植物转录因子与DNA互作研究技术

转录通过调控下游基因的时空特异性表达影响植物生长发育。在转录调控机制的解析过程中,转录因子与DNA的相互作用是关键的一环。近年来,研究者利用酵母单杂交(Y1H)和凝胶阻滞迁移率实验(EMSA)检测转录因子能否直接结合DNA;而瞬时表达技术则是一种检测转录因子对下游基因调控作用的便捷方式。该文对Y1H、EMSA和瞬时表达技术的原理、实验方法和相关注意事项进行详细阐述,以期为转录因子与DNA的互作研究提供参考方法。     

转录因子研究方法进展

转录因子是可直接或间接与顺式作用元件相结合,调控靶基因转录效率的一组蛋白质。随着近年来对转录因子关注度的提高,转录因子的研究方法也越来越多,并朝着高灵敏度、高准确性及高通量的方向不断发展。本文主要从转录因子的结构特征及其研究方法两方面进行综述,重点对EMSA、Y1H、双荧光素酶报告基因检测、Ch IP-seq、Ch IP-chip、互作微孔板芯片等技术的基本原理、优缺点和应用进行阐述,以期为后续转录因子的鉴定、功能分析及靶基因研究提供理论和技术上的参考。     

H-NS蛋白对副溶血弧菌hcp1的转录调控

【目的】研究调控子H-NS对副溶血弧菌T6SS1结构蛋白基因hcp1的转录调控机制。【方法】利用Western blot检测Hcp1蛋白在野生株(WT)和hns基因敲除株(Δhns)中表达水平的差异。提取WT和Δhns的总RNA,采用实时定量RT-PCR的方法验证H-NS对hcp1的转录调控关系。进而采用引物延伸实验研究hcp1的转录起始位点,并根据产物的丰度判断H-NS对hcp1的调控关系。PCR扩增hcp1的整个启动子区DNA序列,并纯化His-H-NS蛋白,通过凝胶阻滞实验(EMSA)验证His-H-NS对hcp1启动子区是否具有直接的结合作用。【结果】Western blot和实时定量RT-PCR结果显示H-NS能抑制hcp1的表达;引物延伸结果显示hcp1只有一个转录起始位点T(–62)(翻译起始位点为+1),且其转录活性是H-NS和σ54依赖性的;EMSA实验表明H-NS对hcp1的启动子区具有直接的结合作用。【结论】H-NS能直接结合到hcp1启动子区而抑制其转录表达。     

哺乳动物转录因子DNA结合谱

基因差异表达是生物发育和对刺激作出应答的分子基础,转录因子在这种基因差异表达中发挥着重要的调控作用。因此,要弄清楚转录因子调控基因差异表达的机理,就必须鉴定出它们全部的靶基因并构建其操纵的转录调控网络。对基因组DNA的序列特异性结合是转录因子调控基因转录的关键环节,因此,要鉴定转录因子的靶基因,就必须从它们与DNA相互作用的分子水平,鉴定它们能够识别并结合的全部DNA序列,即转录因子DNA结合谱。近年来随着DNA微阵列芯片和高通量DNA测序技术的产生和快速发展,出现了建立转录因子体内及体外DNA结合谱的一系列革命性的新技术,对该领域的研究带来重大影响。这些新技术主要包括建立转录因子体内DNA结合谱的染色质免疫沉淀-芯片技术(ChIP-chip)和染色质免疫沉淀-测序技术(ChIP-Seq),以及建立转录因子体外DNA结合谱的双链DNA微阵列芯片技术(dsDNA microarray)、指数富集配体系统进化-系列分析基因表达技术(SELEX-SAGE)、结合-n-测序技术(Bind-n-Seq)、多重大规模并行SELEX技术(MMP-SELEX)、凝胶迁移实验-测序技术(EMSA-Seq)和高通量测序-荧光配体互作图谱分析技术(HiTS-FLIP)。文章将对这些新技术做一综述。     

家蚕胚胎中胚胎发育因子基因BmEDFG4结构的验证及其结合蛋白的筛选

【目的】本研究旨在通过寻找家蚕Bombyx mori胚胎发育因子(embryonic development factor, EDF)基因BmEDF G-四链体(G-quadruplex, G4)结构的结合蛋白,进一步探究G4结构调控家蚕胚胎发育的可能作用和机制。【方法】通过圆二色谱(circular dichroism, CD)和凝胶迁移实验(electrophoretic mobility shift assay, EMSA)验证G4序列在体外是否形成G4结构;通过启动子活性实验验证BmEDF启动子区G4结构对BmEDF的表达调控的影响;通过qRT-PCR检测BmEDF在家蚕胚胎发育各时期的表达量变化。通过EMSA联合质谱分析可能与BmEDF的G4结构结合的蛋白,然后将与G4结构结合的2个候选蛋白BmeIF4H和BmADDH分别进行基因克隆、表达和纯化,再通过EMSA实验分别验证候选蛋白BmeIF4H和BmADDH与BmEDF的G4结构结合与否。【结果】CD和EMSA实验都证明BmEDF的G4序列在体外可以形成G4结构。启动子活性实验表明BmEDF G4结构的存在对BmEDF转录表达具有正调控的作用。qRT-PCR结果表明BmEDF在产卵后120 h时表达量显著升高。经原核表达纯化,获得BmeIF4H和BmADDH重组蛋白。EMSA实验表明重组蛋白BmeIF4H在体外与BmEDF的G4结构结合,BmADDH不与BmEDF G4结构结合。【结论】家蚕胚胎中的BmeIF4H蛋白可能与BmEDF的G4结构结合。本研究为解析家蚕胚胎发育的DNA高级结构调控机理提供了实验证据。     

MarR家族转录因子HpaR和XC0449协同调控野油菜黄单胞菌致病性

MarR家族转录因子广泛存在于细菌及古生菌中,并灵活、精细地调控多种毒力、抗胁迫及抗生素相关的生理生化途径。在野油菜黄单胞菌中,MarR家族转录因子HpaR (XC2827)的失活会显著降低细菌对于寄主甘蓝的致病力,同时会导致胞外蛋白酶的过量表达。本研究进一步发现,Xcc 8004基因组一共编码9个MarR家族转录因子。表达并纯化其中的HpaR (XC2827)和XC0449,体外微量热泳动(MST)实验及Pull-down实验证明二者可以在体外特异性结合。同时,表型检测发现XC0449突变会导致细菌致病力显著下降。通过体外凝胶迁移阻滞试验(EMSA)、体内qRT-PCR和GUS检测证明,XC0449和HpaR均作为转录激活子协同调控下游致病相关基因XC0705的表达,最终调控细菌毒力及胞外酶合成。     

应用SELEX技术检测水稻RFL转录因子的DNA结合位点

FLORICAULA/LEAFY是植物特有的转录因子,其可以通过调控下游基因的表达对植物的发育起到调控作用。水稻(Oryza sativa)中的同源基因RFL(Rice FLORICAULA/LEAFY)能够调控多个发育过程,包括开花、叶间期以及枝梗和颖花分化。指数富集配体的系统进化(SELEX)技术已经被广泛应用于体外筛选转录因子的DNA结合位点。应用SELEX技术检测水稻RFL的DNA结合序列,经过7次PCR循环富集过程获得结合特异序列,通过测序和MEME分析,鉴定到RFL的DNA结合序列为(C/A)(C/T)NN(T/C/A)G(G/T)。实验结果为进一步阐明RFL分子功能奠定了基础。     

人SCF基因5′旁侧-1190～- 853 AT富集区功能研究

 已有的报告基因和EMSA实验研究表明 ,人干细胞生长因子 (SCF)基因 5′旁侧AT富集区- 1 1 90～ - 853在HeLa和MCF 7细胞中均能增强下游基因转录 ,可能为一个核基质结合区(MAR) ,对人SCF基因的转录发挥调控作用 .为进一步研究该AT富集区的功能 ,将人SCF基因 5′旁侧 - 1 1 90～ - 853AT富集区分别克隆入SV40或CMV启动子前后紧接着CAT报告基因 ,瞬时转染Jurkat,HepG2和 3T3细胞 ,检测CAT报告基因的瞬时表达活性 .结果表明 :人SCF基因 5′旁侧- 1 1 90～ - 853AT富集区在Jurkat和HepG2细胞中 ,对分别由SV40和CMV启动子引导的CAT基因表达均有抑制作用 ;但在 3T3细胞中对SV40启动子的转录活性表现出增强作用 ,对CMV启动子的转录活性无明显影响 .这些结果提示 ,人SCF基因 5′旁侧 - 1 1 90～ - 853AT富集区转录调控具有组织细胞特异性 ,在不同的细胞中可能发挥转录增强或抑制作用     

苏云金芽胞杆菌Sigma H对芽胞形成的影响

【目的】检测苏云金芽胞杆菌HD73中的转录调控因子Sigma H(σ~H)对spo0A基因转录的调控作用;异源表达纯化Sigma H蛋白,验证其对spo0A基因启动子的直接结合;检测sigH基因的缺失对苏云金芽胞杆菌HD73芽胞形成和晶体蛋白产生的影响。【方法】通过测定spo0A基因启动子指导的β-半乳糖苷酶活性评价spo0A基因在苏云金芽胞杆菌HD73野生型和sigH缺失突变体中的转录水平;通过PCR扩增苏云金芽胞杆菌HD73的sigH基因并插入到表达载体pET21b上,将质粒转入到表达菌株BL21(DE3)中,得到重组菌株BL21 (pETsigH);利用镍柱亲和纯化和阴离子交换纯化得到纯化的Sigma H蛋白;通过凝胶迁移实验(electrophoretic mobility shift assay,EMSA)验证Sigma H蛋白与spo0A基因启动子的直接结合;通过显微镜观察、活芽胞计数的方法对突变株HDΔsigH进行表型特征分析。【结果】sigH缺失后,spo0A基因转录活性降低;在大肠杆菌中正确表达并纯化出大小约为28kDa的Sigma H-His蛋白;EMSA结果表明纯化后的Sigma H-His蛋白可与spo0A基因启动子结合;镜检和活芽胞计数结果表明突变株HDΔsigH无法产生芽胞和蛋白晶体。【结论】Sigma H蛋白通过与spo0A基因启动子结合直接调控spo0A基因的表达且sigH基因的缺失阻断了苏云金芽胞杆菌中芽胞和晶体蛋白的产生。     

NFY和RFX1对人PNRC启动子的调控作用

探讨核因子Y（nuclear factor Y, NFY）和调节因子X1（regulatory factors that bind to the X box, RFX1）对人PNRC（proline rich nuclear receptor coactivator）基因的调控作用及机制.根据凝胶电泳迁移率变化实验,分析NFY和RFX1与PNRC启动子区域的结合.将含有NFY和RFX1的真核表达质粒(pCMV-NFY, pCMV-RFX1)和含有PNRC启动子的荧光素酶报告基因质粒共转染HepG2细胞,检测转染细胞的荧光素酶活性,并用RT-PCR和Western印迹检测PNR的表达情况.Quick-Change法对PNRC启动子区NFY和RFX1结合位点进行突变,将包含突变点的重组荧光素酶报告质粒与含有NFY和RFX1的真核表达质粒共同转染HepG2细胞,检测各组荧光素酶活性.结果发现,NFY和RFX1能与PNRC启动子区域特异性结合;转染pCMV-NFY和pCMV-RFX1可抑制PNRC启动子活性并下调PNRC在HepG2细胞中的表达;包含NFY和RFX1结合位点的突变质粒与pCMV-NFY和pCMV-RFX1共转染后,NFY和RFX1对PNRC启动子活性的抑制作用消失. 以上结果提示,NFY和RFX1能调控PNRC基因的表达,其机制是与PNRC启动子区域的特异性结合位点相结合,发挥其反式抑制作用.     

凝血因子FXIII A链基因第1内含子内顺式调节元件的鉴定

探讨FⅩⅢ A基因表达的分子机制.凝胶阻滞实验（EMSA）结果证明,FⅩⅢ A基因第1内含子5′区的前12碱基与转录因子结合并由此调控基因表达.FⅩⅢ A基因第1内含子第12位碱基由C突变为A(内含子1 (+12)C→A)导致与转录因子结合能力降低.构建不同的荧光素酶表达质粒Luc 1、Luc 2、Luc 3、Luc 4、Luc 5、Luc 6,并转染U937细胞和HepG2细胞.结果显示,如果Luc 5（具有最高表达活性）的内含子1(+12)由C突变为A,启动子活性显著降低.与Luc 5相比,突变后的Luc 5的活性分别下降了52.9％（U937, P＜0.01）和47.6％（HepG2, P＜0.01）.将Luc 5与PN3 Sp1共同转染U937细胞和HepG2细胞后,Luc 5的荧光素酶活性分别提高了42.4％（U937,与Luc 5单独转染比较P＜0.01）和54.9％（HepG2, 与Luc 5单独转染比较P＜0.01）,而突变后的Luc 5（Mut）与PN3 Sp1共同转染则没有明显的改变.表明转录因子Sp1在FⅩⅢ A基因表达的重要性.这些结果也表明,内含子在FⅩⅢ A基因表达过程中起重要作用,为遗传性凝血因子发病机理的研究提供了新的证据.