定点突变提高环氧化物水解酶AuEH2催化对甲基苯基缩水甘油醚的对映选择性*

环氧化物水解酶可催化外消旋环氧化物的动力学拆分或对映归一性水解制备手性环氧化物或邻二醇,具有广阔的应用前景.为提高宇佐美曲霉环氧化物水解酶 (AuEH2) 催化外消旋对甲基苯基缩水甘油醚 (rac-pMPGE) 的对映体选择率 (E).通过分子动力学模拟 (MD) 选取相互作用频率最高的位点A250替换为其他19种氨基酸;选取对映选择性显著提高的突变体测定其动力学参数 (K_m和k_cat) 及区域选择性系数 (β_S和β_R),并利用重组大肠杆菌全细胞拆分rac-pMPGE.突变体AuEH2^A250H的E值从12.7提高至38.4,重组菌比活力为51.9U/g湿细胞;其水解 (S)-pMPGE的k_cat/K_m从10.0mmol/(L·s)提高至12.8 mmol/(L·s),而水解 (R)-pMPGE的k_cat/K_m从1.13mmol/(L·s)降低至0.35mmol/(L·s);全细胞拆分20mmol/L rac-pMPGE获得 (R)-pMPGE的ee_s为>99%,产率从33.0% 提高至40.7%.A250位点的突变对AuEH2的对映选择性和酶活力具有显著影响;高对映选择性的AuEH2突变体在制备高光学纯的 (R)-pMPGE中具有应用潜力.     

酶法拆分制备(R)-苯基缩水甘油醚及缓冲体系对产物光学纯度的影响

新筛选出一株能选择性水解外消旋苯基缩水甘油醚(GPE)的菌株Bacillus megateriumZJUZQ-001,研究了其动力学拆分苯基缩水甘油醚条件,包括时间、温度、缓冲液类型和离子强度的影响。相比其他体系,硼酸缓冲液(100 mmol/L,pH 8.2)e.e._s值可以从91.2%提高到99.5%,E值从25.0提高到46.8,底物浓度从60 mmol/L增加到90 mmol/L。     

定点突变改善红色荧光指示蛋白玉米尿卟啉原Ⅲ甲基化酶的水溶性研究

尿卟啉原Ⅲ甲基化酶是一种新型的红色荧光指示蛋白,但是,在大肠杆菌重组表达的SUMT水溶性相对较低,限制了它的应用范围,而且对于结合在蛋白的色素组分尚不清楚。利用定点突变产生玉米尿卟啉原Ⅲ甲基化酶L88R/L89G双突变体和L166A突变体,两种突变体分别在大肠杆菌中重组表达,Ni-NTA一步纯化。紫外可见光谱扫描和质谱分析确定从纯化的L88R/L89G双突变体蛋白分离的色素组分。L88R/L89G双突变体在大肠杆菌细胞内有酶活,而L166A突变体胞内酶活丧失。结合蛋白的主要组分为三甲基化咕啉。纯化的双突变体蛋白水溶性增加,为提高它作为荧光指示蛋白检测外源融合蛋白的水溶性打下基础。     

高对映选择性环氧化物水解酶产生菌的筛选及特性研究*

从土壤中分离的芽孢杆菌BacillusmegateriumECU1 0 0 1所产环氧化物水解酶能高对映选择性水解缩水甘油苯基醚 (对映选择率E值可达 47 8) ,当转化率为 55.9%时 ,剩余的 (S) 缩水甘油苯基醚的光学纯度 (对映体过量值 ,ee)可达 99.5 % ;当底物浓度提高到 60mmol/L时 ,光学纯 (S) 缩水甘油苯基醚的收率达到 25.6%     

定点突变提高土曲霉Aspergillus terreus脂肪酶的催化活性

本研究旨在利用理性设计的方法来提高来源于土曲霉Aspergillus terreus的酸性脂肪酶ATL的催化活力。通过同源比对,选择脂肪酶盖子区域和底物结合口袋域中的位点进行定点突变,得到8种ATL的突变脂肪酶。结果发现,盖子区域突变酶ATLLid与底物结合口袋域突变酶ATLV218W的催化活性显著提高。ATLLid和ATLV218W对底物对硝基苯酚月桂酸酯p-nitrophenyl laurate(p-NPL)的催化活性最高,k_(cat)值较ATL分别提高了39.37倍和50.79倍,k_(cat)/K_m值较ATL分别提高了2.85倍和8.48倍。与ATL相比,ATLLid和ATLV218W的热稳定性略有下降,最适p H为5.0,p H 4.0–8.0具有较好的稳定性,说明突变未对ATL的嗜酸耐酸特性产生影响。通过同源建模模拟及分子对接技术分析底物p-NPL与酶分子间的相互作用,解析了ATLLid和ATLV218W催化活性提高的机理。     

定点突变提高虎杖聚酮合酶的苯亚甲基丙酮合酶活性北大核心CSCD

虎杖(Polygonum cuspidatum)聚酮合酶(polyketide synthase 1,PcPKS1)同时具有查尔酮合酶(chalcone synthase,CHS)及苯亚甲基丙酮合酶(benzylidene acetone synthase,BAS)催化活性,能够催化生成聚酮类化合物柚皮素查尔酮和苯亚甲基丙酮,进而催化合成黄酮类或覆盆子酮等具有多种生物学活性的化合物。本研究通过分析虎杖PcPKS1与掌叶大黄(Rheum palmatum)BAS、拟南芥(Arabidopsis thaliana)CHS等家族成员的序列以及酶催化位点的构象,确定可能影响酶功能的3个氨基酸位点:Thr133、Ser134、Ser339。采用定点突变对PcPKS1进行分子修饰,成功获得2个突变体并进行相关体外酶促反应,高效液相色谱(high performance liquid chromatography,HPLC)产物分析结果表明,在pH 7.0和pH 9.0的体外酶促条件下,突变体T133LS134A和S339V维持BAS和CHS双功能活性,且BAS活性显著高于原PcPKS1。本研究为利用PcPKS1进行基因工程调节黄酮类和覆盆子酮化合物的生物合成提供理论依据。     

决明胰蛋白酶抑制剂1活性相关残基的定点突变与抑制活性分析

决明胰蛋白酶抑制剂1（CoTI1）属于Kunitz胰蛋白酶抑制剂家族成员,通过序列比对预测Arg86、Leu84和Thr88等3个氨基酸残基可能是CoTI1发挥抑制作用的关键残基。通过定点突变的方法将Arg86、Leu84与Thr88残基分别突变为Asp残基,并考察各突变体对胰蛋白酶及棉铃虫等鳞翅目害虫消化酶的抑制作用。与CoTI1相比,CoTI1^R86D、CoTI1^T88D与CoTI1^L84D突变体对胰蛋白酶的抑制活性分别下降了93%、64%与59%;对棉铃虫、甜菜夜蛾、斜纹夜蛾等3种鳞翅目害虫消化酶的平均抑制活性分别下降了88.7%、57%与60.7%。以上结果表明Arg86、Leu84与Thr88是CoTI1发挥抑制作用的关键残基,这为CoTI1的抑制分子机制及抗虫研究提供了重要的理论依据。     

PCR技术对人IL-3 cDNA进行定点突变的研究

本文利用PCR技术对人IL-3cDNA体外进行定点突变,将人IL-3cDNA第3位Met,第116位Lys密码子突变为Val密码子GTT。PCR扩增片段核苷酸序列与引物设计相应的cDNA突变体序列完全一致。结果证实此方法比经典寡聚核苷酸方法简单、迅速、成本低、效率高,也为基因的修饰,蛋白质工程研究提供了简便、稳定的方法。     

定点突变技术研究苏云金杆菌Cry1类晶体蛋白结构与功能的进展

近年来利用定点突变技术研究苏云金杆菌（Bacillus thuringiesis,Bt）杀虫晶体蛋白（Insecticidal crystal proteins,ICP）作用机制已取得良好进展.杀虫晶体蛋白不同结构域上氨基酸残基的突变将影响其稳定性,与受体的结合,不可逆的昆虫中肠膜插入及离子通道活性的强弱等.突变研究表明,结构域Ⅰ参与不可逆结合及插入昆虫中肠膜过程;结构域Ⅱ参与受体结合,包括初始结合与不可逆结合;结构域Ⅲ在杀虫特异性和维持三维结构的稳定性方面起重要作用,同时,可能参与离子通道的形成,受体结合和插入昆虫中肠膜过程.利用各种定点突变技术对各位点进行突变可以研究单一位点的功能,到目前为止,已有很多关于这方面的研究,并且筛选到了毒力提高的工程菌株.     

通过定点突变提高乳链菌肽对热及pH的稳定性

【目的】通过定点突变技术改变乳链菌肽(nisin)特定位置氨基酸,获得性质改善的nisin突变体,为扩大其应用范围提供依据。【方法】在抑菌谱扩大的nisin单突变体M21K nisinZ的基础上,对M21K nisZ基因第29位丝氨酸密码子进行定点突变;将其克隆至乳酸菌表达载体pMG36e,并在Lactococcus lactis NZ9800中进行表达;双突变体M21K/S29K nisinZ经分离纯化后检测其在抑菌活性、抑菌谱和稳定性等方面的变化。【结果】与单突变体M21K nisinZ及野生型nisinZ(wild-type,WT)相比,双突变体M21K/S29K nisinZ对指示菌的抑菌活性虽有所下降,但其对温度及pH值的稳定性有显著提高。同时其抑菌谱与M21K nisinZ相同,可抑制革兰氏阴性菌,扩大了WT的抑菌谱。【结论】通过改变nisin分子特定位置的氨基酸可以改善nisin分子的理化性质,有可能得到应用范围更广的nisin品种。     

Biocatalytic preparation of (S)-phenyl glycidyl ether using newly isolated Bacillus megaterium ECU1001

A bacterial strain (ECU1001) capable of utilizing phenyl glycidyl ether as sole carbon source and energy source was isolated from soil samples through two steps of screening and was identified as a Bacillus megaterium. The epoxide hydrolase from Bacillus megaterium ECU1001 was biosynthesized in parallel with cell growth and a maximum activity of 31.0 U/l was reached after 30 h of culture when the biomass (DCW) was 9.1 g/l. A temperature of 35°C and pH 8.0 were optimal for the bioconversion. The lyophilized whole cells of Bacillus megaterium ECU1001 could preferentially hydrolyze the (R)-enantiomer of phenyl glycidyl ether, yeilding (S)-epoxide and (R)-diol with high enantioselectivity (E=47.8). The (S)-enantiomer of the epoxide remained in the reaction mixture with >99.5% ee (enantiomeric excess) at a conversion of 55.9%. The substrate concentration could be increased up to 60 mM without affecting the ee and (S)-phenyl glycidyl ether could be obtained with an optical purity of 100% ee and 25.6% yield. Therefore, the method is potentially useful for the preparative resolution of epoxides.     

偶氮还原酶AZR的结构及其K109的定点突变研究

利用同源建模构建了Rhodobacter sphaeroides的偶氮还原酶AZR的三级结构模型,AZR为一种α/β型结构的黄素氧化还原蛋白.两类依赖黄素的偶氮还原酶的三级结构对比表明它们具有高度的相似性.在序列和结构对齐分析的基础上,选择保守位点K109进行K109A和K109H的定点突变研究.突变后K109H的最适Ph=6,而K109A的最适Ph=9.突变未改变AZR的最适温度(30℃).第109位正电荷残基对甲基红的结合有重要影响;而K109H对NADPH的结合并非保守突变.K109可能只参与对NADPH的2'-磷酸基团的结合,而对NADH的结合无影响.     

偶氮还原酶AZR的结构及其K109的定点突变研究

利用同源建模构建了Rhodobacter sphaeroides的偶氮还原酶AZR的三级结构模型, AZR为一种a/b型结构的黄素氧化还原蛋白。两类依赖黄素的偶氮还原酶的三级结构对比表明它们具有高度的相似性。在序列和结构对齐分析的基础上, 选择保守位点K109进行K109A和K109H的定点突变研究。突变后K109H的最适pH=6, 而K109A的最适pH=9。突变未改变AZR的最适温度(30℃)。第109位正电荷残基对甲基红的结合有重要影响; 而K109H对NADPH的结合并非保守突变。K109可能只参与对NADPH的2’-磷酸基团的结合, 而对NADH的结合无影响。     

Y13F定点突变改良米曲霉中温木聚糖酶的耐热性

为改良米曲霉（Aspergillus oryzae）糖苷水解酶11家族木聚糖酶AoXyn11A的耐热性,将其Tyr¹³（Y13）置换为Phe（F）。基于AoXyn11A与同一家族7种耐热木聚糖酶一级结构的多序列同源比对及其三维结构的同源建模和分子动力学模拟,设计了一种突变酶AoXyn11A^Y13F;以重组质粒pPIC9K-Aoxyn11A为模板,采用PCR技术将AoXyn11A基因（Aoxyn11A）中编码Y13的密码子TAC突变为F的TTC,构建了一种突变酶基因（Aoxyn11A^Y13F）;分别将Aoxyn11A和Aoxyn11A^Y13F在毕赤酵母（Pichia pastoris）GS115中实施了表达,并对重组表达产物AoXyn11A和AoXyn11A^Y13F的耐热性进行了分析。结果表明：突变酶的最适温度T_opt由突变前的50℃提高到55℃;AoXyn11A^Y13F在50℃的半衰期t_1/2⁵⁰为95 min,较AoXyn11A（t_1/2⁵⁰=6 min）延长了约15倍。由此经Y13F定点突变显著改良了野生型木聚糖酶的耐热性。     

Molecular Docking and Site-directed Mutagenesis of a Bacillus thuringiensis Chitinase to Improve Chitinolytic,Synergistic Lepidopteran-larvicidal and Nematicidal Activities

Bacterial chitinases are useful in the biocontrol of agriculturally important pests and fungal pathogens. However, the utility of naturally occurring bacterial chitinases is often limited by their low enzyme activity. In this study, we constructed mutants of a Bacillus thuringiensis chitinase with enhanced activity based on homology modeling, molecular docking, and the site-directed mutagenesis of target residues to modify spatial positions, steric hindrances, or hydrophilicity/hydrophobicity. We first identified a gene from B. thuringiensis YBT-9602 that encodes a chitinase (Chi9602) belonging to glycosyl hydrolase family 18 with conserved substrate-binding and substrate-catalytic motifs. We constructed a structural model of a truncated version of Chi9602 (Chi9602_35-459) containing the substrate-binding domain using the homologous 1ITX protein of Bacillus circulans as the template. We performed molecular docking analysis of Chi9602_35-459 using di-N-acetyl-D-glucosamine as the ligand. We then selected 10 residues of interest from the docking area for the site-directed mutagenesis experiments and expression in Escherichia coli. Assays of the chitinolytic activity of the purified chitinases revealed that the three mutants exhibited increased chitinolytic activity. The ChiW50A mutant exhibited a greater than 60 % increase in chitinolytic activity, with similar pH, temperature and metal ion requirements, compared to wild-type Chi9602. Furthermore, ChiW50A exhibited pest-controlling activity and antifungal activity. Remarkable synergistic effects of this mutant with B. thuringiensis spore-crystal preparations against Helicoverpa armigera and Caenorhabditis elegans larvae and obvious activity against several plant-pathogenic fungi were observed.     

枯草蛋白酶E的定点突变及其对酶性质的影响

用定点突变的方法研究S221C/P225A,N118S/S221C/P225A,D60N/S221C/P225A和Q103R/S221C/P225A突变对蛋白酶活性,酯酶活性与蛋白酶活性之比的影响。结果表明：S221C/P225A突变使蛋白酶活性比枯草蛋白酶E低73000多倍,酯酶活性与蛋白酶活性之比是Subtiligase的3倍;N118S/S221C/P225A突变使蛋白酶活性和酯酶活性分别比S221C/P225A突变下降3.6倍和15倍,酯酶与蛋白酶活性之比下降4倍,同时增加变体酶的热稳定性;D60N/N118S/S221C/P225A突变使蛋白酶活性比N118S/S221C/P225A突变体下降15倍,但对酯酶活性几乎没有影响,酯酶与蛋白酶活性之比增加14倍,分别是S221C/P225A突变体和Subtiligase的3.3倍和10.3倍;但是,Q103R/N118S/S221C/P225A突变使蛋白酶活性比N118S/S221C/P225A突变体增加5倍,酯酶活性下降55倍,酯酶与蛋白酶活性之比下降1000倍。     

简单节杆菌3-甾酮-△1 -脱氢酶基因的克隆表达及定点突变研究

目的:将来源于简单节杆菌的3-甾酮-△~1-脱氢酶(3-ketosteroid-Delta(1)-dehydrogenase,KSDD)在大肠杆菌中进行表达,获得具有活性的脱氢酶;利用计算机预测KSDD的三级结构,并通过定点突变确定酶的关键位点以期优化脱氢酶的活性及性质。方法:克隆简单节杆菌编码KSDD的基因ksdd构建原核表达载体,以Escherichia coli BL21(DE3)为表达宿主构建重组菌并诱导表达,HPLC法检测重组酶催化4-AD脱氢的转化率;通过SWISS-MODEL同源建模分析KSDD结构,对预测的催化关键位点氨基酸残基进行定点突变并研究突变后重组酶的活性变化。结果:成功构建了表达脱氢酶KSDD的重组菌E.coli pET-22-ksdd,21℃下诱导表达后,重组酶对4-AD的转化率为27%;通过SWISS-MODEL同源建模预测出脱氢酶结构并对4个关键位点进行定点突变设计,获得突变子Y120R、Y320L、Y488F和G492Y。突变子Y120R和Y488F失活,证明其为酶的活性位点;突变子Y320L的转化率与野生型基本一致,但37℃反应条件下稳定性有所提高;突变子G492Y对4-AD的转化率是野生型的1.2倍,37℃条件下稳定性有所提高,是突变后氨基酸位点疏水性增加和周围静电作用改变所导致。结论:目前对简单节杆菌3-甾酮-△~1-脱氢酶结构分析及催化机理相关的研究较少,本研究验证了KSDD的活性位点,优化了酶的稳定性,为进一步对酶的性质进行定向改造打下了基础。     

Site-Directed Mutagenesis of Active Site Residues Reveals Plasticity of Human Butyrylcholinesterase in Substrate and Inhibitor Interactions

Abstract: In search of the molecular mechanisms underlying the broad substrate and inhibitor specificities of butyrylcholinesterase (BuChE), we employed site-directed mutagenesis to modify the catalytic triad residue Ser¹⁹⁸, the acyl pocket Leu²⁸⁶ and adjacent Phe³²⁹ residues, and Met⁴³⁷ and Tyr⁴⁴⁰ located near the choline binding site. Mutant proteins were produced in microinjected Xenopus oocytes, and K_m values towards butyrylthiocholine and IC₅₀ values for the organophosphates diisopropylfluorophosphonate (DFP), diethoxyphosphinylthiocholine iodide (echothiophate), and tetraisopropylpyrophosphoramide (iso-OMPA) were determined. Substitution of Ser¹⁹⁸ by cysteine and Met⁴³⁷ by aspartate nearly abolished activity, and other mutations of Ser¹⁹⁸ completely abolished it. Tyr⁴⁴⁰ and Leu²⁸⁶ mutants remained active, but with higher K_m and IC₅₀ values. Rates of inhibition by DFP were roughly parallel to IC₅₀ values for several Leu²⁸⁶ mutants. Both K_m and IC₅₀ values increased for Leu²⁸⁶ mutants in the order Asp < Gln < Lys. In contrast, cysteine, leucine, and glutamine mutants of Phe³²⁹ displayed unmodified K_m values toward butyrylthiocholine, but up to 10-fold decreased IC₅₀ values for DFP, iso-OMPA, and echothiophate. These findings add Tyr⁴⁴⁰ and Phe³²⁹ to the list of residues interacting with substrate and ligands, demonstrate plasticity in the active site region of BuChE, and foreshadow the design of recombinant BuChEs with tailored scavenging properties.     

Myxococcus sp.V11海藻糖合酶TreS II分子改造 *

来源于黏细菌Myxococcus sp.V11的海藻糖合酶(trehalose synthase, EC 2.4.1.245)TreS II可通过转糖苷作用将麦芽糖转化成为海藻糖,在酶法生产海藻糖上显示出一定的应用潜力,但TreS II对热敏感,在60℃保温3h,酶活性丧失,限制了其应用范围.目的:拟探索TreS II影响热稳定性的氨基酸残基构成,通过对可能的氨基酸位点进行定点突变,以期获得耐热性的突变子,扩大TreS II应用范围.方法: 通过PCR介导的方法对TreS II可能影响到热稳定性的氨基酸Q3,A283,W374,R449和Y537进行定点突变,以野生型重组酶为对照,比较突变型与野生型的最适反应温度和最适反应pH,通过测定不同温度下保存不同时间后的残留酶活,检测突变子的耐热效果.结果: 研究表明突变子Q3D,A283R,W374D,R449Q和Y537H的比酶活与野生型无显著差异,且最适pH 和最适反应温度也未发生改变;A283R,Y537H在60℃条件下,3h后活性剩余68%;Q3D,W374D,R449Q在温度60℃时,3h后活性剩余35%.结论: TreS II分子结构中与金属离子结合的几个氨基酸残基的改变对蛋白质分子的耐热性具有显著影响.