梯度离心纯化后,进行体外培养。在0 nmol/L,50 nmol/L,100 nmol/L,200 nmol/L胰岛素存在的情况下培养,通过3H标记的甘油测定细胞内甘油三酯合成速率,使用3H标记的油酸预孵育,加入triacsin C抑制脂肪酸重酯化,追踪掺入3H的甘油三酯分解的速率。采用甘油三酯检测试剂盒,测定不同浓度胰岛素对细胞内甘油三酯含量的影响。结果：成功分离了小鼠原代肝细胞,存活率达90%。50 nmol/L胰岛素对细胞甘油三酯含量及甘油三酯合成分解速率影响较小。100 nmol/L胰岛素可显著增加甘油三酯合成速率,减低分解速率,使细胞内甘油三酯含量增加。200 nmo/L胰岛素反而降低甘油三酯合成速率,细胞内甘油三酯含量少于对照组（0 nmol/L）。结论：本研究成功建立了小鼠原代肝细胞分离培养的方法,使用3H标记物敏感的检测肝细胞内甘油三酯合成分解速率。研究发现,过高浓度的胰岛素反而抑制肝细胞甘油三酯的储积。     

建立同时分离培养小鼠肝细胞及肝星状细胞的技术

目的:建立一种简便、经济、高产的同步分离培养肝细胞以及肝星状细胞的方法。方法:在参照国内外方法的基础上加以改良,首先采用肝脏原位胶原酶灌注消化的方法,获得总细胞悬液,经多次低速离心分离肝细胞;再用Nycodenz作为分离介质,通过密度梯度离心法从非实质细胞中得到肝星状细胞。通过台盼蓝染色方法鉴定细胞的活力,用倒置相差显微镜、立体显微镜、CK-18、白蛋白免疫荧光细胞化学染色对培养的肝细胞形态以及功能进行检测。使用Desmin、α-SMA免疫荧光细胞化学对肝星状细胞进行鉴定。结果:成功的在体外同步分离、培养肝细胞及肝星状细胞,肝细胞产率为5-6×107/只小鼠,两只小鼠肝星状细胞产率达1×106个。细胞存活率及纯度均可达90%。肝细胞在培养24h后呈不规则铺路石样形态,此为典型的肝细胞形态,其标志分子CK-18以及白蛋白免疫荧光染色阳性。倒置相差显微镜下可见贴壁后的肝星状细胞呈典型的星形细胞形态,且其标志分子Desmin、α-SMA免疫荧光染色阳性。结论:改良的原位灌注以及分离方法可以同时分离并且培养具有高活性和功能的肝细胞和肝星状细胞。     

小鼠胎肝细胞透明质酸3D培养体系的建立

为了利用透明质酸建立小鼠胎肝细胞3D培养体系,分离获得胚胎12~14d胎肝细胞,利用KM培养基进行初步2D肝干/祖细胞的筛选培养,并利用透明质酸及KM培养基配制水凝胶建立3D细胞培养体系.胎肝细胞在2D体系中呈现克隆状生长.分离培养获得的肝干/祖细胞,克隆在透明质酸建立的3D培养体系保持增殖活性,并进一步获得肝细胞功能特性,表现为3D培养上清中白蛋白合成和尿素水平显著增加.定量PCR结果显示,随着3D培养时间的延长,其肝细胞干性标志如AFP、CK19、Ep CAM、Prox1等表达水平都大幅度降低且接近成年小鼠肝脏表达水平.本研究成功建立基于透明质酸的小鼠胎肝细胞的3D无血清培养体系,并可促进小鼠胎肝细胞的肝细胞功能进一步成熟.     

小鼠胎肝细胞透明质酸3D培养体系的建立

目的 利用透明质酸建立小鼠胎肝细胞3D培养体系。 方法 分离获得胚胎12-14天胎肝细胞,利用KM培养基进行初步2D肝干/祖细胞的筛选培养,并利用透明质酸及KM培养基配制水凝胶建立3D细胞培养体系。 结果 胎肝细胞在2D体系中呈现克隆状生长。分离培养获得的肝干/祖细胞克隆在透明质酸建立的3D培养体系保持增殖活性,并进一步获得肝细胞功能特性,表现为3D培养上清中白蛋白合成和尿素水平显著增加。Q-PCR结果显示随着3D培养时间的延长,其肝细胞干性标志如AFP、CK19、EpCAM、Prox1等表达水平都大幅度降低且接近成年小鼠肝脏表达水平。 结论 本研究成功建立基于透明质酸的小鼠胎肝细胞的3D无血清培养体系,并可促进小鼠胎肝细胞肝细胞功能进一步成熟。     

一种同时分离培养大鼠肝细胞及肝枯否细胞技术的建立

目的:建立简便、经济的同步分离培养肝细胞及kupffer细胞的方法.方法:采用肝脏原位灌洗结合离体胶原酶灌注消化的方法获得总细胞悬液,差速离心分离肝细胞及肝非实质细胞,经多次低速离心可分离肝细胞,经percoll密度梯度离心以及选择性贴壁法得到纯化的kupffer细胞.台盼蓝染色鉴定细胞活力.使用倒置相差显微镜、HE染色、PAS染色及白蛋白免疫组织化学染色对培养肝细胞的形态及功能进行检测.使用光学显微镜、荧光显微镜及CD68免疫荧光染色鉴定分离的kupffer细胞.结果:体外成功的同步分离培养了肝细胞及kupffer细胞,肝细胞产率为1.37± 0.53× 108/大鼠,kupffer得率为3.45± 0.41×106/g肝脏.细胞存活率及纯度都可达90％.肝细胞培养24h后呈典型肝细胞形态,7天后仍具有糖原合成和白蛋白合成能力.贴壁后的kupffer细胞呈典型的星型或三角形,且其标志分子CD68免疫荧光染色阳性.结论:应用改良的原位灌注方法可以很好的同时分离具有活性及功能的肝细胞和kupffer细胞.     

在原代培养的大鼠肝细胞观察消炎痛的细胞保护作用

我们曾观察到消炎痛预处理能明显减轻四氯化碳和半乳糖胺对大鼠的肝损伤作用,本工作采用原代培养的大鼠肝细胞进一步观察了这一现象。结果表明,经消炎痛整体处理后分离的大鼠肝细胞,在原代培养的条件下,对四氯化碳的损伤仍然具有明显的抵抗作用,表现为细胞内酶的漏出少于对照组。正常大鼠离体肝细胞在原代培养条件下用消炎痛处理,在相当大的剂量和相当长的时间范围内未出现明显的抗损伤作用。结果提示:消炎痛整体处理可使肝细胞本身获得抗损伤的能力,而这种抗损伤能力的产生可能有赖于肝细胞外其它因素的参与。     

大鼠肝癌细胞膜相关胚胎抗原的研究

用非标记免疫酶技术观察比较了33例大鼠移植性肝癌BERH-2,1例二乙基亚硝胺诱发原发性大鼠肝癌和18例不同胎龄的胚胎鼠肝组织。证明在癌细胞的表面膜上存在着一种胚胎性抗原。这种胚胎抗原在13—14天胚胎肝细胞表面反应强烈,随着胚胎发育而减弱,在大多数正常成年大鼠肝细胞中则呈阴性或弱阳性。二乙基亚硝胺诱发大鼠肝脏癌变后,这种胚胎抗原在癌细胞表面膜上又呈强阳性反应。     

华中五味子降转氨酶成分的研究

从华中五味子中分离得6种结晶成分,并确定了它们的化学结构。其中酯甲、乙、丙及丁经药理和临床试验证明有降低血清GPT作用,去氧五味子素及酯戊无效。用电子显微镜观察酯甲对小鼠四氯化碳中毒后肝细胞亚微结构的影响,认为肝细胞的损伤受到保护,酯甲对肝细胞无直接损害作用。氚标记醇甲口服后很快吸收,在肝内从脂溶性迅速转化为水溶性代谢物,主要经肾排泄。提纯大鼠肝GPT酶蛋白,免疫家兔后,用抗原抗体反应证明酯甲的降酶机理可能与抑制肝内GPT活力有关。     

分离小鼠肝细胞的一种简易灌流法

我们设计了一种分离小鼠肝细胞的简易灌流法。它具有操作简便,不需特殊装置,胶原酶耗费少等优点。在总活细胞产量及每100g体重活细胞产量等方面显著高于振荡法(P<0.001),而接近Seglen灌流法。此外,对经本法分离的肝细胞及肝非实质细胞进行培养,获得了良好效果。     

γ射线对红细胞嘌呤核苷磷酸化酶的影响 二、酶的某些性质

正常大鼠和小鼠、经700或1000拉德照射的大鼠和小鼠,纯化它们的红细胞嘌岭核苷磷酸化酶,并研究酶的某些性质。主要结果如下: 1.在纯化过程中,从DEAE-纤维素柱梯度洗脱大鼠酶时,收集管中酶活力高峰相当Tris-醋酸盐缓冲液浓度0.107±0.003M,而在同样实验条件下,洗脱小鼠酶时酶活力高峰却相当0.213±0.010M。2.大鼠酶反应的Q_(10)小于小鼠酶,但是其米氏常数高于后者。整体照射可使大鼠酶反应的Q_(10)与米氏常数增加,但对于小鼠酶反应的Q_(10)与米氏常数没有影响。3.对氯汞苯甲酸或二氯化汞可抑制红细胞嘌呤核苷磷酸化酶活力,但辐射对酶活力的抑制曲线无显著影响。4.大鼠酶与小鼠酶在聚丙烯酰胺凝胶电泳中相对迁移率是不同的,因而它们的电泳图谱也有差异。整体照射对大鼠酶与小鼠酶在电泳中的相对迁移率无显著影响。5.将大鼠酶与小鼠酶的相对迁移率对数与凝胶浓度作图,可得到两条平行的直线。这表明两种酶的分子量相同,而其净电荷却有明显的差异。以上结果说明,大鼠与小鼠的红细胞嘌呤核苷磷酸化酶不是性质相同的酶。电离辐射可使大鼠酶反应的Q_(10)与表观米氏常数增加,而对小鼠酶却无影响。前者反映酶的结构发生了变化,而后者的结构没有改变。     

海南文昌清澜港红树林真菌抗B16肿瘤细胞活性菌株的筛选

从海南文昌清澜港红树林采集78份植物组织和土壤样品。对样品进行真菌分离, 共分离得到真菌608株, 采用目测法对其体外抗肿瘤细胞活性进行检测, 发现81株红树林真菌对小鼠黑色素瘤B16细胞有不同程度的抑制作用, 占总分离菌株的13.32%。结果表明, 从红树植物杯萼海桑中分离得到真菌菌株的数量最多, 而从红树植物银叶树分离得到的抗肿瘤细胞活性菌株数量最多。     

海南文昌清澜港红树林真菌抗B16肿瘤细胞活性菌株的筛选

从海南文昌清澜港红树林采集78份植物组织和土壤样品。对样品进行真菌分离, 共分离得到真菌608株, 采用目测法对其体外抗肿瘤细胞活性进行检测, 发现81株红树林真菌对小鼠黑色素瘤B16细胞有不同程度的抑制作用, 占总分离菌株的13.32%。结果表明, 从红树植物杯萼海桑中分离得到真菌菌株的数量最多, 而从红树植物银叶树分离得到的抗肿瘤细胞活性菌株数量最多。     

褪黑素对自身免疫性肝炎大鼠肝星状细胞增殖及凋亡的影响

目的研究褪黑素（MT）对自身免疫性肝炎大鼠肝星状细胞（HSC）增殖及凋亡的影响。方法采用弗氏完全佐剂加肝细胞特异性脂蛋白法建立自身免疫性肝炎大鼠模型。分别分离纯化正常大鼠及模型大鼠肝星状细胞,实验室常规培养,观察组培养基中加褪黑素使终浓度为10μmol／L,空白对照组培养基中不加任何药物。培养48h后,观察其形态及数量的变化,并检测肝星状细胞的凋亡百分率。结果培养48h后,未加入MT的正常大鼠及模型组来源的HSC生长良好,MT组HSC分布稀疏,部分细胞皱缩,数量明显少于正常对照组及模型组;与另两组比较,MT组HSC凋亡率明显升高,差异有显著性（P〈0．05）。结论褪黑素能抑制自身免疫性肝炎大鼠肝星状细胞的增殖和分化,并能促进其凋亡。     

Oct4介导小鼠原代肝细胞直接重编程为Pdx-1阳性细胞

目的：Oct4介导小鼠原代肝细胞直接重编程为Pdx-1阳性细胞的研究。方法：利用小鼠慢病毒载体pWPT-Oct4联合包装质粒包装病毒,含有PEG6000的病毒浓缩液对病毒原液进行浓缩;慢病毒浓缩液感染利用两步胶原酶灌流法分离培养的小鼠肝细胞;RT-PCR检测肝脏、胰腺谱系及多能性转录因子表达。结果：含有Oct4慢病毒感染小鼠原代肝细胞后,Oct4出现表达,肝细胞相关转录因子（Alb、Afp）表达逐渐下降,内胚层早期标志物Foxa2的表达随时间的增加而减弱,Sox17在感染后12d、18d出现表达,并表达胰腺发育过程中的关键性基因-胰十二指肠同源异盒蛋白-1（pancreatic duodenal homeobox-1,Pdx-1）;不表达Nanog及Sox2等多能性基因。结论：在Oct4介导下成功去分化小鼠原代肝细胞,出现Pdx-1阳性细胞。     

模拟微重力条件下大鼠肝细胞的三维培养及其功能

采用肝脏原位灌流法分离大鼠肝细胞,以血纤维蛋白膜作支架,在RWVB回转器提供的模拟微重力条件下,对肝细胞进行三维培养。肝细胞经连续培养28h后,细胞仍呈球状,并获得了三维培养条件下大鼠肝细胞团（约为200－300个／细胞团）。三维培养的肝细胞在培养期间具有持续分泌ALB和TBA的功能,而单层培养的肝细胞仅在接种后18d内具有一定分泌功能,之后细胞逐渐衰老死亡。三维培养的肝细胞培养至28d时仍可检测到G6PD,PFK,PGM三种糖代谢关键酶基因的转录,而单层培养的肝细胞在接种后第6d就检测不到PFK,PGM的转录。结果表明,模拟微重力条件下三维培养的肝细胞在培养期间不仅能维持正常细胞形态,而且具有稳定的分泌功能和糖代谢功能,而单层培养的肝细胞分泌功能显著下降,糖代谢功能出现异常。     

大鼠肝细胞的分离技术

本文介绍一种采用含胶原酶的无钙、镁离子缓冲液系统灌注大鼠肝脏来分离大鼠肝细胞的方法,分离得到的肝细胞成活率达96％左右,且细胞产率较高。细胞在37℃恒温的waymouth溶液中、pH7.2—7.4、保持通气(95％O_2,5％CO_2),不断轻微搅拌的条件下,活力可维持8小时以上。     

济元阳口服液主要药效实验研究

以济元阳口服液7g/kg、14g/kg灌胃,使小鼠性器官、副性器官重量显著增加,去势大鼠副性器官亦有增加;小鼠附睾精子数量增加,精子活率提高,并能对抗环磷酰胺所致精子数量与活力下降,雄性小鼠及去势大鼠交配能力均有增强;肾阳虚小鼠体重、胸腺指数上升,自由活动、游泳耐力及耐寒能力均有所增强,以上实验结果表明,济元阳口服液有补肾壮阳、生精长力之功效。     

利用NASH大鼠原代肝细胞与原代Kupffer细胞共培养建立NASH原代细胞模型*

目的: 通过分离并提纯非酒精性脂肪性肝炎(NASH)大鼠原代肝细胞以及原代Kupffer细胞建立体外NASH原代细胞模型,为研究NASH提供可靠的细胞实验技术支持。方法: 选择SD大鼠40只,随机分为2组(n=20):对照组和NASH组,对照组大鼠利用普通饲料喂养,NASH组大鼠利用高脂饲料(88%基础饲料+10%猪油+ 2%胆固醇)喂养,6～8周后,利用NASH评分表,病理观察下肝组织切片脂肪变+小叶内炎症+气球样变评分≥4 分,表明大鼠NASH模型的成功建立,利用胶原酶原位灌注法分离并提纯NASH模型大鼠原代肝细胞以及原代Kupffer细胞,利用CK-18及CD68免疫荧光以及墨汁吞墨实验进行细胞鉴定,利用油红O染色、试剂盒测定谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)含量观察NASH大鼠原代肝细胞脂质累积和肝功情况,Western blot检测原代Kupffer细胞炎症因子表达情况,最后采用原代肝细胞:原代Kupffer细胞=6∶1比例共培养,显微镜下观察细胞状态。结果: 实验成功分离并提纯NASH原代肝细胞以及原代Kupffer细胞,通过油红O染色,NASH组大鼠原代肝细胞存在明显的脂肪沉积,且NASH组大鼠原代肝细胞中AST、ALT明显高于对照组,存在明显肝损伤(P＜0.05),Western blot测定原代Kupffer细胞TNF-α、IL-1β以及MCP-1,NASH组大鼠明显高于对照组(P＜0.05)。结论: 通过胶原酶原位灌注法可以成功分离NASH大鼠原代肝细胞以及原代Kupffer细胞,同时成功建立比例共培养大鼠体外原代细胞NASH模型。