利用DNS法快速分析及优化柚皮苷的酶解过程

【目的】建立采用3,5-二硝基水杨酸(DNS)法快速测定柚皮苷水解率的方法,并利用该方法对柚苷酶催化水解柚皮苷生成柚皮素的反应过程进行优化研究。【方法】利用棘孢曲霉JMUdb058发酵得到的柚苷酶催化水解柚皮苷,采用DNS法对柚皮苷酶解过程中还原糖的生成量进行分析,经过换算得到柚皮苷的水解率,并在此基础上通过单因素实验优化柚皮苷的酶解过程。【结果】在柚皮苷的水解过程中,还原糖的生成量与柚皮苷的水解量及柚皮素的生成量均呈现出良好的线性关系,因此可利用DNS法测定体系中还原糖的生成量,并通过换算得到柚皮素的生成量。利用该方法优化柚皮苷的酶解过程得到柚苷酶转化柚皮苷的最适温度为50°C、pH为5.0、酶用量为8 U/mL、底物浓度为0.2 g/100 mL。在此条件下,柚皮苷酶解150 min后可达到平衡,此时其水解率为85%。通过Lineweaver-Burk双倒数作图法测得Km为     

一株产柚苷酶的罗伦隐球酵母的鉴定及柚苷酶表达

【目的】对一株新分离的、产生柚苷酶的疑似酵母菌株Jmudeb008进行鉴定,确定其分类的种属关系,阐明葡萄糖对该菌株表达柚苷酶的影响。【方法】利用形态观察、核酸分析及生理生化实验对Jmudeb008进行种属鉴定;用含有0.5g/L柚皮苷及不同浓度葡萄糖的培养基培养Jmudeb008,通过检测培养过程柚皮苷、柚皮素及葡萄糖浓度的变化研究葡萄糖对Jmudeb008表达柚苷酶的影响。【结果】Jmudeb008的菌落形态及个体形态都与典型的酵母相似,其26SrDNAD1/D2区域和5.8SrDNA-ITS区域的序列与罗伦隐球酵母(Cryptococcus laurentii)的同源性为99%,葡萄糖发酵试验阴性,尿酶试验阳性,重氮基蓝B试验阳性、硝酸盐还原试验阴性符合该菌种特性,因此鉴定为罗伦隐球酵母。Jmudeb008在以柚皮苷为唯一碳源的培养基中或当培养基中葡萄糖消耗完以后会分泌柚苷酶,而有葡萄糖存在时不分泌柚苷酶。【结论】分离得到了能产柚苷酶的罗伦隐球酵母,该酵母产柚苷酶受葡萄糖分解代谢调节。     

沼泽红假单胞菌粗酶液生物转化柚皮苷

目的初步探索沼泽红假单胞菌粗酶液生物转化柚皮苷的特点。方法利用高效液相色谱技术,以柚皮苷的降解率为指标,考察不同温度、pH、底物浓度和培养时间对粗酶液降解柚皮苷的影响。在适宜转化条件下,探索底物和产物的含量变化。结果最适转化条件:40℃~50℃,pH 7.0~8.0,最大有效转化底物浓度750μg/mL,15 h时柚皮苷降解率较高为55.31%。在最适转化条件下,底物浓度500μg/mL,培养至17 h柚皮苷被降解完全,柚皮素浓度达到最大值204μg/mL,转化率为85.39%;10~19 h,转化率均大于80.00%,13 h达到最大值94.83%。结论本研究首次发现沼泽红假单胞菌粗酶液能够生物转化柚皮苷,并阐明了不同培养条件对柚皮苷降解的影响,以及转化过程中物质含量的变化。     

一株棘孢曲霉的鉴定及其柚苷酶合成规律

【目的】对一株新分离的柚苷酶产生菌株JMUdb058进行鉴定,并研究该菌株柚苷酶合成的基本规律。【方法】利用形态观察、28S rDNA序列分析对JMUdb058进行鉴定;通过反相高效液相色谱测定JMUdb058粗酶液对柚皮苷的水解作用,鉴定其柚苷酶活性;分别用11种碳源和6种氮源进行摇瓶发酵,研究碳源、氮源对该菌株分泌柚苷酶的影响;在固态和液态条件下分别进行发酵,测定该菌株合成柚苷酶的能力。【结果】菌株JMUdb058的菌落形态和显微形态符合曲霉属黑色组的典型形态特征,其28S rDNA序列与棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)的相似度达100%;用液态和固态两种发酵方法制得的粗酶液均可将标准溶液中的柚皮苷水解产生普鲁宁和柚皮素,还可有效地水解琯溪蜜柚汁中的柚皮苷;用橘皮苷、柚皮苷、芸香苷和鼠李糖为碳源,胰蛋白胨和豆饼粉等有机物为氮源时可分泌柚苷酶;该菌种在固态发酵中表现出很强的柚苷酶发酵能力,用HPLC法测定的α-L-鼠李糖苷酶和柚苷酶活力分别达到5903和1939 U/gds,用Davis法测定的柚苷酶活力达到72232 U/gds。【结论】本研究首次发现棘孢曲霉能够分泌柚苷酶,含鼠李糖基团的物质可作为其产柚苷酶的诱导物。棘孢曲霉JMUdb058固态发酵产柚苷酶的能力突出,是一种高产柚苷酶的微生物新资源。     

柚皮中的有效成分对人子宫颈癌Hela细胞增殖及凋亡的影响

目的探讨柚皮素或柚皮苷对人子宫颈癌Hela细胞增殖及凋亡的影响。方法柚皮素或柚皮苷(0.250、0.125、0.063g/L)作用于人子宫颈癌Hela细胞后,MTT比色法检测Hela细胞增殖活性和半数抑制浓度(half maximal inhibitory concentration,IC50);流式细胞术检测柚皮素对Hela细胞凋亡的影响。结果柚皮素能抑制Hela细胞增殖,且呈剂量和时间依赖性,24、48和72hIC50值分别为0.24、0.11和0.07g/L;柚皮苷无抑制Hela细胞增殖的作用。柚皮素组(0.22g/L、0.11g/L、0.05g/L,作用48h)人子宫颈癌Hela细胞凋亡率高于对照组,差异有统计学意义(P=0.000239681,P=0.00012746,P=5.09328E-05,P0.01)。结论柚皮中黄酮类提取物具有抑制人子宫颈癌Hela细胞增殖作用,其中柚皮素作用明显,部分作用机制与诱导肿瘤细胞凋亡有关。柚皮苷无抗人子宫颈癌作用。     

兔肠道大豆异黄酮还原菌株的分离鉴定及其转化特性

【目的】从兔新鲜粪样中分离对大豆异黄酮黄豆苷原和染料木素具有转化作用的特定细菌菌株。【方法】在厌氧工作站内对獭兔新鲜粪样进行梯度稀释后涂板,挑取单菌落与底物黄豆苷原和染料木素分别厌氧混合培养,用高效液相色谱检测底物被转化情况。【结果】分离得到一株对大豆异黄酮黄豆苷原和染料木素均具有转化作用的革兰氏阳性严格厌氧细菌菌株AUH-JLR41(KJ188150)。根据产物的高效液相保留时间、紫外吸收图谱和质谱分析结果,将菌株AUH-JLR41代谢底物黄豆苷原和染料木素生成的产物分别鉴定为二氢黄豆苷原和二氢染料木素。经手性高效液相系统检测,产物二氢黄豆苷原和二氢染料木素均呈现两个等面积物质峰,表明这两个产物的对映体过量率均为0。通过转化动态研究发现,菌株AUH-JLR41分别在底物黄豆苷原和染料木素加入48 h和72 h后将底物全部转化为产物,该菌株能转化底物黄豆苷原和染料木素的最大浓度均为0.6 mmol/L。经BLAST比对,菌株AUH-JLR41的16S r RNA基因序列与斯奈克氏菌属菌株Slackia equolifaciens DZE(EU377663)的相似性高达99.6%。【结论】兔肠道分离的斯奈克氏菌属菌株Slackia sp.AUH-JLR41在厌氧条件下能将大豆异黄酮黄豆苷原和染料木素分别还原为二氢黄豆苷原和二氢染料木素。     

一株柚皮苷羟基化真菌的筛选及鉴定

柚皮苷是中草药枳实、橘红的主要有效成分,用于心血管疾病的防治。为了开发生物法生产柚皮苷的羟基化衍生物,从土壤中分离筛选到一株能转化柚皮苷为3’-羟基柚皮苷和3’,5’-二羟基柚皮苷的真菌菌株NT-02。通过对菌株NT-02的形态学观察和ITS序列系统发育分析,构建了系统发育树,NT-02菌株与哈茨木霉（Trichoderma harzianum／Hypocreaum lixii）形成一个类群,且有99％的同源性,初步鉴定真菌NT-02为木霉属（Trichoderma）菌株。     

棘孢曲霉固态发酵柚皮产柚苷酶的条件优化

【目的】以柚皮为原料,优化棘孢曲霉利用柑橘加工副产物固态发酵柚苷酶的条件。【方法】采用高效液相色谱法检测酶活力,通过单因素试验考察固水比、装样量、接种量、温度对柚苷酶发酵的影响,用正交试验优化发酵条件。【结果】单因素试验结果的显著性分析表明培养基的固水比、装样量和培养温度对柚苷酶产量有显著性影响,而接种量影响不显著;经正交试验确定的优化条件是：固水比1:1 (质量体积比),装样量5 g/250 mL三角瓶,温度为30 °C,接种1 mL孢子悬浮液,发酵8 d。在此优化条件下,柚苷酶酶活力为8.19 IU/g干物质,比初始培养基产柚苷酶活力提高7.38倍。【结论】通过对固水比、装样量和发酵温度进行优化,大幅度提高了棘孢曲霉固态发酵柑橘加工副产物的柚苷酶产量,为柚苷酶的生产提供了一种高产发酵工艺。     

HPLC法测定牙膏中柚皮苷的含量

建立了高效液相色谱测定牙膏中柚皮苷含量的方法。采用的色谱条件:Hypersil BDS C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5μm);柱温为40℃;以水(A相)和乙腈(B相),梯度洗脱程序为:0～15 min,10%～100%B;流速为1.0 mL/min;检测波长为283 nm;进样量为20μL。结果表明,柚皮苷的质量浓度在14.55～116.40μg/mL范围内与峰面积呈良好的线性关系(r=0.9999),平均加标回收率为97.56%。该方法稳定、准确,重现性好,可作为牙膏中柚皮苷的含量测定和质量控制方法。     

牛瘤胃分离菌株静息细胞培养体系生物转化黄豆苷原

从牛瘤胃胃液中分离了一株在厌氧条件下能利用其生长细胞将大豆异黄酮黄豆苷原高效还原为二氢黄豆苷原的革兰氏阳性细菌菌株Niu-O16。研究了菌株Niu-O16静息细胞体系转化黄豆苷原的最佳转化条件,通过单因素试验确定菌株Niu-O16静息细胞转化黄豆苷原的最佳条件是:初始pH6.0～8.0,静息细胞浓度32～64mg/mL(湿重),加入底物浓度0.8～1.2mmol/L。通过正交试验确定了静息细胞浓度、加入底物浓度及转化时间的最佳组合为:静息细胞浓度32mg/mL、加入底物浓度0.8mmol/L、转化时间24h;最佳转化条件下底物转化率最高为63.9%。该结果为厌氧菌的静息细胞转化及工业应用提供了参考。     

Screening and identification of a fungal strain affecting hydroxylation of naringin

柚皮苷是中草药枳实、橘红的主要有效成分,用于心血管疾病的防治.为了开发生物法生产柚皮苷的羟基化衍生物,从土壤中分离筛选到一株能转化柚皮苷为3'-羟基柚皮苷和3',5'-二羟基柚皮苷的真菌菌株NT-02.通过对菌株NT-02的形态学观察和ITS序列系统发育分析,构建了系统发育树,NT-02菌株与哈茨木霉(Trichoderma harzianum/Hypocreaum lixii)形成一个类群,且有99％的同源性,初步鉴定真菌NT-02为木霉属(Trichoderma)菌株.     

产柚苷酶菌株B04的分离及产酶特性研究

柚苷酶作为金柚和柑桔果实中主要苦味物质的分解酶有望在深加工生产中得到应用。本研究在金柚树林下土壤和金柚皮腐烂液中分离得到产柚苷酶菌株。研究证明采用添加低浓度蔗糖作为碳源的高层试管法是可行的初筛方法;复筛得到菌株B04,产酶需要诱导,酶底物柚苷和产物鼠李糖均有诱导作用,其中柚苷诱导作用更好,而且添加量为0.02%时菌株产酶能力较强;B04发酵类型为非生长偶联型,30℃,175r/min旋转摇床培养,60h菌体量最大,96h酶活力最高,达到342U/mL。     

经典名方温胆汤物质基准总黄酮、柚皮苷和新橙皮苷含量测定

目的：研究并建立紫外分光光度法（UV）和高效液相色谱法（HPLC）分别测定温胆汤物质基准中总黄酮、柚皮苷和新橙皮苷含量。方法：以柚皮苷为对照品，采用紫外-可见分光光度法测定总黄酮的含量并采用HPLC法测定柚皮苷和新橙皮苷的含量。结果：采用直接测定法测定总黄酮类成分在284 nm处有较强吸收，柚皮苷在20.22～80.88μg/mL范围内与吸光度呈良好的线性关系，平均加样回收率为98.33%。柚皮苷和新橙皮苷分别在0.01～0.51 mg/mL和0.01～0.50 mg/mL范围内有良好的线性关系，精密度、稳定性、重复性的RSD均小于5.0%，加样回收率分别为97.11%和102.72%；温胆汤物质基准中总黄酮的平均含量为15.03%，柚皮苷、新橙皮苷的平均含量分别为22.78 mg/g和9.75 mg/g。结论：建立的温胆汤物质基准总黄酮、柚皮苷和新橙皮苷含量测定方法简单、稳定、重复性好，为温胆汤及其相关制剂进一步研究和开发提供实验基础。     

兼性肠球菌Enterococcus hirae AUH-HM195对黄豆苷原的开环转化

摘要：【目的】从褐马鸡粪样中分离对大豆异黄酮黄豆苷原具有转化作用的功能微生物菌株。【方法】在厌氧工作站内对褐马鸡新鲜粪样进行梯度稀释后涂板,从板上挑取单菌落与底物黄豆苷原厌氧混合培养,用高效液相色谱检测底物被转化情况。【结果】分离出一株对黄豆苷原具开环转化作用的革兰氏阳性兼性好氧菌株AUH-HM195（EU919863）,经BLAST比对,该菌株的16S rDNA基因全序与肠球菌属菌株Enterococcus hirae (DSM20160) 的相似性为100%。根据保留时间、代谢产物最大紫外吸图谱以及核     

棘孢曲霉固态发酵柚皮产柚苷酶及其在柑橘果汁脱苦中的应用

为了建立柚皮固态发酵产柚苷酶的工艺以及阐明其柚苷酶的应用价值,利用棘孢曲霉Aspergillus aculeatus JMUdb058对柚皮进行固态发酵,并研究其产酶特性。采用高效液相色谱法检测酶活力,通过单因素实验方法研究豆饼粉及培养基灭菌对柚苷酶发酵的影响;采用酶活力、还原糖以及生物量的变化解析发酵的动态规律;采用柚皮苷的水解活性表征柚苷酶对柑橘果汁的脱苦效果。结果表明,棘孢曲霉JMUdb058固态发酵柚皮可产生柚苷酶,额外添加豆饼粉可大幅度提高其柚苷酶活力;对培养基进行121℃20min的灭菌将导致柚苷酶活力急剧下降;当培养基组成为5g柚皮粉、0.75g豆饼粉、5.75mL蒸馏水,经30℃发酵8d时,柚苷酶和α-L-鼠李糖苷酶活力分别达到5.81IU/gds和6.08IU/gds;通过对产酶进行动力学拟合,发现柚苷酶和α-L-鼠李糖苷酶主要在棘孢曲霉的对数生长期内合成,它们的积累属于生长关联型;该柚苷酶可高效水解柚汁中的柚皮苷,柚皮苷去除率高达99.6%。因此,柚皮是固态发酵柚苷酶的良好原料,用棘孢曲霉对柚皮进行固态发酵是生产柚苷酶的有效方法。     

柚苷酶产生菌的选育及发酵条件研究

根据柚皮苷的物理及化学特性,设计和试验了一种新的柚苷酶产生菌筛选模型。在１５３株曲霉中筛选到一株产柚苷酶菌株ＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒＺＧ８４,摇瓶发酵酶活力为３２０ｕ／ｍｌ。经自然分离和ＤＥＳ诱变处理,得到ＺＧ８６菌株,酶活力达１１２４ｕ／ｍｌ。对其培养条件和产酶条件进行了研究。     

不同动物肠道优势需氧菌对黄豆苷原转化菌株转化能力的影响

摘要: 【目的】探讨不同动物肠道优势需氧菌对黄豆苷原转化菌株转化能力的影响。【方法】有氧条件下,采用稀释涂布法分别从ICR 小鼠、芦花鸡、长白猪和獭兔等4 种健康动物肠道中分离优势需氧菌,将不同动物的优势需氧菌分别与不同类型黄豆苷原转化菌株进行厌氧混合培养,高效液相色谱检测培养液中黄豆苷原的转化情况。【结果】16S rRNA 基因序列分析,结合形态学及相关理化特性分析表明,分离的22 株优势需氧菌分属埃希氏菌属(10 株) 、变形菌属(5 株) 、肠球菌属(4 株) 、芽胞杆菌属(2 株) 和假单胞菌属(     

柚皮素通过Notch1/Hes1通路抑制肺癌干细胞增殖、迁移和分化

为探讨柚皮素对肺癌干细胞增殖、迁移和分化的分子机制,本研究应用免疫磁珠法分选肺癌干细胞(A549-CSCs),并通过流式细胞术进行表面分子的鉴定;通过CCK8法检测不同浓度的柚皮素(25μg/m L,50μg/mL, 100μg/mL)对肺癌干细胞(A549-CSCs)活力的影响,Transwell检测柚皮素对A549-CSCs细胞迁移能力的影响,Q-PCR检测柚皮素对肺癌干细胞分化相关因子Sox2和Oct4 m RNA表达的影响,Western blotting法检测柚皮素对细胞内Notch1和Hes1蛋白表达的影响。流式细胞术检测结果显示,A549-CSCs细胞表面分子CD133呈阳性表达,符合肺癌干细胞特征。CCK8结果显示,与对照组(control)比较,25μg/m L、50μg/mL、100μg/mL柚皮素处理A549-CSCs 24 h,细胞活力显著降低(p<0.05);Transwell检测结果显示,与对照组比较,不同浓度柚皮素处理组A549-CSCs迁移能力显著降低(p<0.05);定量PCR (real-time polymerase chain reaction, Q-PCR)结果显示,与对照组比较,柚皮素处理组细胞Sox2和Oct4 m RNA表达水平显著降低(p<0.05);蛋白质印迹法(Western blotting)结果显示,与对照组相比柚皮素处理组细胞Notch1和Hes1蛋白表达水平均降低。本研究发现柚皮素可能通过抑制Notch1/Hes1通路抑制肺癌干细胞增殖、迁移和分化。这为柚皮素治疗肺癌提供临床依据。     

合成8二甲基异戊烯基柚皮素的人工酿酒酵母菌株构建

8二甲基异戊烯基柚皮素(8DN)作为生产黄酮类药物淫羊藿苷的重要前体,在医药合成领域具有重大应用潜力。由于其合成路径及相关基因的复杂性,目前主要通过饲喂8DN的直接前体(柚皮素、异黄腐酚等)的方式合成8DN,而在生物体内全合成8DN的研究工作还未见报道。为了实现8DN在酿酒酵母体内的生物全合成,通过组合筛选8DN前体物柚皮素合成所需的多种外源基因(TAL、4CL、CHS、CHI),获得30株柚皮素生产菌,发现不同来源的基因组合使柚皮素产量的具有明显差异(0.37~22.33mg/L)。并且利用Delta位点将较优的基因组合整合至酵母基因组,实现了稳定的柚皮素高产菌株(Sy BE_Sc02050031)构建。在此基础上进一步导入带有苦参来源的异戊烯基转移酶基因(N8DT)多拷贝质粒,实现8DN合成的完整反应过程,8DN的摇瓶发酵产量达到36.7μg/L。另外,通过关键限速酶N8DT的序列优化策略,发现截断定位信号肽序列的N8DT明显提高了从柚皮素到8DN这一关键反应的催化效果,8DN的产量提高到52.6μg/L(144.2%)。首次在酿酒酵母中成功构建高产8DN的生物全合成路径,为在微生物体内合成其他黄酮类天然产物提供了参考,具有重要的指导意义。     

渤海沉积物产脂肪酶细菌的筛选及其多样性分析

【目的】从渤海沉积物中分离筛选产脂肪酶细菌,分析其物种多样性,增加人们对渤海生态系统中产脂肪酶菌多样性的认识,获取高效产脂肪酶菌株,为海洋产脂肪酶微生物的挖掘提供菌群资源。【方法】分别将8个渤海沉积物样品梯度稀释涂布至吐温-80筛选平板和三丁酸甘油酯筛选平板,选择性分离产脂肪酶细菌;分析基于16SrRNA基因序列的系统发育关系,揭示这些细菌的分类地位和遗传多样性;利用对硝基苯酚法测定胞外脂肪酶活性,筛选出高效产脂肪酶菌株。【结果】从8个渤海沉积物样品中分离获得51株产脂肪酶细菌,这些菌株隶属于Bacteroidetes、Proteobacteria和Firmicutes三个门的8个属,其中Pseudoalteromonas(35.2%)、Marinobacter(23.5%)和Sulfitobacter(17.6%)是优势菌群;脂肪酶酶活性实验表明所有测定菌株都能够分泌脂肪酶,菌株70623分泌的脂肪酶酶活最高,为42.4 U/m L。【结论】渤海沉积物中可培养产脂肪酶细菌类群较为丰富,Pseudoalteromonas、Marinobacter和Sulfitobacter菌株是优势菌群,测定菌株所产胞外脂肪酶能力不同,获得了一株高效产脂肪酶菌株Marinobacter sp.70623。