重组GFP干酪乳杆菌的构建及其在小鼠肠道内的定植分布

【目的】研究重组干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)在小鼠肠道内定植能力及分布规律。【方法】利用绿色荧光蛋白(GFP)基因作为报告基因,构建pgsA基因与GFP的融合基因载体pLA-GFP,电转化到乳酸杆菌中,得到阳性重组菌。将重组菌以每只109mL-1的量,口服接种SPF级BALB/c小鼠,分别于口服后的1.5h、3h、12h、1d、3d、5d、6d、7d之后取其十二指肠、空肠、回肠、盲肠的肠道冲洗液,通过平板菌落计数法检测肠道内的重组干酪乳杆菌。【结果】Western blot结果显示约69kDa的融合蛋白在乳酸菌中得到了正确的表达;重组菌在蓝紫光激发下,发出绿色荧光。小鼠口服重组菌后能在肠道黏膜的不同部位以一定的比例存活并附着在肠黏膜表面,口服6d后达到定植高峰期,7d后在十二指肠、空肠、回肠和盲肠定植率分别占第1天的16.49%、25.08%、47.71%、41.03%。【结论】GFP在干酪乳杆菌中得到了稳定的表达,且在小鼠肠道内具有良好的定植能力,定植规律回肠盲肠空肠十二指肠,这为研究乳酸杆菌作为口服疫苗抗原递送载体及其对小鼠肠道免疫机理提供试验基础。     

减毒沙门氏菌介导的小鼠肝炎病毒S1基因DNA疫苗的免疫特性分析

根据GenBank公开序列自行设计一对引物,通过RT-PCR扩增出小鼠肝炎病毒的全长S1基因,并将其插入真核表达质粒pVAX1中,构建出重组真核表达质粒pVAX1-S1。将重组质粒转染COS-7细胞,采用间接免疫荧光检测出S1蛋白的体外表达。将重组质粒转入减毒鼠伤寒沙门氏菌SL7207中,构建出运送DNA疫苗的重组沙门氏菌SL7207(pVAX1-S1)。分别以5×108CFU、1×109CFU、2×109CFU剂量的重组菌口服接种6周龄BALB/c小鼠,试验结果表明,重组菌对小鼠具有良好的安全性。以1×109CFU剂量的重组菌口服免疫小鼠,抗体检测结果显示,在二免后两周和三免后两周,重组菌免疫组的血清抗体水平与SL7207(pVAX1)空载体免疫组间分别存在显著性差异(P<0.05)和极显著性差异(P<0.01)。在三免后两周重组菌免疫组出现了较高水平的肠黏膜抗体。     

乳酸杆菌对大鼠细菌性阴道感染动物模型疗效观察

目的探讨乳酸杆菌对大鼠阴道菌群抑制及阴道菌群的调理作用。方法通过大鼠阴道混合感染葡萄球菌和大肠埃希菌的动物模型,以阴道分泌物的菌群分析和阴道黏膜炎症的治愈程度为指标,观察乳酸杆菌治疗组的治疗效果,用乳酸杆菌菌液冲洗治疗来去除大肠埃希菌和葡萄球菌在大鼠阴道的定植。结果通过各组大鼠阴道冲洗液检出的平均对数值比较,乳酸杆菌治疗组的大鼠阴道内大肠埃希菌和葡萄球菌的数量明显较对照组的数量减少（P〈0．05）,而且治疗组黏膜炎症的治愈程度显著好于对照组。结论乳酸杆菌能有效地去除大肠埃希菌和葡萄球菌的大鼠阴道定植和改善大鼠外阴的炎症症状。     

一种新型的重组单链三特异抗体的构建与表达

双特异抗体由于其缺乏共刺激信号 ,激活的T细胞往往会导致凋亡。为了更有效地杀伤肿瘤细胞 ,构建了抗卵巢癌单链×抗CD3单链×抗CD2 8单域重组三特异抗体的表达载体。利用大肠杆菌中的分子伴侣FkpA与三特异抗体共表达 ,提高了三特异抗体的在BL2 1Star菌中的可溶性原核表达。ELISA结果显示 ,可溶性的重组单链三特异抗体 (sTRI)与SK OV 3细胞的膜抗原 ,Jurkat细胞上的CD3分子以及重组CD2 8抗原均有较强的结合活性。桥连试验证明该抗体能同时与SK OV 3细胞和Jurkat细胞结合。体外杀伤试验表明该抗体能激活外周血T细胞来杀伤肿瘤细胞。形态学观察也进一步说明该抗体具有良好的结合活性以及体外杀伤活性。这种新型的重组单链三特异抗体为基于T细胞的癌症免疫治疗建立了一个新的技术平台。     

人干扰素α-2b基因在德氏乳杆菌的表达与鉴定

目的:试图用乳酸杆菌在局部分泌干扰素,以达到预防和治疗病毒感染.方法:以pBLUE/IFN α-2b为模板,采用PCR技术将IFNα-2b基因扩增然后插入乳酸菌表达载体pSClllAE,将重组质粒电转德氏乳杆菌DM8909,获得重组菌株.在含乳糖的MRS培养基培养并诱导表达,表达产物分泌到菌液上清.结果:分别用PCR和ELISA鉴定目的基因和表达产物,利用WISH-VSV系统采用细胞病变抑制法,测定表达产物IFN α-2b的抗病毒活性,平均效价为1.41×105IU/ml.结论:本研究为以乳酸杆菌为载体在局部产生治疗性药物奠定了基础.     

抗HBcAg人源性单链抗体细胞内表达及其抗病毒复制的实验研究

应用人源性抗HBcAg单链抗体细胞内表达技术,探讨抗HBV复制基因治疗的应用价值.应用噬菌体展示和基因重组技术,从HBV感染的外周血淋巴细胞克隆了人源性抗HBcAg单链抗体,并重组至逆转录病毒载体.以人肝癌细胞smmc-7721和PLC/PRF/5为靶细胞进行基因共转染,分别测定实验组细胞上清中的HBsAg和HBeAg,与对照组做比较,观察抗HBcAg单链抗体细胞内表达的抗病毒治疗作用.结果显示,在急性HBV感染的细胞株中,抑制病毒复制效率为49%～61%,在慢性病毒感染细胞,抑制率为41%～54%.实验结果表明,应用单链抗体细胞内表达技术,在抗病毒治疗研究中具有潜在的应用价值.应对HBV的4个开放阅读框架编码产物进行全面的对比研究,以发现抑制效率高、实用价值大的靶基因.     

CD4-CCR5工程类重组二价抗体的慢病毒包装及制备

人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus,HIV)感染与白细胞分化抗原分子CD4和趋化因子受体分子CCR5有着紧密的联系。为了研制可与HIV病毒特异性结合,并能有效预防和治疗HIV感染的抗HIV基因工程二价类重组药物,将人抗体重链恒定区IgG与CD4相连接,CCR5与人抗体轻链恒定区连接,分别构建慢病毒质粒,共转染并筛选,得到高效稳定表达的细胞株。重组抗体经分子生物学及细胞免疫学检测,证实具有抗HIV病毒感染的功能,有一定的经济价值。     

新型噬菌体表面呈现载体的构建

作为抗体库筛选的一个有效方法,噬菌体表面呈现技术在单链抗体的研制和中得到广泛的应用。以噬菌粒pCANTAB5E和pHB为基础。利用PCR和DNA重组方法,构建了一个新型的用于单链抗体噬菌体表面呈现的噬菌粒载体,随后用一株对大肠杆菌细胞有毒性的人源化单链抗体（1HSCFV）对其呈现单链抗体的效果进行了初步的评价。结果表明新型噬菌粒系统具有更好的呈现能力。     

抗EGFRvⅢ单链抗体的原核表达条件的优化及纯化

为了构建抗EGFRvⅢ单链抗体大肠杆菌表达体系,优化抗EGFRvⅢ单链抗体在大肠杆菌中的表达条件,并建立纯化方法。构建抗EGFRvⅢ单链抗体的pET-22b(+)重组质粒,将其转化到大肠杆菌BL21中,研究不同温度、不同浓度诱导剂对目的蛋白表达效率的影响。用Ni2+亲和层析纯化蛋白,并通过免疫印迹对其进行鉴定。抗EGFRvⅢ单链抗体重组质粒经NdeⅠ和XhoⅠ双酶切,菌落PCR和测序验证,结果显示重组质粒构建成功。SDS-PAGE结果表明BL21表达的目的蛋白相对分子量为29kD左右,与理论分子量一致,免疫印迹结果表明在29kD左右出现一条特异性条带,与SDS-PAGE结果一致。15℃和0.6μmol/L的诱导剂为抗EGFRvⅢ单链抗体的最佳诱导条件。本研究成功构建了抗EGFRvⅢ单链抗体大肠杆菌表达体系,并获得了大肠杆菌表达单链抗体的最佳诱导条件。     

应用噬菌体抗体库技术制备特异抗人纤维蛋白鼠单链抗体

应用Pharmacia公司的重组噬菌体抗体系统,从经过人交联纤维蛋白特异抗原D二聚体(DD)免疫过的鼠脾细胞mRNA中构建出组合单链抗体(ScFv)cDNA文库。文库cDNA克隆到噬菌粒载体pCANTAB5E,转化大肠杆菌TG1,得到2.5×10~5个氨苄抗性菌落。通过噬菌体表面呈现,用DD对表达的重组噬菌体单链抗体文库进行三轮亲和富集获得一株特异抗DD的噬菌体单链抗体(ScFvA11)。经Phage-ELISA鉴定,呈现在噬菌体表面的ScFvA11与DD结合的ELISA阳性滴度小于10~7tfu/ml,而与人纤维蛋白原结合的ELISA滴度大于10~(10)tfu/ml,两者相差1000倍以上。表明ScFvA11具有较好的DD结合特异性。经序列分析,ScFvA11cDNA全长729bp,其中Vh基因354bp,编码118个氨基酸;Vl基因327bp,编码108个氨基酸;Vh与Vl之间为(Gly_4Ser)_315个氨基酸连接肽。     

六种藓类植物茎的比较解剖学研究

通过对6种藓类植物,即褶叶青藓(Brachythecium salebrosum(Web.et Mohr.)B.S.G.)、湿地匐灯藓(Plagiomnium acutum(Lindb.)Kop.)、侧枝匐灯藓(Plagiomnium maximoviczii(Lindb.)Kop.)、大凤尾藓(Fissidensnobilis Griff.)、大羽藓(Thuidium cymbifolium(Doz.et Molk.)B.S.G.)和大灰藓(Hypnum plumaeforme Wils.)嫩茎和老茎的石蜡切片和显微观察发现,同一藓类植株的嫩茎和老茎,茎结构稳定,不同种藓类植物茎横切面具有不同特征.植物体茎横切面形状、表层细胞的层数、细胞大小和细胞壁厚薄、皮层细胞大小和形状、中轴的有无以及比例等特征可以作为藓类植物的分科分类依据之一.     

Cause of Senescence of Nine Sorts of Flowers

The levels of endogenous phytohormones and respiratory rate in nine sorts of flowers such as Cymbidium faberi Rolfe, Nopalxochia ackermannii Kunth and others were investigated both at full bloom and senescence and meanwhile the effect of exogenous phytohormones on prolonging the blossoms and promoting ethylene production were tested. There is a high content of endogenous ethylene in all the long-lived flowere, about 3–16 folds higer than the short-lived ones. There is a high level of ABA at full blooming flowers of short-lived flowers, in which there is no or only some cytokinins in it, but the ratio of CTK (6BA+zeatin)/ABA is smaller(l.7). The endogenous ABA reached a much higher level at senescence in all nine sorts of flowers, so it is reasonable to consider that it is ABA which plays an important role of regulation in controlling flower's senescence. There is a much higher level of GA3 and zeatin in the long-lived flowers which is not demonstrated in the shortlived ones. The respiratory rate is one of the factors controtling the longevity of flowers, but it does not play a decided role. Application of 6BA and zeatin prolongs distinctly orchid’s longevity, however exogenous IAA through the promotive action on ethylene production, evidently extends the longevity of the flowers of the Nopalxochia ackermannii Kunth.     

真菌类遗传学分析的知识结构教学

本文以认知结构理论为指导,讨论了真菌类遗传分析与高等动植物遗传分析的内在联系,认为利用这种内在联系进行教学可收到好的效果并说明了作者的具体教学过程。 Abstract:In the paper, the relationship between genetic analysis of Fungi and genetic analysis of high animal and plant was discussed.A good results were obtained when we adopted this method in the teaching.     

医疗机构合理用药评价模型的构建研究

目的 针对医疗机构的合理用药水平进行评价研究。方法 根据医疗机构合理用药的具体要求,构建医疗机构合理用药评价指标体系,采用基于模糊群决策的方法和多指标评价分析法构建医疗机构合理用药评价模型。结果 构建了基于模糊群决策的医疗机构合理用药评价模型,并通过实例分析证明了评价模型的可行性。结论 建立的基于模糊群决策的医疗机构合理用药评价模型能够对医疗机构的合理用药水平进行科学评价,为提高医疗机构合理用药水平奠定基础。     

棉铃虫钙粘蛋白N端多肽多克隆抗体制备及对Bt抗性的初步检测

用重组表达的棉铃虫Helicoverpa armigera(Hübner)中肠钙粘蛋白N端多肽片段制备兔多克隆抗体,并利用其对Bt抗性进行鉴定。通过RT-PCR方法对棉铃虫中肠钙粘蛋白N端多肽的基因片段Cad285进行PCR扩增,将其克隆到pET-30a原核表达载体中,在大肠杆菌BL21(DE3)中经IPTG诱导表达,得到35ku的重组融和蛋白,融合表达的包涵体经过变性、Ni-NTA柱亲和纯化、复性等方法处理包涵体,获得可溶性纯化蛋白,用纯化后蛋白免疫新西兰兔制备多克隆抗体,ELISA检测其效价高于1∶16000;利用最终获得的多克隆抗体对室内纯合Bt抗/感品系的棉铃虫中肠钙粘蛋白进行Western blot分析,结果显示敏感和抗性品系之间有明显差异,表明其能够应用对Bt抗性进行初步检测。     

龙胆科药用植物化学成分的研究现状

龙胆科植物在我国的分布范围很广,且多数为药用植物,其多数种属的药用植物,至今其化学成分尚未被系统研究。综述了目前龙胆科药用植物的化学成分的研究现状及一般提取方法,对近年来发现的环烯醚萜及裂环烯醚萜类化合物进行了总结,为本科药用植物的更深入研究提供了参考。     

青蒿素生物合成机理研究现状

本文总结了目前有关青蒿素生物合成机理方面的研究,主要包括青蒿素生物合成中生理因子的影响,青蒿素生物合成中间体及前体,青蒿素生物合成细胞定位等。指出了存在的一些问题及今后的研究发展前景。