传染性法氏囊病病毒非结构蛋白VP5的原核表达及多克隆抗体的制备

利用PCR技术,从传染性法氏囊病病毒（IBDV）Gx,Gt毒株中分别扩增出VP5基因,将其克隆到表达载体pET30a、pET28a中。经PCR、酶切和序列分析鉴定获得重组质粒命名为pET28a-GtVP5、pET30a-GxVP5。将pET30a-GxVP5、pET28a-GtVP5分别转化宿主菌BL21(DE3),在IPTG诱导下均成功表达约24 kDa的Gx-VP5及23kDa的Gt-VP5融合蛋白,并都以包涵体形式存在。将Gx-VP5纯化后的蛋白免疫8周龄BALB/c雌鼠,ELISA分析表明制备的抗血清效价在1:25600以上,Western blot分析VP5表达产物能与抗6×His mAb及抗IBDV多克隆抗血清发生反应,具有良好的免疫反应特异性。     

抗传染性法氏囊病病毒VP5蛋白单克隆抗体的制备与初步应用

原核表达的IBDVGx-VP5蛋白经纯化后免疫8周龄的BALB/c雌性小鼠,三次基础免疫后,融合前加强免疫,取脾细胞在PEG(MW1500)的作用下与SP2/0小鼠骨髓瘤细胞融合,经过三次亚克隆筛选,获得稳定分泌抗VP5蛋白的杂交瘤细胞,分别命名为4B4、6D12、3E8,以三株杂交瘤细胞制备的腹水ELISA效价分别为5×104、3.5×104、3×104,特异性实验表明三株单抗能与IBDVGt株反应。以单抗介导的间接免疫荧光检测表达Gt-VP5的VeroE6细胞,可以见到特异的荧光,能做为特异性的检测VP5蛋白的工具,为今后IBDVVP5蛋白的研究打下基础。     

传染性法氏囊病病毒多聚蛋白基因在家蚕中的表达

将传染性法氏囊病病毒(IBDV)细胞致弱株(JD1株)的基因组A节段基因重组于家蚕杆状病毒转移载体pAcHLT-C中,获得的重组转移载体pAcHLT-C-A与线性化病毒Bm-BacPAK6 DNA共转染家蚕培养细胞,获得重组病毒BacPAK-A。DIG标记的DNA点杂交证实重组病毒基因组中含有A节段基因,重组病毒感染家蚕5龄幼虫进行表达, ELISA和Western blotting等结果表明多聚蛋白基因在蚕体内得到了表达,表达产物具有免疫反应性,表达量在感染后5～6 d达到最高。家蚕生物反应器表达IBDV多聚蛋白具有我国的资源优势,为今后研制低成本、实用化的IBDV基因工程疫苗打下基础。     

鸡传染性法氏囊病病毒非结构蛋白基因的克隆、表达及多克隆抗体制备

利用RT-PCR技术从传染性法氏囊病病毒(IBDV)TL2004株感染鸡胚尿囊液中扩增到VP5基因,进而构建了T7启动子控制下的N端GST-Tag融合表达质粒pGEX-VP5。序列测定表明VP5基因全长438bp,编码一个由145个氨基酸组成的VP5蛋白。将pGEX-VP5转化大肠杆菌BL21,在IPTG的诱导下高效表达了GST-VP5融合蛋白(44kD)。通过包涵体纯化的方法,获得的较高纯度的融合蛋白,免疫新西兰兔,Western blot和ELISA分析表明,制备的融合蛋白抗血清效价在1∶12800以上,并具有良好的免疫反应特异性,为进一步研究VP5在IBDV复制与致病中的作用,以及研制IBDVVP5基因缺失疫苗打下了良好的基础。     

鸡传染性法氏囊病病毒研究进展

传染性法氏囊病(Infection bursal disease, IBD)是由鸡传染性法氏囊病毒(Infectious bursal disease virus, IBDV)引起的鸡和火鸡的一种高度接触性传染病,给世界各国的禽养殖业带来了巨大损失。自IBDV发现至今新的变异株不断出现,分子结构的改变导致病毒致病力的改变及宿主对疫苗应答的改变,使得传统的疫苗已不能控制其流行,因此各国学者对其基因组结构和功能进行了广泛深入的研究,并积极研制新型有效的疫苗以达到防治的目的。 1 基因组结构和功能 IBDV基因组由A(3.2kb)、B(2.8kb)两个双链RNA节段构成。A编码形成VP2蛋白(37-40k…     

传染性法氏囊病病毒CJ－801bkf毒株VP2 cDNA基因结构的分析

以传染性法氏囊病病毒（ＩＢＤＮ）中国毒株ＣＪ－８０１ｂｋｆ的基因组Ａ片段ｄｓＲＭＡ为模板,经反向转录和ＰＣＲ扩增,克隆了保护性抗原ＶＰ２ｃＤＮＡ基因。经Ｓａｎｇｅｒ法测序,确定了ＶＰ２ｃＤＮＡ基因有１４８４个核苷酸,推测了ＶＰ２氨基酸的顺序,与已报导的６株ＩＢＤＶ毒株ＣｕＩ、ＰＢＧ９８、５２／７０、００２－７３、ＳＴＣ和ＶａｒｉａｎｔＥ的ＶＰ２区做了比较,证明：克隆的ＣＪ－８０１ｂｋｆＶＰ２ｃＤＮＡ基因是全长的,含有正确的起始密码子ＡＴＧ;ＣＪ－８０１ｂｋｆ与毒株Ｃｕｌ和ｐＢＧ９８同源性最高;ＣＪ－８０１ｂｋｆＶＰ２高可变区内两个亲水区的氨基酸顺序与ＣｕＩ、ＰＢＧ９８、５２／７０、００２－７３和ＳＴＣ完全相同;７肽区内第三个丝氨酸残基则变异为精氨酸。这些结果提示,中国ＣＪ－８０１ｂｋｆ毒株应属标准血清Ｉ型ＩＢＤＶ弱毒株。     

传染性法氏囊病病毒分子生物学研究进展

传染性法氏囊病病毒(Infectious bursal disense virus,IBDV)是引起鸡的最严重的传染病之一,给养鸡业造成了巨大的经济损失,其危害除了直接引起临床症状外,更为重要的是破坏机体的免疫器官,主要是破坏B淋巴细胞前体,引起严重的免疫抑制,使鸡对其他病原的免疫力丧失,结果导致死亡。 IBDV最初被认为是呼肠孤病毒科的成员,主要是因为其在鸡胚肾细胞上培养出现     

鸡传染性法氏囊病病毒Gt株VP5基因缺失株感染性克隆的构建

传染性法氏囊病病毒 (IBDV)是双链,双节段RNA病毒,其基因组由A、B两个节段组成,编码结构蛋白VP1-VP4和非结构蛋白VP5。【目的】利用反向遗传操作构建拯救VP5基因缺失重组IBDV。【方法】利用体外定点突变技术,缺失IBDV Gt株VP5基因,通过多重PCR在基因组两端分别引入锤头状核酶序列(HamRz)和丁肝病毒核酶序列(HdvRz)。将带有核酶序列的IBDV基因组插入载体pCAGG的b肌动蛋白启动子下游,构建了IBDV感染性克隆pCAGGmGtA △VP5HRT,将该感染性克隆与pCAGGmGtBHRT共转染DFⅠ细胞。【结果】RT-PCR和间接免疫荧光均显示获得重组病毒,将其命名为rmGtA △VP5。IBDV VP5基因缺失感染性克隆的成功构建为从分子水平上深入研究vp5基因功能奠定了基础。     

法氏囊病病毒vp2基因在酵母中的分泌表达及鉴定

应用Pichia酵母表达系统高效分泌表达了传染性传染性法氏囊病病毒vp2基因片段。首先用Primer5．0设计1对引物P1、P2,以插入IBDV vp2基因的PMDl8-T-VP2载体为模板,扩增出带有终止密码子的1.4kb片段,将此片段正向亚克隆到酵母表达载体pPICZα-A上,将构建好的重组载体pPICZα-A-VP2用Sac Ⅰ内切酶线性化后,电击转化整合入Pichia PastorisX-33酵母菌,经高浓度Zeocin^TM筛选、表型鉴定、诱导表达及表达产物的鉴定,得到高效表达vp2基因的酵母工程菌X-33／pPICZα-A-VP2。工程菌72h培养上清的SDS-PAGE电泳与免疫印迹结果显示,vp2基因表达产物大小约为55kDa,比预期的41kDa大。凝胶薄层扫描结合Bradford蛋白质总含量测定结果表明,表达产物占工程菌培养上清总蛋白的28％,表达量可达23mg／L。间接ELISA结果表明重组表达产物能够有效地区分法氏囊病病毒标准阳性与阴性血清。     

抗鸡白细胞介素4单克隆抗体的制备及鉴定

为了制备鸡白细胞介素4(chIL-4)单克隆抗体,将成熟的chIL-4基因亚克隆至原核表达载体pET-28a和pGEX-6P-1上,然后在大肠杆菌中分别诱导重组蛋白His-chIL-4和GST-chIL-4的表达,并纯化。将纯化后的His-chIL-4作为免疫原免疫BALB/c小鼠,经4次免疫后,取小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞(SP2/0)融合。将纯化后的GST-chIL-4作为筛选抗原,利用间接ELISA筛选阳性克隆。阳性细胞株经3次亚克隆后,获得3株稳定分泌抗chIL-4蛋白的杂交瘤细胞株,分别命名为1G11-3B、2E5-3D和1G11-5H。经ELISA检测,3株单克隆抗体的亚型均为IgG1,亲和力解离常数(Kd)分别为1.79×10~(–9)、1.61×10~(–9)和2.36×10~(–9)。经Western blotting及间接免疫荧光试验鉴定,3株单克隆抗体均能特异性识别原核和真核表达的chIL-4蛋白。Western blotting试验证明1G11-3B、2E5-3D和1G11-5H识别的抗原表位区域分别为chIL-4蛋白N端的第1–40、80–112和40–80位氨基酸。该单克隆抗体的制备为chIL-4的检测和生物学功能研究奠定了基础。     

枯草芽孢杆菌fmbJ产生的新型抗微生物物质体外抗NDV和IBDV的活性分析

测定了枯草芽孢杆菌fmbJ株产生的新型抗微生物物质的体外抗新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)lasota株、传染性法式囊病病毒(Infectious Bursal Disease Virus,IBDV)哈尔滨(H)株作用。结果表明该新型抗微生物物质对鸡胚成纤维(Chicken Embryo Fibroblasts,CEF)细胞的TD50和TD0分别为128.95mg/L、25.79mg/L;对NDVlasota株、IBDV H株所致细胞病变效应有明显的抑制作用,可使细胞存活率显著升高;该抗微生物物质具有抗NDVlasota株、IBDV H株作用;并具有预防其感染及抑制其复制的作用。其抗病毒作用效果和病毒唑相当,由于其对CEF细胞的毒性较弱,可作为一种抗病毒药物进行开发研究。     

IBDVvp2基因高变区序列测定与进化分析

本实验采用来源于江苏地区的六株不同鸡传染性法氏囊病病毒(Infectious bursal disease virus,IBDV)毒株,应用RT-PCR法对vp2基因高变区进行了扩增,构建重组质粒pMD18T-vp2,测序。与有代表性的IBDV毒株VP2基因高变区序列进行比较分析,以ClustalX软件进行序列比对,得到基因序列及氨基酸序列同源性,IBDV Y3、P2G、P8G、SZ、Y5和W04(6株)IBDV与D6984(荷兰)的同源性达到99．0％以上,与其它一些超强毒株(very virulent IBDV,vvIBDV)的同源性也达到了97．8％以上,并在关键氨基酸位点符合vvIBDV特征,采用Phylip3．5软件分析作出进化树,其结果从分子水平说明六个毒株均为vvIBDV,与欧洲和日本的超强毒株有较近的亲缘关系,而与美洲株的较远,从而为IBDV分子流行病学研究和疫苗的研制提供了科学依据。     

IBDVvp2基因高变区序列测定与进化分析

本实验采用来源于江苏地区的六株不同鸡传染性法氏囊病病毒(Infectious bursal disease virus,IBDV)毒株,应用RT-PCR法对vp2基因高变区进行了扩增,构建重组质粒pMD18T-vp2,测序.与有代表性的IBDV毒株VP2基因高变区序列进行比较分析,以ClustalX软件进行序列比对,得到基因序列及氨基酸序列同源性,IBDVY3、P2G、P8G、SZ、Y5和W04(6株)IBDV与D6984(荷兰)的同源性达到99.0%以上,与其它一些超强毒株(very virulentIBDV,vvIBDV)的同源性也达到了97.8%以上,并在关键氨基酸位点符合vvIBDV特征,采用Phylip3.5软件分析作出进化树,其结果从分子水平说明六个毒株均为vvIBDV,与欧洲和日本的超强毒株有较近的亲缘关系,而与美洲株的较远,从而为IBDV分子流行病学研究和疫苗的研制提供了科学依据.     

免疫刺激复合物(ISCOM)介导的传染性法氏囊病病毒多聚蛋白基因免疫的研究

将传染性法氏囊病病毒（IBDV）ZJ2000株的多聚蛋白（VP2／VP4／VP3）基因插入pCI质粒的CMV启动子下游,构建了真核表达质粒pCI-VP2/VP4/VP3,在Lipofectin介导下转染Vero细胞进行了多聚蛋白的瞬时表达。以免疫刺激复合物（ISCOM）为佐剂制备DNA疫苗,进行不同免疫剂量间、不同免疫途径间、一次免疫和二次免疫间的效果对比试验。结果表明：以肌内和皮内联合免疫法效果最好,而口服和点眼等途径未能诱导足够的免疫反应;大于200μg的剂量DNA疫苗才能产生良好的免疫力;二次免疫的效果明显优于一次免疫。与常规的弱毒疫苗B87和D78相比,DNA疫苗产生中和抗体的潜伏期长、效价相对较低,对强毒攻击的保护率相当。本试验还证实,免疫刺激复合物具有明显提高DNA疫苗免疫效果的作用。DNA疫苗能诱导产生保护性反应,为今后IBD疫苗的研究开创了一条新的途径。     

Antiviral Activity of Antimicrobial Lipopeptide from Bacillus subtilis fmbj Against Pseudorabies Virus, Porcine Parvovirus, Newcastle Disease Virus and Infectious Bursal Disease Virus in Vitro

Bacillus subtilis fmbj can produce lipopeptide antimicrobial substance, whose main components were surfactin and fengycin. In the study, the antiviral activity of antimicrobial lipopeptides (AMLs) from B. subtilis fmbj (CGMCC No. 0934) against Pseudorabies Virus (PRV), Porcine Parvovirus (PPV), Newcastle Disease Virus (NDV) and Infectious Bursal Disease Virus (IBDV) was evaluated in vitro. The AMLs represented a direct inactivation effect on cell-free virus stocks of PRV, PPV, NDV and IBDV, and it could effectively inhibit infection and replication of the NDV and IBDV, but failed to affect PRV and PPV. The AMLs were represented higher toxicity for the Porcine Kidney (PK-15) cells (50% cytotoxic concentration (CC₅₀) value was 32.87 μM) and lower for the Chicken Embryo Fibroblasts (CEF) cells (CC₅₀ value was 89.16 μM). The Selectivity index of AMLs on PRV, PPV, NDV and IBDV was 1.44, 2.23, 8.40 and 12.19, respectively.     

传染性法氏囊病毒VP2 蛋白的分子生物学研究进展

本文综述了IBDV的保护性抗原蛋白VP2与病毒形态、毒力变异、抗原变异间的关系及在诱导宿主细胞凋亡中的作用。同时也探讨了其在新型疫苗开发中的应用等方面的研究进展。     

传染性法氏囊病病毒VP3抗原表位的鉴定

利用肽扫描技术对4株IBDV VP3的单克隆抗体(HRB-3F、HRB-7B、HRB-7C和HRB-10E)的抗原表位进行了研究.通过Western blot和ELISA鉴定,将HRB-3F和HRB-7B的抗原表位定位于VP3 109～119 aa(位于IB-DV聚合蛋白的864～874 aa),HRB-7C和HRB-10E的抗原表位定位于VP3 177～190 aa(位于IBDV聚合蛋白的932～945 aa).进一步检测其反应原性及免疫原性,结果表明,这两个表位均能与抗IBDV阳性血清反应.将这两个表位短肽免疫BALB/c小鼠,其血清可以和IBDV反应,具有较好的免疫原性.与D6948、HK46和UK661等多株IBDV相应区域的同源性进行了比较,结果显示,这两个表位在多种毒株中同源性为100%.通过IBDV VP3抗原表位的研究,筛出两个新的保守线性表位并进行精确定位,对进一步分析IBDV结构与功能以及建立以表位为基础的抗原抗体诊断方法具有重要的意义.     

单核增生性李氏杆菌溶血素的原核表达及其单克隆抗体的制备

为了深入研究单核增生性李氏杆菌(LM)致病机理,从其基因组中克隆李氏杆菌溶血素基因hly,并将其与原核表达载体连接在大肠杆菌BL21中表达携带His标签的李氏杆菌溶血素(LLO)融合蛋白,经镍柱纯化得到重组LLO蛋白作为免疫原并免疫小鼠。取免疫小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞(Sp2/0)进行融合,经过3次亚克隆后获得3株稳定分泌针对LLO蛋白单抗的杂交瘤细胞株,分别命名为Anti-LLO1、Anti-LLO2、Anti-LLO3;经ELISA测定其细胞培养上清效价分别为1:3.6×104、1:6.4×104、1:1.6×104,腹水效价分别为1:2×107、1:2×107、1:1×107;亲和力解离常数(Kd)分别为6.18×10-11、7.50×10-11、6.27×10-11;3株单抗的IgG亚类均为IgG1。经Westernblotting鉴定证明,该3株抗体均能特异地识别李氏杆菌LLO蛋白,该单抗的制备为深入研究LM的致病机理奠定了基础。     

抗人血栓调节蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

为了制备特异性抗人血栓调节蛋白(human thrombomodulin,hTM)的单克隆抗体(monoclonal antibody,McAb),利用脂质体Lipofectamine 2000将包含hTM全长cDNA序列的重组表达质粒pThr402转染CHO细胞,经G418筛选及相关鉴定后获得高效稳定表达hTM的CHO-TM5细胞株。将CHO-TM5细胞直接免疫Balb/c小鼠,应用杂交瘤技术,通过细胞ELISA (cellular enzyme-linked immunoabsorbent assay,CELISA)筛选出阳性克隆后,将杂交瘤细胞株腹腔注射Balb/c小鼠诱生腹水。用CELISA、流式细胞术、免疫组织化学染色法及免疫印迹法对所获McAb的特异性进行鉴定。我们获得了1株可稳定分泌抗hTM的McAb的杂交瘤细胞株NH-1,其亚型为IgGl,McAb腹水效价为1×10~(-6),腹水抗体含量为20 mg/ml。NH-1对相应抗原具有较高的组织特异性,在体内与正常组织的交叉反应少,对人脐静脉内皮细胞、CHO-TM5有特异性结合反应,说明NH-1可特异性识别天然的hTM分子,为进一步应用此McAb进行hTM生物学功能及临床意义研究提供了基础。