基因敲除技术在微生物中的应用

随着分子生物学技术的发展,基因敲除技术越来越广泛地应用于动植物、微生物领域,成为研究生物基因功能最有力的工具之一。基因敲除技术在改造动植物、微生物基因组、研究发育生物学、鉴定新基因新功能、育种以及医疗领域都有应用价值。针对微生物方面,对实现基因敲除的各种原理方法,RecA系统同源重组法, Red系统同源重组法,基于自杀载体的同源重组法,基于温敏型质粒的同源重组法, CRISPR/Cas系统介导的基因敲除方法进行了总结,比较各自的优缺点,并提供一些成功案例以及各种方法相关的发明专利,以期对了解基因敲除技术的方法与发展提供参考。     

淋病奈瑟菌基因分型进展

淋病奈瑟菌表型分型方法的局限性限制其在该菌分型方面的应用。近年来,一系列该菌基因分型方法的建立弥补了表型分型方法的不足。各种基因分型方法,如Opa分型法、Por分型法、脉冲场凝胶电泳等有着各自不同的基因分型基础、应用范围及优缺点等。本文就近年来新发展的最主要的该基因分型方法作一简要介绍。     

鉴别差异表达基因的新方法──抑制消减杂交法(SSH)

抑制消减杂交法（SuppressicSubtractiveHybridization,SSH）是最近（1996）报道的能有效鉴别两个不同细胞群差异表达基因的新方法［1,2］。该方法是以抑制PCR和消减杂交法为基础,在一轮反应中实现mRNA的均等化和消减步骤。本文对SSH法的原理、优缺点作了介绍,并与其它检测差异表达基因的方法,如mRNA差别显示法（DDRT－PCR）、代表性序列差异分析（RDA）比较,认为SSH方法具有高效快速、高敏感性和假阳性低等优点。同时,625个克隆中有很大一部分是转录物丰度很低的基因,40％的克隆可能为新的基因。因此,SSH可作为鉴别差异表达基因和克隆新基因的有效方法。     

超声诱导基因转移

植物基因工程的关键技术之一,是把外源基因导入植物细胞.目前,植物细胞的基因转移方法有:(1)农杆菌Ti或Ri质粒载体法;(2)病毒载体法;(3)磷酸钙核酸沉淀吸收法;(4)PEG介导DNA直接转移法;(5)脂质体载体法;(6)显微注射法;(7)电激基团转移法:(8)基因枪喷射法;(9)激光微束法等.前两种方法是以生物体作为载体介导基因转移,属生物方法中间三种方法是以化学药物介导基因转移.属化学方法;后四种是以物理手段介导基因转(?)属物理方法.由于物理方法操作比较简单,不受宿主范围的限,因此近年(?)发展迅速.     

植物多基因转化研究进展

通过转基因技术改良植物品质近几年已成为热点研究问题,基因工程不断发展,单基因转化技术已不能满足人们对植物改良的需要。更多的研究者投身于参与某个代谢途径的多个基因在植物体中共同表达的研究,通过多基因调控来获得更好的植物性状。基因的协调表达有四种研究思路,在此基础上多基因转化方法可概述为传统转化法、改进后的共转化法,及新兴的基因融合方法,综合分析每种方法在植物代谢调控中的优缺点与应用,并探讨多基因整合的不稳定及相互作用问题。     

一种新的等温单向生长基因合成法初步探索

基因合成正日益成为基因获取的一种有效手段。两种常用的基因合成方法是基于PCR的基因合成（P法）和基于连接酶的基因合成(L法)。这两种方法都不是独立于所合成基因的序列内容的。文章首次提出了一种新的基因合成策略—等温单向生长法(Isothermal Unidirectional Elongation Method, IUEM), 在3种酶的作用下, DNA链在等温状态下单向串行延伸, 直到获得目标基因。由于引物设计成特殊的发夹结构, 该方法可以做到合成过程独立于或部分独立于目标基因的序列内容。本文探索了该策略的实验可行性, 检测了影响基因合成的各种因素, 并利用该方法成功地合成了一段254 bp和一段300 bp的DNA序列。     

水稻遗传转化研究进展

水稻遗传转化的主要方法,包括农杆菌介导法,基因枪法,电激法,PEG法等,论述了用于水稻转化的各种外植体,影响水稻遗传转化和植株分化的各种因素,各种标记基因及相应的选择方法和外源基因在转基因水稻中的遗传规律,比较了常用启动子在水稻中的表达强度,一些已转移到优良水稻品种中的有益农艺性状基因,如抗病、抗虫、抗除草剂等,介绍了它们在水稻品种改良中所发挥的作用。     

荧光原位杂交检测乳腺癌HER-2基因的应用价值

目的:探讨荧光原位杂交(FISH)在检测乳腺癌组织HER-2基因扩增的应用价值.方法:收集50例手术切除的乳腺癌标本.经过处理和切片,FISH法检测细胞HER-2基因扩增情况,IHC法检测细胞膜上HER-2蛋白表达情况.kappa检验法对两种检测结果的一致性进行统计分析.结果:FISH法与IHC法检测结果总符合率为90%(K=0.75,P<0.05).在本组胶东半岛女性乳腺癌人群中HER-2基因扩增率为28%.结论:FISH法检测乳腺癌HER-2基因敏感性及稳定性较高,可作为最终确诊HER-2基因状态的方法.     

mecA基因PCR扩增法检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌

目的 应用mecA基因PCR扩增法检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（methicillin resistant staphylococcus aureus,MRSA）。方法 临床分离的70株金黄色葡萄球菌,应用mecA基因PCR扩增法鉴定MRSA,并与苯唑西林纸片扩散法进行比较。结果 70株金黄色葡萄球菌用PCR扩增法和纸片扩散法有6株鉴定有差异,4株。mecA基因阳性而纸片扩散法鉴定为敏感,1株mecA基因阳性纸片扩散法鉴定为临界耐药,1株mecA基因阴性却表现为苯唑西林耐药,2种方法符合率为91．43％。结论 mecA基因PCR扩增法可以准确、快速判定MRSA,特别是对隐匿型或低水平耐药菌株的检出有重要的价值。     

基于决策森林特征基因的两种识别方法

应用DNA芯片可获得成千上万个基因的表达谱数据。寻找对疾病有鉴别力的特征基因 ,滤掉与疾病无关的基因是基因表达谱数据分析的关键问题。利用决策森林方法的集成优势 ,提出基于决策森林的两种特征基因识别方法。该方法先由决策森林按照一定的显著性水平滤掉大部分与疾病类别无关的基因 ,然后采用统计频数法和扰动法 ,根据所选特征对分类的贡献程度对初选的特征基因作更加精细地选择。最后 ,选用神经网络作为外部分类器对所选的特征基因子集进行评价 ,将提出的方法应用于 4 0例结肠癌组织与 2 2例正常组织中 2 0 0 0个基因的表达谱实验数据。结果表明 :上述两种方法选出的特征基因均具有较高的疾病鉴别能力 ,均可获得最优特征基因子集 ,基于决策森林的统计频数法优于扰动法。     

利用标记基因检测转Bt基因棉种子纯度的研究

安徽农业大学植保系李长福、吴振廷、王学林等研究人员根据转Bt基因棉国抗 1号转入的外源基因中整合有GUS基因和NPTⅡ基因 ,建立了 3种种子纯度检测方法 ,即GUS组织化学染色法、NPTⅡ培养法和NPTⅡ叶片涂抹法 ,准确率达到 98% ,在检测转Bt基因棉原始群系 2 0 - 1时 ,与生物测定比较准确率同样在 98%。为此 ,这 3种方法可用转Bt基因棉扩大规模制种过程中和推广应用良种纯度的检测 ,相应方法同样适用于基因组中整合有GUS基因和NPTⅡ基因的其他转Bt基因棉的品种。不仅如此 ,还适用于携带同一Bt杀虫蛋白基因的所有转Bt基因植物。同时…     

基因枪的使用方法介绍

基因枪法是一种新型的遗传转化手段[1-3]。所谓遗传转化是指通过某种途径或技术将外源基因导入受体细胞的基因组中,并使之在受体细胞中表达。人们可利用一个特定的目的基因,如抗虫、抗病基因等进行转化,使转基因植物在保持原有的各种优良农艺性状的同时,又能增加新的目的基因所控制的性状。一般遗传转化主要有两类：一类是农杆菌介导法,一类是DNA直接转化法。DNA直接转化技术包括化学方法和物理方法,如电击、微注射、超声波和基因枪法。基因枪法,又称生物弹法或微粒枪法、微粒轰击法,是依赖高速度的金属微粒将外源基因引入活细胞…     

提取线粒体DNA方法的比较及较纯线粒体基因获取方法的确立

目的:对2种常用的线粒体DNA提取方法进行比较,分析提取物中核DNA的存在情况,同时建立新检测方法降低线粒体假基因干扰。方法:以仅在核DNA中存在的基因β-actin作为核DNA存在的标定基因,通过PCR方法扩增线粒体DNA上的一段基因MTND5-2,并以β-actin做参比,比较常用的2种提取线粒体DNA方法的优劣,即碱法Ⅰ(先提取完整线粒体后从中获得线粒体DNA)和碱法Ⅱ(根据线粒体DNA与核DNA的结构差异,从中获得双链环状的线粒体DNA)。结果:2种线粒体DNA提取方法并不能获得仅含线粒体DNA的纯提取物,碱法Ⅰ获得的线粒体DNA纯度相对较高;以碱法Ⅰ提取物为模板进行PCR,可获得更多较纯的线粒体目的基因。结论:碱法Ⅰ较碱法Ⅱ可获得更纯的线粒体来源的目的基因;新建方法可获得较纯的线粒体基因,且是一种简单、方便、经济的方法。     

双向等位基因特异性PCR与限制性片段长度多态性基因分型方法比较

目的:比较双向等位基因特异性PCR(Bi-PASA)法与聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性(RFLP)法对EZH2基因单核苷酸多态性(SNPs)位点rs887569基因分型结果有无差异,并用Bi-PASA法对EZH2基因rs17171119位点基因分型后分析与结直肠癌(CRC)易感性的相关性。方法:提取96名CRC患者与100名体检健康者的外周血DNA,分别用Bi-PASA法与聚合PCR-RFLP法检测EZH2基因单核苷酸多态性(SNPs)位点rs887569基因型,对两种分型结果进行比较;使用Bi-PASA法对EZH2基因rs17171119位点进行基因分型后用病例-对照方法分析该SNPs在中国人群中的分布。结果:Bi-PASA与PCR-RFLP对EZH2基因rs887569位点基因分型的准确率分别为99.5%和100%;EZH2基因的rs17171119 SNPs位点多态性与结直肠癌易感性无显著相关性(P=0.938,OR=0.846,95%CI:0.586-1.221)。结论:Bi-PASA是一种简单有效检测SNPs的方法,分型结果较为可靠;rs17171119 SNPs位点多态性与结直肠癌易感性无关,但本结论还有待更大样本量基因分型的验证。     

多拷贝策略在小肽表达中的应用

基因工程技术已经在大分子多肽表达上得到了广泛的应用。但是小分子多肽不稳定且易降解,使其表达后很难检测和纯化。多拷贝策略是将目的基因或是含有目的基因的表达盒首尾串联,而串联构建多拷贝表达载体是目前解决小分子多肽表达量少的有效方法。总结和比较非对称粘性末端互补法、接头连接法、同尾酶法和表达盒串联法在多肽表达方面的应用情况,为小分子多肽的体外表达提供方法和思路。     

家蚕转基因方法的初步研究

为建立家蚕转基因研究中切实可行的外源基因导入方法、分别用显微注射法、精子介导法、脂质体法和压力渗透法将含有绿色荧光蛋白(gfp)基因的转座子载体和辅助质粒转入到家蚕的受精卵中。在后代中检测到发绿色荧光的蚕茧,用PCR方法检测到后代个体染色体中含有gfp基因,并比较了上述几种方法的优缺点,为进一步进行转基因家蚕的研究奠定了基础。     

利用转座子构建水稻基因破坏系

农林水产省农业生物资源研究所分子育种部广近洋彦等小组利用转座子首次在世界上构建了水稻基因破坏系。用动物、微生物确立了同源重组的基因破坏法。植物的基因定靶法尚无确认系。美国ＰｉｏｎｅｅｒＨｉ—ＢｒｅｄＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ公司去年底利用转座子成功地开发出玉米基因破坏法。用水稻、玉米２种谷物确立了基因破坏法,在此基础上,希望能进行机能分析以加快育种工作。２月２６日在东京召开的科学技术振兴调整费的成果报告会上发表了这项成果。广近等的方法是在传统的组织培养变异法上再使用ＰＣＲ的筛选法。检测在水稻组织…     

SLAⅠ类基因研究新进展

SLAⅠ类基因编码细胞表面高度多态的糖蛋白, 负责将内源性抗原肽递呈给T细胞, 激发特异的免疫反应。文章介绍了近年来SLAⅠ类基因分子结构、组织中的表达、表达调节、基因分型、多态性及进化研究的新进展, 重点介绍了SLAⅠ类基因分型方法及多态性研究。SLAⅠ类基因分型方法主要包括血清学法、DNA序列测定、PCR-SSP、PCR-SSOP、微卫星法, 其中PCR-SSP法快速简便, 在SLAⅠ类基因分型研究中应用广泛。文章对SLAⅠ类基因在基因功能、肽疫苗、异种移植等方面的研究和应用前景进行了讨论。     

二化螟碱性神经酰胺酶和中性鞘磷脂酶基因RNA干扰技术体系的优化

【目的】比较不同方法以及不同靶标基因的RNA干扰(RNA interference,RNAi)效率,建立并优化二化螟Chilo suppressalis碱性神经酰胺酶saCER和中性鞘磷脂酶snSMase基因的RNAi的技术体系。【方法】通过培养液浸泡法将果蝇Drosophila daCER基因的dsRNA导入果蝇S2细胞内;分别通过显微注射法和荧光纳米粒子介导喂食法将体外合成的二化螟saCER和snSMase基因的特异性双链RNA(dsRNA)导入二化螟3龄(注射法)和2龄(喂食法)幼虫体内,之后利用qPCR测定靶标基因的mRNA表达水平,比较不同方法对不同基因的RNA干扰效率。【结果】将果蝇S2细胞浸泡在浓度为15 ng/μL的含daCER dsRNA细胞培养液中培养72 h后,daCER基因的表达水平下降了约84%。dsRNA (5 000 ng/μL)注射二化螟3龄幼虫60 h后对saCER基因的干扰效率达到最高(41%),dsRNA (2 500 ng/μL)注射48 h后对snSMase基因的干扰效率最高(47%);给二化螟2龄幼虫喂食dsRNA(48μg/d)后,分别在第7天和第8天对saCER(32%)和snSMase(52%)基因达到最大干扰效率。对于aCER基因,果蝇S2细胞浸泡法与二化螟注射法和喂食法相比,干扰效率差异极其显著;使用相同方法,对saCER基因和snSMase基因的干扰效率无显著差异;对于二化螟的同一基因(saCER或者snSMase),注射法与荧光纳米粒子喂食法之间干扰效率也无显著性差异。【结论】碱性神经酰胺酶基因和中性鞘磷脂酶基因对导入dsRNA进行RNAi的方法较敏感,本研究建立并优化的显微注射法和荧光纳米粒子介导喂食法RNAi技术体系在鞘脂质代谢酶基因功能的基础研究中具有可行性。注射法和喂食法对二化螟幼虫aCER基因的干扰效率远低于浸泡法对果蝇S2细胞中这一基因的干扰效率,进一步证实二化螟血淋巴中的RNA酶对dsRNA的快速降解以及中肠围食膜的阻隔很大程度上削减了dsRNA进入二化螟细胞内发挥干扰作用。     

Hela基因周期表达数据聚类及功能分析

目的:进一步了解与宫颈癌相关基因的功能以及作用关系.方法:根据Hela基因周期表达数据的时序特点,提出了KLCC聚类法.该方法以K-means法为平台,以基因问的局部相关系数(Local Correlative Coefficient,LCC)为相关性测度,并对K-means法进行了相应的改进,根据基因间的相关关系,分批对基因聚类.结果:在对Hela基因周期表达数据的聚类分析中,得到9个显著的功能类,其中有3个与肿瘤紧密相关,具有优于当前常用算法的性能.结论:KLCC法能够有效地识别Hela基因周期表达数据中的局部相关和异步相关,并对其进行功能显著的聚类,为宫颈癌的基因治疗提供参考和依据.