大肠杆菌ubiC基因的克隆及序列分析

研究以克隆得到正确序列的大肠杆菌ubiC基因目的,实验通过PCR方法从大肠杆菌基因组中扩增得到了ubiC基因,扩增产物克隆到pUC118载体,转化大肠杆菌JM109,DNA序列分析结果表明克隆得到的大肠杆菌ubiC基因碱基序列正确。     

木薯Actin基因片段的克隆及序列分析

克隆木薯Actin基因片段,为研究其他基因在木薯中的表达和调控提供内参基因.通过比较拟南芥、蓖麻和麻风树Actin基因cDNA同源区域,根据基因的保守序列设计一对简并性引物,采用RT-PCR的方法扩增Actin基因片段,使用分子生物学软件进行分析.结果显示,获得一段大小为698 bp的基因片段,编码233个氨基酸;该基因序列与其他Actin基因核苷酸序列的同源性均在85%以上,氨基酸序列的同源性达94%以上;系统进化分析表明,木薯Actin基因与大戟科植物橡胶、麻风树及蓖麻的亲缘关系最近,与毛果杨、陆地棉及木瓜等植物Actin基因具有较高的保守性.克隆的基因片段为木薯Actin基因片段,并命名为msACT.     

蒙古牛BMPR-IB基因部分cDNA的克隆和序列分析

BMPR-IB基因主要在哺乳动物卵巢中表达,对卵泡的发育和分化起重要作用。该研究从影响卵巢生长发育和调控的BMPR-IB基因出发,以牛卵巢的RNA为模板,按照不同物种BMPR-IB基因的相似性设计特异引物,运用RT-PCR技术扩增并获得了特异片段,该片段经PCR、酶切和测序验证,证实所克隆序列为牛BMPR-IB序列,包含有953bp组成的部分cDNA序列,同源性分析结果表明,牛BMPR-IB基因序列与绵羊、山羊、人、猪、小鼠的BMPR-IB基因分别为98%、97%、92%、93%、88%的同源性。这为克隆其他物种的BMPR-IB基因提供了依据,同时牛骨形态发生蛋白的测序为更好地理解牛的生殖机理提供帮助。     

厚藤Actin基因片段的克隆及序列分析

为研究功能基因在厚藤(Ipomoea pes-caprae L)中的表达和调控提供内参基因,本文根据Actin基因的保守区设计简并性引物,采用RT-PCR克隆厚藤的Actin基因片段,然后将获得的片段连接于克隆载体上进行测序,并运用分子生物学软件对该基因序列进行分析。结果表明,该基因片段大小为554bp,编码184个氨基酸;该序列与其他植物Actin基因的cDNA序列的同源性均在80%以上,与氨基酸序列的同源性在94%以上。由此得出,本研究克隆的基因序列为Actin基因片段,将其命名为IpActin1,并登录在GenBank,登录号为KU564627。     

泥鳅MnSOD基因的电子克隆及序列分析

目的:电子克隆并分析泥鳅MnSOD基因.方法:通过电子克隆泥鳅MnSOD基因的开放阅读框,并对其氨基酸组成、功能结构域、系统进化、信号肽、二级结构、三级结构等信息进行预测分析.结果:通过电子克隆获得泥鳅MnSOD基因的cDNA.该基因的开放阅读框大小为675bp,编码224个氨基酸残基,推导的蛋白质分子量为25kDa,等电点约为8.41,其编码序列与其他物种相比非常保守,与鲤形目淡水鱼的MnSOD在进化上亲缘关系最近.其N端含转运肽,推测它定位于线粒体中.预测泥鳅MnSOD的二级结构及三级结构含有较多的不规则卷曲和α螺旋,其N端为两个长的反平行螺旋,C端则为含有拧成三股折叠片的α+β结构.结论:该研究为泥鳅进一步的分子生物学及抗氧化研究奠定了基础.     

羊驼催乳素基因cDNA克隆及序列分析

实验通过克隆分析羊驼催乳素基因的部分序列,对羊驼催乳素基因的结构和功能进行初步探索和揭示。从GeneBank中已报到的脊椎动物催乳素基因保守区设计一对引物,采用Trizol法提取羊驼胎盘总RNA,利用RT-PCR技术扩增出长度约为510 bp的片断。测序后在NCB I工作平台中进行BLASTn同源性比较,得出结论:羊驼催乳素基因与已登录的哺乳动物催乳素基因同源性均超过85%,最高达97%。借助DNAstar分子生物学分析软件绘制了相关动物的遗传进化图,并对羊驼的种属地位进行了进一步验证。。     

甜菜NADH-NR基因的克隆和序列分析

利用同源序列克隆方法从标准偏高糖型甜菜品种甜研7号(Ty7)中获得氯素诱导NADH-NR基因片段,通过RACE技术克隆NADH-NR基因全长序列.该基因ORF长度2 718 bp,编码905个氨基酸,包括147 bp的5'UTR和382 bp的3' UTR,GenBank上的注册号为EU163265,基因编码蛋白的等电点为6.12,推测分子量大小为102 kD,C端(778-891 aa)有一个跨膜区域.基因编码多肽含有3个氧化还原功能区:钼辅因子功能区(eukary NR Moco,93 - 478aa),Fe-血红素结合区(Cytb5,535 -608 aa),FAD结合区(FAD binding 6,653 -760 aa).在甜研7号NR下游的氨基酸残基中含有NADH-NR特有的CGPPP-M基序,说明该蛋白以NADH为电子供体.通过比对,甜研7号的NADH-NR基因与菠菜NADH-NR基因同源性最高,为86.18％.经Southem杂变检验,甜研7号中NADH-NR基因以低拷贝数存在.经基因组克隆分析,甜研7号NADH-NR含有3个内含子,4个外显子.     

猪Fas基因的克隆及序列分析

广西大学动物科技学院李军、李晓宁、杨坚和罗建荣四位科研工作者从pk-15细胞中提取总RNA,用RT—PCR方法扩增出猪Fas基因,将其克隆到PMD18-T载体上,再进行序列分析,结果表明：克隆的猪Fas基因序列与genBank上登录的猪Fas基因同源性为100％,与人、牛、羊的Fas基因核苷酸及推导的氨基酸序列同源性分别为73．4％、79．2％、76．4％和56．2％、67．0％、64．6％。Fas蛋白胞内区的死亡域,其氨基酸序列在猪、牛、羊与人的基因中呈现较高的同源性。[第一段]     

大麻哈鱼生长激素基因Ⅱ的分子克隆和序列分析

以λ噬菌体ＥＭＢＬ－３为基因载体,构建大麻哈鱼（Ｏｎｃｏｒｈｙｎｃｈｕｓ　ｋｅｔａ）基因组文库,并从中分离出含全长的生长激素（ｃｓＧＨ）基因的克隆。本研究首次报道了对ｃｓＧＨ全长核苷酸序列分析的结果。发现ｃｓＧＨ基因由６个外显子和５个内含子组成,长度为３３６１碱基对（ｂｐ）。由该序列可推导出含２１０个氨基酸的多肽,其中存在２２个疏水氨基酸残基的信号肽。本研究所分析的ｃｓＧＨ的外显子和内含子,其排列方式与其他鲑类（Ｓａｌｍｏｎｉｄｓ）和罗非鱼（Ｔｉｌａｐｉａ）是相似的,而与鲤科鱼类（Ｃａｒｐｓ）不同,后者外显子和内含子的排列方式与哺乳类和鸟类相似。将所测定的 ｃｓＧＨ基因的编码区与已发表的 ｃｓＧＨⅡ和ｃｓＧＨ Ⅱ两种 ｃＤＮＡ序列进行比较,证明本研究所克隆的 ｃｓＧＨ基因应属于 ｃｓＧＨ Ⅱ,因它们的编码序列 １００％同源。     

北极狐GHR基因cDNA的克隆及序列分析

本文根据狗(AF133835)的GHR基因cDNA编码全序列设计了三对引物,利用RT-PCR方法克隆出北极狐GHR基因编码区全长cDNA序列(GenBank accession No.EU304325)。结果表明,北极狐GHR的ORF为1917bp,编码638个氨基酸的前体蛋白,由18个氨基酸的信号肽和620个氨基酸的成熟肽组成。通过同源性比较发现北极狐与狗的同源性最高,达到98%。另外,利用邻接法(NJ法)构建的分子系统进化树聚类结果表明,北极狐与狗先聚为一类,该聚类结果与传统的物种进化关系基本一致。另外,通过氨基酸对位序列比较发现,北极狐GHR在氨基酸序列上存在明显的特异性,如45和451位分别为A和E,而其它物种均分别为T(大鼠为K)和A(牛羊为V,鼠为T)。     

中国人杀菌蛋白氨基端基因的克隆和序列分析

本文报道中国人杀菌蛋白（BPI）氨基端基因CDNA的克隆及序列测定。采用逆转录PCR方法,分别从HL-60细胞和正常人外周血、HGVRNA阳性献血员外周血的淋巴细胞中克隆了人BPI氨基端基因BG₆₀、BG_Nor和BG_HGV。序列分析结果表明：BG₆₀与文献报道一致：BG_Nor有3个核苷酸差异,推导有1个氨基酸变化;BG_HGV有3个核苷酸差异,其中一处与BG_{Nor相似文献}   

烟曲霉rRNA基因ITS区的克隆测序分析*

对烟曲霉rRNA基因内转录间区（ITS区）进行了克隆测序,并将之与其他几种常见曲霉的相应序列进行了比较。发现3株烟曲霉的ITSⅠ区完全相同,而其中1株烟曲霉的ITSⅡ区与一条已知相应序列仅有2个碱基的变异。提示烟曲霉rRNA基因的两个ITS区序列均十分保守,而且与黄曲霉、黑曲霉、土曲霉及构巢曲霉的相应序列相比较,均有一定程度的变异。     

烟曲霉rRNA基因ITS区的克隆测序分析

对烟曲霉rRNA基因内转录间区(ITS区)进行了克隆测序,并将之与其他几种常见曲霉的相应序列进行了比较.发现3株烟曲霉的ITSⅠ区完全相同,而其中1株烟曲霉的ITSⅡ区与一条已知相应序列仅有2个碱基的变异.提示烟曲霉rRNA基因的两个ITS区序列均十分保守,而且与黄曲霉、黑曲霉、土曲霉及构巢曲霉的相应序列相比较,均有一定程度的变异.     

Ralstonia eutropha CH34酯酶基因的克隆和序列分析

采用含α－乙酸萘酯和固兰RR的表面琼脂法从Ralstonia eutropha CH34的基因文库中筛选酯酶基因estA,对含有est的１.7kb DNA片段的核甘酸序列分析表明,该基因全长８２５bp,编码由２７５个氨基酸组成的ＥstＡ蛋白,分子量为30785D,经推导氨基酸序列的同源性分析,发现EstA与参与芳香化合物代谢中间位裂解途径的水解酶有很高的同源性。     

金黄色葡萄球菌核酸酶基因的片段缺失与定点突变

金黄色葡萄球菌核酸酶R(SNase R)是金黄色葡萄球菌核酸酶(SNase A)的一种类似物,具有与SNaseA相同的酶活性,与SNase A唯一不同之处是在N端多出6个氨基酸残基。为了得到完整的SNase基因并使其在E.Coli中表达,我们利用单链U模板—单引物突变法,将为6个额外氨基酸残基编码的18个氨基酸残基删除,其突变率可达90％。进而,完整的SNase A基因被重组入表达载体pBV221。细菌表达产物的PAGE分析结果指出,SNase A在E.coli中得到高效表达。与此同时,我们利用两个不同的引物在单链U模板上同时介导两种不同类型的突变(片段缺失、碱基取代)其突变率可达83％以上,这为进行多种类型的高效突变提供一个有用的方法。本文也对影响突变率的某些实验因素进行了讨论。     

舞毒蛾核型多角体病毒多角体蛋白基因的克隆、测序和表达

从东北林业大学实验林场采集并纯化了舞毒蛾核型多角体病毒（LdMNPV-NEFU)。用蛋白酶K消化,提取了病毒基因组DNA。用PCR方法,克隆出了该病毒的多角体蛋白（polyhedrin)基因,并对该基因进行了序列测定。结果显示,该基因序列是一个含有735个碱基对的开放阅读框（ORF）,该阅读框编码245个氨基酸。有5对碱基与加拿大病毒株LdMNPV-G的多角体蛋白基因序列存在差异。LdMNPV-NEFU分离株的多角体蛋白基因的第54,109,379,508和701位（从起始密码子中的A开始）分别是C,G,T,C和G,而LdMNPV-G分离株的多角体蛋白基因（ORF）相应位置上的碱基分别是G,C,C,T和T,两个ORF编码的对应位置的氨基酸绝大多数相同,只有一对不同,即由LdMNPV-NEFU编码的天冬氨酸和由LdMNPV-G编码的对应位置的组氨酸。以质粒pT-7-7为载体,多角体蛋白基因在大肠杆菌BL21（DE3）菌株中进行了原核表达。     

THE CLONING, SEQUENCING AND EXPRESSION OF THE LdMNPV POLYHEDRIN GENE

Abstract  LdMNPV - NEFU isolate collected from the forestry farm of Northeast Forestry University was purified and the genomic DNA of MMNPV was extracted. The LdMNPV polyhedrin gene was cloned by PCR. The results showed that the sequence was an open reading frame (ORF) of 735bp capable of encoding 245 amino acids. The polyhedrin gene sequences of the MMNPV-NEFU isolate and a Canada strain, MMNPV-G differed in 5 bases. The polyhedrin gene of the LdMNPV-NEFU isolate contained C, G, T, C and G at 54, 109,379, 508 and 701 sites from the start codon, but the LdMNPV-G isolate contained G, C, C, T and T at the corresponding sites respectively. The same amino acids were encoded by the two ORF sequences, with the exception that Asp and His are encoded by GAC on the polyhedrin gene sequence of the LdMNPV-NEFU isolate and by CAC in the MMNPV-G isolate. The MMNPV polyhedrin gene was expressed in E. coli BL21 (DE3) by the pT7–7 plasmid vector.     

巴西固氮螺菌Yu62nifA基因克隆、测序及功能分析

用TD-PCR法克隆了巴西固氮螺菌(Azospirillun brasilense)Yu62的nifA基因.序列分析表明它与巴西固氮螺菌Sp7的nifA序列高度同源(96.5%),其编码的产物NifA蛋白与Sp7菌株NifA的氨基酸序列同源性为97.6%.该基因可以完全互补巴西固氮螺菌Sp7 nifA-突变株的Nif-表型.研究了NH4+和O2对Yu62 nifA基因的表达及NifA活性的影响.结果表明mfA基因在Yu62菌株中是部分组成型表达的,氨和氧不能完全阻遏其表达,在5mmol/LNH4Cl与微氧(0.5%O2)条件下表达最高;NifA蛋白在0.4%～0.5%O2时活性最高,氧分压降低和提高都使NifA活性下降,1mmol/L NH4Cl足以抑制NifA的活性.     

牙龈卟啉菌牙龈蛋白酶K的基因克隆和序列分析

利用PCR方法 ,分别扩增牙龈卟啉菌牙龈蛋白酶K (KGP)的催化结构域 (KGPcd)和凝集素结构域 (KGP-hag)的基因片段 ,将基因片段插入pGEM-T easyVector,通过限制性酶切和核苷酸序列分析鉴定, KGPcd和KGP hag的序列与国外文献报道一致。克隆到牙龈卟啉菌KGP的KGPcd和KGP hag基因 ,为体外表达其活性蛋白奠定了基础。