番茄早疫病菌Hog1 MAPK同源基因AsHog1的表达特性及其与抗药性的关联性

根据几种丝状真菌Hog1 MAPK(丝裂原活化蛋白激酶)的保守氨基酸序列设计简并引物,从番茄早疫病菌Alternaria solani中扩增出MAPK同源基因的部分片段,命名为AsHog1。用Real-timeRT-PCR技术比较了AsHog1在异菌脲敏感菌株和抗性菌株中的表达特性。结果表明,敏感菌株QX21经0.8mol/L NaCl和2mg/L异菌脲处理后,AsHog1相对表达量持续升高,在12h达到最大值,分别为对照的4.12倍和25.23倍,16h略有降低;而室内诱导抗性突变体和田间抗性菌株经相同处理后的AsHog1表达量变化不大,且明显低于敏感菌株。由此推测,番茄早疫病菌AsHog1基因表达特征与其对异菌脲抗药性相关。研究结果为深入研究病原菌对异菌脲抗药性的分子机理、建立抗药性分子监测技术、延缓和防止抗药性的产生及发展奠定了一定的理论基础。     

香蕉枯萎病菌4号生理小种致病相关基因foABC1的分离

通过对香蕉枯萎病菌4号小种致病突变体B1233的进一步研究,分离了被突变的致病相关基因foABC1,同源性分析及保守结构预测该基因编码一类ABC转运蛋白,其功能可能同稻瘟病菌的ABC转运蛋白一样,负责真菌毒素的泵出,或是像其他真菌的ABC转运蛋白,在病原菌侵染寄主植物时能忍耐植物因防卫反应所释放的植保素或抗毒素类物质。     

尖镰孢古巴专化型Focr4-1701突变体的生物学表型研究

由尖镰孢古巴专化型(Fusarium oxysporum f.sp.cubense,Foc)引起的香蕉枯萎病是香蕉生产中的毁灭性病害之一。Foc有4个小种,其中4号小种(Focr4)因其寄主范围广且无高抗病性的香蕉品种,对香蕉产业的危害最大,其致病机制至今尚不清楚。为研究其致病机制,本文对Focr4野生型菌株(Focr4-193-6)、因其T-DNA插入导致致病性严重减弱的突变体Focr4-1701、T-DNA插入标签基因敲除子△Focr4-1701及敲除基因互补子△Focr4-1701-cp-1为材料,从致病性测定、玻璃纸穿透试验、孢子形态观察、产孢量与孢子萌发率测定、粗毒素测定等方面对其与致病性相关的生物学表型进行了测定。结果表明:T-DNA插入突变体Focr4-1701和基因敲除突变体△Focr4-1701接种后的香蕉植株叶片没有表现发病症状,敲除基因互补菌株与野生型菌株一样表现出发病症状;T-DNA插入突变体和基因敲除突变体不能穿透玻璃纸生长,T-DNA插入突变体及基因敲除突变体在产孢量、孢子萌发率和产毒素能力上均极显著低于野生型菌株及互补菌株。这些表型性状差异说明Focr4-1701致病性严重减弱可能是T-DNA插入位点标签基因失活后导致了菌丝体侵染能力下降及产毒素能力降低造成的。     

香蕉枯萎病菌果胶甲基酯酶基因的克隆与生物信息学分析

旨在了解香蕉枯萎病菌(Fusarium oxysporumf.sp.cubense)4号生理小种(FOC4)PME基因序列特征,根据同源物种PME相关序列设计引物,利用PCR和RT-PCR技术,克隆FOC4序列基因和开放阅读框,命名为Foc4Pme。结果表明,所获得的PME基因均含有2个内含子和3个外显子,990 bp的片段,编码329个氨基酸。预测编码蛋白有信号肽,具有1个功能位点,其分子质量和等电点分为34.894 8 kD和9.17,该蛋白为稳定存在的蛋白。该蛋白疏水性最大值为2.022,最小值为-2.156,大部分区域为亲水区。该基因编码的蛋白具有一定保守性,进化上与镰刀菌亲缘关系最近。     

尖镰孢古巴专化型1号生理小种致病相关基因敲除突变体△Focr1-328的生物学特性

由尖镰孢古巴专化型1号生理小种Fusarium oxysporum f. sp. cubense race 1（Focr1）引起的香蕉枯萎病是粉蕉类香蕉品种（AAB）不能规模化种植的最主要因素,其致病机理至今尚不十分清楚。本实验室前期通过T-DNA插入获得Focr1致病性丧失突变体Focr1-328,从Focr1全基因组序列中定位了因T-DNA插入失活的基因,并从野生型菌株Focr1-N2中敲除了该致病相关基因,获得了敲除突变体△Focr1-328。为了明确该致病相关基因的生物学功能,通过活体叶片、活体根     

番茄早疫病菌Hogl MAPK同源基因AsHogl的表达特性及其与抗药性的关联性

根据几种丝状真菌Hogl MAPK(丝裂原活化蛋白激酶)的保守氨基酸序列设计简并引物,从番茄早疫病菌Alternaria solani中扩增出MAPK同源基因的部分片段,命名为AsHogl.用Real-time RT-PCR技术比较了AsHogl在异菌脲敏感菌株和抗性菌株中的表达特性.结果表明,敏感菌株QX21经0.8mol/L NaCl和2mg/L异菌脲处理后,AsHogl相对表达量持续升高,在12h达到最大值,分别为对照的4.12倍和25.23倍,16h略有降低;而室内诱导抗性突变体和田间抗性菌株经相同处理后的AsHogl表达量变化不大,且明显低于敏感菌株.由此推测,番茄早疫病菌AsHogl基因表达特征与其对异菌脲抗药性相关.研究结果为深入研究病原菌对异菌脲抗药性的分子机理、建立抗药性分子监测技术、延缓和防止抗药性的产生及发展奠定了一定的理论基础.     

MAPK级联途径参与ABA信号转导调节的植物生长发育过程

植物激素ABA参与调控植物生长发育和生理代谢以及多种胁迫应答过程,促分裂原活化蛋白激酶（MAPK）级联途径应答于多种生物和非生物胁迫,广泛参与调控植物的生长发育。MAPK级联途径与ABA信号转导协同作用参与调控植物种子萌发、气孔运动和生长发育,本文主要归纳了植物中受ABA调控激活的MAPK级联途径成员,阐述了它们参与ABA信号转导调控植物生理反应和生长发育的过程,并对MAPK级联途径与ABA信号转导的研究方向作出了展望,指出对MAPK下游底物的筛选是完善MAPK级联途径的重要组成部分。     

Nrf2基因敲除小鼠的繁育及生长发育的生物学特性

目的了解ICR-Nrf2小鼠的生物学特性。方法用原种繁殖扩群,观察繁殖性能及仔鼠的生长发育。结果ICR-Nrf2--/-与ICR-Nrf2-＋/＋比,总的产仔数与离乳数减少（P〈0.01或P〈0.05）;体重在出生后第3周时差异有显著性（P〈0.01）,第5周至第25周时同性别间差异非常显著（P〈0.01）。结论Nrf2基因缺失小鼠的产仔数、离乳数均少于野生型小鼠,仔鼠的生长速度也较野生型小鼠慢。     

土壤中香蕉枯萎病菌FOC4的实时荧光定量PCR检测

香蕉枯萎病发病率与土壤中香蕉枯萎病菌FOC4的数量密切相关。为了在香蕉定植前准确检测土壤中FOC4的数量,本研究以本实验室克隆的FOC4特异性基因片段作为标准线性片段,设计特异性荧光定量引物:以标准线性片段为模板建立荧光定量标准曲线,以无FOC4的土壤配置FOC4孢子浓度梯度标准土样,采用MoBio土壤基因组DNA提取试剂盒提取总DNA,以各FOC4孢子浓度梯度(1.66×10~3～1.66×108)的标准土样所提取的总DNA为模板进行实时荧光定量PCR,测定各标准土样中FOC4数量。以标准土样FOC4线性片段基因拷贝数的结果与FOC4线性片段基因100%提取率时的理论拷贝数的比值作为该标准土样FOC4基因组的提取率,对待检测土样FOC4的定量检测值进行校正,建立了一套较准确检测土壤FOC4数量的实时荧光定量PCR技术,其检测下线可达400个孢子/克土。应用该项技术对南天黄品种蕉园10个枯萎病病株的土样和10个未发病植株的土样和巴西蕉园5个发病植株的土样进行实际定量检测。结果表明,南天黄发病植株、未发病植株和巴西蕉发病植株的土样中FOC4的数量分别为每克土5 100～11 000个孢子/克土,3 500～7 800个孢子/克土和11 800～101 000个孢子/克土。本研究可准确检测土壤中的FOC4含量,同时也为香蕉枯萎病的防控措施的制定提供了帮助。     

尖镰孢古巴专化型4号小种T-DNA插入突变体Focr4-1562及其基因敲除子的生物学表型研究

尖镰孢古巴专化型4号小种Fusarium oxysporum f. sp. cubense race 4（Focr4）是引起毁灭性土传病害香蕉枯萎病的危害性最大的小种,至今其致病机理尚不清楚。对已获得的野生型菌株Focr4-193-6经基因T-DNA插入引起致病性严重减弱的突变体Focr4-1562及其插入失活基因的敲除子△Focr4-1562的生物学表型进行了研究。玻璃纸穿透试验、活体叶片接种及根部接种致病性测定的结果表明,插入突变体和敲除子不能穿透玻璃纸生长,叶片接种和根部接种未见有明显病斑和球茎维管     

结核分枝杆菌硫醇乙酰基转移酶基因敲除株的构建及其生物学特性分析

为探索硫醇乙酰基转移酶(mycothiol acetyltransferase,MshD)在结核分枝杆菌中的生物学特性,本实验利用噬菌体为载体的同源重组技术,构建结核分枝杆菌mshD基因敲除株、mshD基因回补株,用实时定量聚合酶链反应(real time-quantitative polymerase chain reaction, RT-qPCR)对所构建的菌株进行验证。分别收集H37Ra野生株、mshD基因敲除株、mshD基因回补株对数生长期菌液各5 mL, 离心收集菌体并培养,以观察菌落形态、生物膜形成及生长曲线测定;用5 mmol/L H₂O₂、0.05% SDS,50 ℃热激及低氧条件下分别处理基因敲出菌株和野生菌株,将菌液进行10倍梯度稀释,培养4～6周后检测抗胁迫能力并计算存活率。结果显示, 与野生株H37Ra相比,mshD基因敲除株菌落褶皱减少且菌落偏小,生长趋势较为缓慢;生物膜形成所需时间增长且褶皱明显减少;抗逆能力下降,存活率略低于野生株和回补株。揭示了mshD基因对结核分枝杆菌的生长具有重要作用,为进一步揭示该基因的功能和作用机制奠定了基础。     

海南省香蕉枯萎病病原菌的分离鉴定及1号、4号小种的生物学特性

香蕉枯萎病是目前国内和世界很多地区香蕉种植区的一种毁灭性病害,目前尚未找到有效的防治方法.本文采集了海南省不同地区香蕉枯萎病的病原菌,通过经典病理学与分子生物学的方法进行了鉴定,此外还优化了快速检测的方法.结果表明,通过接种巴西香蕉和粉蕉进行致病性检测以及分离菌rDNA-ITS测序结果,明确鉴定出供试的香蕉分离菌株为4号生理小种,粉蕉分离菌株为1号生理小种.为了对1号、4号生理小种有更多的了解,本文还对1号、4号小种菌株生物学特性进行了测定,确定了影响菌丝生长的最佳条件.结果显示,pH 5时最适合1号、4号生理小种的菌丝生长,适合菌丝生长的温度为19～28℃之间,温度达到37℃时菌丝不能生长,碳源对菌丝的生长影响不大.这些方法和数据可以有利于田间香蕉枯萎病病害的检测和最终确定,生物学特性的测定可以为耕作技术的改进和农药的研发提供参考依据.     

猪链球菌2型唾液酸合成酶neu B基因敲除突变株的构建及其生物学特性

利用同源重组基因敲除方法构建猪链球菌2型强毒株05ZYH33唾液酸合成酶neuB基因敲除突变株。PCR和Southern杂交结果均显示neuB基因在1株转化重组体中完全被壮观霉素抗性基因替代, 表明neuB基因敲除突变体构建成功。生物学特性鉴定显示, 突变体与强毒株在菌落形态、溶血活性以及染色特性方面均无明显差异; 电镜检查发现突变体表面结构组分与强毒株有显著差异, 荚膜明显变薄, 质地更加紧密; 小鼠致病性试验结果显示, 突变体毒力显著减弱。研究结果提示菌体荚膜中的唾液酸对于猪链球菌2型侵袭和致病具有重要作用。     

FMR1基因敲除对C57BL/6小鼠部分生物学特性的影响

为探讨脆性X智力障碍1(FMR1)基因敲除对C57BL/6小鼠(Mus musculus domesticus)部分生物学特性的影响,使用全自动动物血细胞分析仪和全自动生化仪分别检测8~10周龄的FMR1基因敲除小鼠(C57BL/6 FMR1 KO)及同源背景C57BL/6小鼠的血液生理生化指标、电解质等,并进行统计学分析。C57BL/6 FMR1 KO小鼠与野生型C57BL/6小鼠比较,血液生理指标中雌性及雄性组间的中性粒细胞计数(MEUT#)、中性粒细胞百分比(MEUT)和淋巴细胞百分比(LY)存在显著性差异(P0.05);雄性组间的红细胞总数(RBC)、血红蛋白(HGB)、红细胞压积(HCT)和平均血红蛋白浓度(MCHC)存在显著性差异(P0.05);雌性组间的白细胞(WBC)、淋巴细胞计数(LY#)存在显著性差异(P0.05);而非性别因素影响两类小鼠组间的红细胞总数(RBC)、红细胞压积(HCT)、中性粒细胞计数(MEUT#)、中性粒细胞百分比(MEUT)和淋巴细胞百分比(LY)存在显著性差异(P0.05);血清生化指标中雄性组间的谷草转氨酶/谷丙转氨酶(AS/AL)存在显著性差异(P0.05);雌性组间的肌酐CR、肌酸磷酸激酶CK和钙离子浓度Ca2+存在显著性差异(P0.05);而非性别因素影响两类小鼠组间的谷草转氨酶/谷丙转氨酶(AS/AL)、肌酐CR和肌酸磷酸激酶CK存在显著性差异(P0.05);其他各项指标差异不显著(P0.05)。研究表明,FMR1基因敲除可影响小鼠的部分生理生化指标水平,这为今后研究和应用C57BL/6 FMR1 KO小鼠模型提供了实验依据。     

猪圆环病毒2型Cap基因单核苷酸缺失突变体的构建与生物学特性

猪2型圆环病毒(PCV2)是新出现的猪传染病—断乳仔猪多系统衰竭综合征病原.为了分析PCV2基因组核苷酸缺失突变对病毒复制的影响,以PCV2-HZ0201毒株基因组为模板,采用DpnⅠ定点突变技术,构建4个位于ORF2内的单核苷酸缺失突变体感染性克隆△1376PCV2,△1377PCV2,△1378PCV2和△1379PCV2.缺失突变体转染PK-15细胞后用间接免疫荧光检测病毒的拯救效果.结果显示,△1376PCV2感染性克隆能拯救出感染性病毒粒子,△1377PCV2,△1378PCV2和△1379PCV2感染性克隆不能拯救感染性病毒粒子,说明ORF2内1376位核苷酸的缺失不影响PCV2的复制.复制能力测定结果显示,△1376PCV2的复制能力比亲本病毒高10倍左右.促炎因子IL-6的转录本与血清浓度测定结果显示,△1376PCV2感染小鼠后的IL-6转录本与蛋白表达显著高于健康小鼠,且高于亲本病毒.这些数据首次揭示,ORF2内1376位核苷酸缺失的PCV2病毒粒子被提高了复制能力,同时促进了促炎因子IL-6的转录与表达.     

引起免疫失败的IBV分离株的生物学特性及结构基因分析

本研究应用鸡胚尿囊腔接种的方法,从广西患传染性支气管炎的免疫失败的病鸡中分离到一株传染性支气管炎病毒(IBV)(命名GX-YES),通过间接血凝试验、动物回归试验和气管环交叉中和试验对该毒株进行鉴定和主要生物学特性的研究,同时利用RT-PCR技术扩增克隆该病毒的SI基因和N基因并测定其核苷酸序列.结果表明:该病毒株有间接血凝性;致病性较强;血清型不同于常用疫苗株H120、Ma5、4/91.同源性分析表明,SI基因核苷酸和氨基酸序列与参考株的同源性分别为63.5%～81.2%和50.7%～78.8%;N基因核苷酸和氨基酸序列与参考株的同源性分别为85.7%～87.2%和89.5%～91.7%;SI基因和N基因系统进化分析表明分离株与其它参考毒株的亲缘关系较远.SI基因和N基因分型与血清学试验结果相吻合.本研究结果提示了广西分离株GX-YL5可能是一个新的变异株,这可能是目前免疫失败的重要因素,同时也为研制适合本地使用的IBV疫苗提供了科学依据和物质基础.     

vcrV基因对副溶血弧菌生物学特性及III型分泌系统1效应蛋白易位的影响

【背景】副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)具有两套III型分泌系统(typeIIIsecretion system,T3SS)。T3SS1通过向宿主细胞分泌效应蛋白发挥致病作用,vcrV基因位于T3SS1编码基因簇。【目的】以vcrV基因为研究对象,探索其对副溶血弧菌生物学特性及T3SS1致病机制的影响。【方法】以副溶血弧菌POR-1株为参考菌株,利用同源重组技术构建vcrV基因缺失株ΔvcrV和回补株CΔvcrV,比较各菌株在生长性能、生物被膜形成能力、细胞黏附及细胞毒性等生物学特性的差异,应用Western Blot检测T3SS1诱导条件下POR-1、ΔvcrV和CΔvcrV等菌株效应蛋白分泌量,进一步利用具有过表达载体pMMB207-vp1683-CyaA的各菌株侵染HeLa细胞,通过Western Blot检测细胞内效应蛋白VopR(Vp1683)的易位量。【结果】与基础菌株POR-1相比,缺失vcrV基因不影响副溶血弧菌的生长性能、生物被膜形成能力及细胞黏附等生物学特性,显著降低了对HeLa细胞的毒性作用,具有过表达载体的POR-1、ΔvcrV和CΔv...     

长沙A(H1N1)亚型季节性流感暴发疫情的实验室诊断及其HA基因特性分析

对2009 年长沙麓山国际学校流感暴发疫情进行实验室诊断, 并探索新分离的A(H1N1)亚型流感病毒血凝素(HA)的基因特性。对流感暴发疫情的25 份鼻/咽拭子标本进行RT-PCR检测和流感病毒分离, 然后利用CEQ?8000 Genetic Analysis System对病毒分离株(A/Yuelu/314/2009)进行测序, 测序结果提交至GenBank(登录号: FJ912843)并用ClustalX和Mega4.1软件进行序列分析。结果显示, 分离出A(H1N1)亚型流感毒株18株, 检出21份A(H1N1)亚型流感病毒核酸阳性; A/Yuelu/314/2009(H1N1) HA基因序列与2008~2009 年疫苗株(A/Brisbane/59/2007)比较显示: 核苷酸和氨基酸同源性均为99%, 有6个位点的氨基酸发生了变异(V148A、S158N、G202A、I203D、A206T、W435R), 其中一个S158N氨基酸变异位于B抗原表位, HA基因序列上共有潜在糖基化位点9 个(27、28、40、71、151、176、303、497、536), 与A/Brisbane/59/2007相同且氨基酸序列保守。本实验诊断出此次流感暴发疫情的病原体为A(H1N1)型季节性流感病毒, 研究还发现A/Yuelu/314/2009(H1N1)长沙分离株与A/Brisbane/59/2007 疫苗株基因序列比较显示并未形成一个新的变种, 推测是由于分离株与疫苗株之间基因特性的改变和人群对A(H1N1)亚型流感病毒免疫力降低导致了此次长沙麓山国际学校A(H1N1)亚型流感的暴发。     

表达羊传染性脓疱病毒F1L基因的重组山羊痘病毒的构建与特性鉴定

【目的】本文旨在构建可表达羊传染性脓疱病毒F1L基因的重组山羊痘病毒,并对其生物学特性进行初步研究。【方法】将羊传染性脓疱病毒F1L基因与转移载体pUC-TK12连接,同时插入LacZ报告基因和一双向启动子;将重组转移载体转染已接种山羊痘病毒的BHK-21细胞,通过蓝白斑筛选、纯化,对重组病毒进行连续传代培养,应用PCR、间接免疫荧光和Western免疫印迹等方法进行鉴定,并对重组病毒进行不同温度、酸碱度、有机溶剂和紫外照射等处理,进行TCID50评价。rGpv-F1L免疫小鼠后,经酶联免疫吸附实验检测其特异性抗体水平。【结果】成功构建重组病毒转移载体pTL-F1L,将转移载体转染BHK-21细胞后,通过蚀斑纯化获得了可稳定遗传的rGpv-F1L。间接免疫荧光和Western免疫印迹检测发现其可稳定表达F1L蛋白。55℃30min或紫外照射1h即可灭活重组病毒,且其对强酸、强碱、有机溶剂等较敏感。接种重组山羊痘病毒的小鼠40d内机体可持续产生高水平的特异性抗体,与接种Gpv病毒组相比差异极显著(P0.01)。【结论】本文获得了可稳定表达羊传染性脓疱病毒F1L的重组山羊痘病毒疫苗候选株,其具有良好的抗原性和生物学活性,为同时预防羊传染性脓疱病和羊痘提供新途径。