植物发育基因克隆技术的新进展

过去２０年,人们已经分离到了相当数量的与发育相关的基因。这主要借助于蛋白质产物的分离纯化,然后根据其氨基酸结构推算其相应的核苷酸序列,并据此合成寡核苷酸探针,最终从ｃＤＮＡ文库或基因组文库中筛选出目的基因。而未知其编码产物的发育基因的分离克隆则是非常困难的工作,以前广泛应用的主要方法有ＤＮＡ标签法（ＤＮＡｔａｇｇｉｎｇ）［１,２,３］,作图克隆法（ｍａｐ－ｂａｓｅｄｃｌｏｎｉｎｇ）［４］,差别筛选法（ｄｉｆｅｒｅｎｔｉａｌｓｃｒｅｅｎｉｎｇ）［５］和扣除杂交法（ｓｕｂｔｒａｃｔｉｖｅｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）［６,７,８］。这些方法虽然都取得了一定的成功,但由于各自的缺陷性,而限制了它们更加广泛的应用。近年来在ＰＣＲ技术的基础上,人们已经建立了若干种分离克隆植物发育基因的新方法。１９９２年,ＬｉａｎｇＰ和ＰａｒｄｅｅＡ［９］首次提出并运用了ｍＲＮＡ差别显示技术（ｍＲＮＡｄｉｆ－ｆｅｒｅｎｔｉａｌｄｉｓｐｌａｙｒｅｖｅｒｓｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ－ＰＣＲ,ＤＤＲＴ－ＰＣＲ）来进行基因的分离。实践表明,ｍＲＮＡ差别显示技术在分离、鉴定差别表达的新基因方面与以前的各种技术相比有其独特的优越性,但同时它也存在着重复性较差等缺点。因此,最近研究工作者又在其基础上,发展了诸如代表性差式分析（ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎａｌｄｉｆｅｒｅｎｃｅａｎａｌｙｓｉｓ,ＲＤＡ）［１０,１１］和抑制性扣除（或减去）杂交（ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎｓｕｂｔｒａｃｔｉｖｅｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ,ＳＳＨ）［１２］等一些更新的方法。下面就此作一简要概述。     

植物细胞程序性死亡──一个新兴的研究领域(英文)

近年来,越来越多的证据表明,植物细胞在生理、病理或逆境条件下可发生程序性死亡（ＰｒｏｇｒａｍｍｅｄＣｅｌｌＤｅａｔｈ,ＰＣＤ）。本文详细描述了植物ＰＣＤ的形态和生化特征、生理功能及其研究意义,并把这些方面与动物ＰＣＤ做了比较。另外,虽然植物ＰＣＤ的研究尚处于起步阶段,本文还是对其可能的信号传导机制、遗传调控以及ＰＣＤ的起源与进化作了探讨,并提出了植物ＰＣＤ的研究战略。具体说来有以下几个方面：１．形态和生化特征。目前,植物ＰＣＤ的研究主要还集中于形态和生化方面的描述。各种条件下的植物ＰＣＤ在形态和生化特征上都或多或少地与动物细胞凋亡存在差异,并不符合动物细胞凋亡定义的全部内容。并且不同植物ＰＣＤ类型相互之间也存在着较大的不同。尽管如此,动植物ＰＣＤ在形态和生化方面还是存在许多相似之处。无炎症反应、ＤＮＡ的特异片段化以及核酸内切酶和蛋白酶活性的升高在植物中也依然是区别ＰＣＤ与细胞坏死（ｎｅｃｒｏｓｉｓ）的形态和生化依据。２．分子水平上,植物ＰＣＤ也涉及到许多信号分子和特定基基参与调控的信号传导途径。但到目前为止,已分离的与植物ＰＣＤ直接相关的基因只有ＡＣＤ２、Ｄａｄ１等少数几个。尽管已证明一些信号分子如活性氧种     

普通小麦基因组最可能的4个供体的ITS1和ITS2序列及其亲缘关系

对普通小麦（ＴｒｉｔｉｃｕｍａｅｓｔｉｖｕｍＬ．）基因组（ＡＡＢＢＤＤ）最可能的供体－Ｔ．ｕｒａｔｒｔｕＴｈｕｍ．（ＡＡ）、Ｔ．ｍｏｎｏｃｃｕｍｖａｒ．ｂｏｅｏｔｉｃｕｍ（Ｂｏｉｓｓ．）ＭＫ（ＡＡ）、ＡｅｇｉｌｏｐｓｓｐｅｌｔｏｉｄｅｓＴａｕｓｃｈ．和Ａｅ．ｔａｕｓｃｈｉｉ（Ｃｏｓｓ．（ＤＤ）的核糖体ＲＮＡ基因ＩＴＳ区进行了ＰＣＲ扩增和克隆,并测定了ＩＴＳ１和ＩＴＳ２的ＤＮＡ序列,讨论和纠正了前人     

紫外线对大鼠晶状体抗氧化酶mRNA表达水平的影响

为探讨紫外线对晶状体的损伤机制,用ＲＴ－ＰＣＲ方法（ｒｅｖｅｒｓｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ－ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ,反转录聚合酶链反应）,研究经紫外线照射后大鼠晶状体抗氧化相关酶,包括铜锌－超氧化物歧化酶（ｃｏｐｐｅｒ－ｚｉｎｃ－ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅｄｉｓｍｕｔａｓｅ,Ｃｕ－Ｚｎ－ＳＯＤ）,谷胱甘肽过氧化物酶（ｇｌｕ－ｔａｔｈｉｏｎｅｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ,ＧＳＨ－Ｐｘ）和过氧化氢酶（ｃａｔａｌａｓｅ,ＣＡＴ）等ｍＲＮＡ的表达．结果显示,短时间的照射（２～５ｍｉｎ）,抗氧化相关酶的ｍＲＮＡ表达水平有增高表现,随后其ｍＲＮＡ表达水平开始下降,１５ｍｉｎ时抗氧化相关酶ｍＲＮＡ的表达下降更为明显,与对照组相比有非常显著性差异（Ｐ＜０．００１）．照射后２４ｈ,抗氧化相关酶的ｍＲＮＡ表达有不同程度的恢复;照射后４８ｈ,其ｍＲＮＡ表达水平基本恢复,与对照组相比没有显著性差异．从而从基因水平上初步探讨了紫外线的氧化损伤机制     

酿酒酵母耐热相关基因DNA片断的初探

对模板ＤＮＡ,Ｍｇ＾２＋的浓度以及ＰＣＲ反应程序等因素进行了研究,得出了对酿酒酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）进行随机护增多态性ＤＮＡ（ＲＡＰＤ）分析的优化条件。在此基因上对酿酒酵母耐高温菌株ＨＵ－ＴＹ－１及原始出发菌株ＬＫ的基因组ＤＮＡ进行ＲＡＰＤ分析,结果表明：两菌株间确实存在着扩增带型上的差异,而这些差异可能与菌株的耐高温性状有关。从而为今后通过四分子分析寻找与耐热相     

病理性近视与HLA的关联性研究

用ＰＣＲ－ＲＦＬＰ方法对江浙沪籍汉族５５例病理性近视眼（ＰＭ）患者的ＨＬＡⅡ类ＤＱＢ１基因的第二个外显子进行了基因分型。结果发现ＨＬＡ－ＤＱＢ１＊０２０１、＊０３０３、＊０４０１等位基因在ＰＭ患者中和正常人中的分布有显著的差异（Ｐｃ＜０．０５,ＡＦ分别为０．１６３６,０．１０９１,０．１６３６,０．１０９１ｖｓ．０．０４００,０．０３００,０．０４００,０．０２００）,可能与ＰＭ的致病相关。ＤＱＢ     

细胞程序死亡与bcl－2基因

细胞程序死亡,是有别于细胞坏死的另一种重要的衰老,死亡形式,它在胚胎发育,肿瘤发生,免疫系统的克隆选择中起重要作用,ｂｃｌ－２是调控ＰＣＤ的基因,但不能抑帛有类型的ＰＣＤ,最近发现,ｂｃｌ－Ｘ基因编码大小不同的两种蛋白,分别具有刺激和抑的ＰＤＣＣＤ的功能,ｂｃｌ－２通过抑制ＰＣＤ可导致细胞癌变,因而ｂｃｌ－２被看作第三类癌基因。     

Bcl——2基因表达对TNF及OA诱发的细胞编程死亡的不同效应

用ＴＮＦ和ＯＡ（Ｏｋａｄａｉｃａｃｉｄ）诱发人神经母细胞瘤ＳＫ细胞死亡,并证明细胞死亡为编程死亡（ＰｒｏｇｒｍｍｅｄＣｅｌｌＤｅａｔｈ,简称ＰＣＤ）。将编码Ｂｃｌ－２全长蛋白的ｃＤＮＡ植入ＰＪＸ４１ｎｅｏ载体中,使其表达由ＨＣＭＶ病毒起动子控制。形成的顺义（ｐＢｃｌ－２－Ｓ）及反义（ｐＢｃｌ－２－ＡＳ）表达质粒经转染导入ＳＫ细胞中获得稳定转染子。Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹表明顺义转染子表达大量的２６ｋｄＢｃｌ－２蛋白,而反义转染子则不表达。增强表达的Ｂｃｌ－２蛋白能抑制由ＴＮＦ引发的ＰＣＤ,但不影响ＯＡ引发的ＰＣＤ,从而证明了Ｂｃｌ－２基因产物抗细胞死亡效应的特异性。     

核酸靶序列的体外选择和扩增技术

核酸靶序列的体外选择和扩增技术王成济（第四军医大学生化教研室,西安７１００３２）关键词寡聚核苷酸,体外选择,ＰＣＲ基因表达的转录水平调控很大程度上依赖于基因的顺式调控元件（ｃｉｓ－ａｃｔｉｎｇｅｌｅｍｅｎｔｓ）与反式调节因子（ｔｒａｎｓ－ａｃｔｉｎｇ...     

用DD—PCR法克隆AVP4—8诱导的鼠脑差异表达基因

精氨酸加压素（ＡＶＰ）Ｃ端片段ＡＶＰ４－８,具有增强记忆的功能,它在大鼠脑内引发一系列的生理和生化变化。采用差示ＰＣＲ（ＤＤ－ＰＣＲ）技术,寻找注射ＡＶＰ４－８前后在大鼠海马中差异表达的基因。抽提总ＲＮＡ,以反转录产生的ｃＤＮＡ为模板进行ＰＣＲ,经过９组引物组合,获得了十几个差异片段,挑选其中差异最大的片段ｄｄｌ进行克隆,测序,并与Ｇｅｎｅｄａｎｋ等数据进行同源比较 有找到同源基因,可能是个新基因     

优化外源基因在大肠杆菌中表达的翻译起始率的策略和方法(英文)

ｍＲＮＡ的翻译起始区（ＴＩＲ）的二级结构对翻译起始率有很大的影响。本文建立了一种改进外源基因在大肠杆菌中翻译起始率的系统。以人分裂细胞核抗原（ＰＣＮＡ）基因为模型,将ＰＣＮＡ基因５′端编码区的１１４ｂｐ的顺序插入质粒ｐＴＺ１９Ｒ中ＬａｃＺ′的５′端构成融合基因。用定点突变法在ＰＣＮＡ的ＡＵＧ的８位插入一个Ｓｈｉｎｅ／Ｄａｌｇａｒｎｏ（ＳＤ）顺序ＧＡＧＧＴ,再以合成的带部分随机序列寡核苷酸作引物,用ＰＣＲ法在ＳＤ顺序两侧,即ＳＤ上游６个碱基和ＳＤ与ＡＵＧ之间７个碱基,进行随机突变,它们与结构基因５′端序列形成各种可能的翻译起始区（ＴＩＲ）二级结构。重组质粒转化大肠杆菌株ＪＭ１０９（ＤＥ３）,５′ＰＣＮＡ－ｌａｃＺ′ｍＲＮＡ可通过诱导表达Ｔ７ＲＮＡ聚合酶而得到专一而有效的转录。通过在Ｘ－ｇａｌ板上蓝色筛选以及随后的杂交鉴定,共得到２６９个５′ＰＣＮＡ－ｌａｃＺ′融合质粒。从中选择８个不同蓝色的重组子进行β－ｇａｌ活性测定,结果表明它们的酶活性相差在２０倍以上。而ＲＮＡ点杂交表明它们在转录水平无明显的差异。由此提示,通过此策略和方法能得到一个在大肠杆菌中能高效表达的翻译起始区。     

昆虫杆状病毒衣壳主蛋白基因的PCR扩增,克隆和定位

用ＰＣＲ技术成功地扩增了苜蓿丫纹夜蛾核型多角体病毒（ＡｃＮＰＶ）的衣壳主蛋白基因（ｖｐ３９基因）,并克隆了该基因,利用纯的ｖｐ３９基因探针,在低严谨杂交条件下,已将粘虫核型多角体病毒（ＬｓＮＰＶ）的ｖｐ３９基固定位在ＰｓｔＩ－Ｆ,ＢａｍＨＩ－Ｃ,ＥｃｏＲＩ－Ｃ,ＸｈｏＩ－Ｄ,Ｉ,ＥｃｏＲＶ－Ｈ,Ｘ等片段上。ＰＣＲ反应时,在扩增出预期的包括完整ｖｐ３９基因的１４０６ｂｐ片段的同时也扩增出一条Ｃａ．４００ｂｐ的片段,本文讨论了ＰＣＲ的特异性扩增和非特异性扩增。     

用显微切割技术和催化信号扩增法检测何杰金病瘤细胞（H／RS）中的 …

为明确何杰金病（Ｈｏｄｇｋｉｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ,ＨＤ）瘤细胞中是否存在人巨细胞病毒（ｈｕｍａｎ ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ,ＨＣＭＶ）感染,采用显微切割技术结合ＰＣＲ方法检测ＨＤ组织及其瘤细胞Ｈｏｄｇｋｉｎ／Ｒｅｅｄ－Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇ（Ｈ／ＲＳ）中的ＨＣＭＶ核酸;采用免疫组织化学催化信号扩增（ｃａｔａｌｙｓｅｄ ｓｉｇｎａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ,ＣＳＡ）法检测ＨＤ中ＨＣＭＶ的立即     

一氧化氮抑制血管紧张素Ⅱ和内皮素—1诱导的心肌细胞原癌基因c—fo …

在原代培养的新生大鼠心肌细胞上,探讨一氧化氮（ＮＯ）对血管紧张素Ⅱ（ＡⅡ）和内皮素－１（ＥＴ－１）诱导的心肌细胞肥大和原癌基因ｃ－ｆｏｓ表达的影响。用Ｂｒａｄｆｏｒｄ法测定心肌细胞总蛋白含量（作为心肌细胞肥大的指标）;用基因特异性引物和ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ一步法进行逆转录聚合酶链式反应（ＲＴ－ＰＣＲ）,检测大鼠心肌细胞原癌基因ｃ－ｆｏｓ的表达（以ＧＡＰＤＨ为内标）。结果显示,ＡⅡ和ＥＴ－１分别作     

动脉平滑肌细胞sis／PDGF－B链的表达和调控

介绍平滑肌细胞ｓｉｓ／ＰＤＧＦ－Ｂ链表达和调控的进展。ｃ－ｓｉｓ原癌基因是ＰＤＧＦ－Ｂ的同源基因,将外源的ＰＤＧＦ基因导入哺乳类细胞是研究ＰＤＧＦ功能和调控的重要手段。内皮素、ＩＬ、ＴＮＦ、血管紧张素Ⅱ和蛋白激酶Ｃ可调节ｓｉｓ基因的表达。ｓｕｒａｍｉｎ和新霉素（ｎｅｏｍｙｃｉｎ）的人工合成为拮抗ＰＤＧＦ效应提供广阔的前景。ｃ－ｓｉｓ可通过激活ｃ－ｍｙｃ、ｃ－ｆｏｓ等原癌基因而促进细胞增殖。     

中国人肥胖基因真核表达载体的构建

为研究肥胖（ｏｂｅｓｉｔｙ）的病因及肥胖基因（ｏｂ）的表达与调控,根据文献报道的ｈｏｂ序列设计引物,经ＲＴ－ＰＣＲ扩增中国人的ｏｂ基因（包括信号肽在内的ｃＤＮＡ全长５４０ｂｐ）,ＰＣＲ产物采用Ｔ－Ａ克隆法首先连接到克隆载体ｐＵＣ１１９,然后定向转移到经改造的真核表达载体ｐＳＶ－β－ｌａｃＺ,酶谱分析表达克隆基因为的人肥胖基因。     

球形幽门螺杆菌分子生物学研究

为研究幽门螺杆菌（ＨＰ）球形变异本质,作者通过延期培养和采用亚抑菌浓度抗生素,使３株ＨＰ发生球形变异,对弯曲形和球形ＨＰ作了ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、免疫印迹及４个毒力基因片段ＰＣＲ和ＰＣＲ－ＳＳＣＰ分析。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ图谱显示球形ＨＰ分子量在７４×１０４以上的蛋白含量减少,免疫印迹显示球形ＨＰ１２５×１０４蛋白条带反应减弱,而抗生素诱变的球形ＨＰ分子量为１１×１０４和６３×１０４的蛋白条带反应增强。ＰＣＲ及ＰＣＲ－ＳＳＣＰ结果表明球形ＨＰ的ｈｐａＡ,ＶａｃＡ,ＣａｇＡ和ＵｒｅＡ４个毒力基因片段未发生缺失,但在ｈｐａＡ或ＶａｃＡ基因中存在点突变     

产气肠杆菌α—乙酰乳酸脱羧酶基因的克隆和表达及影响重组酶活性？…

用ＰＣＲ方法从产气肠杆菌（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）中克隆出０．９ｋｂ的ＤＮＡ片段,经ＤＮＡ测序证明是α－乙酰乳酸脱羧酶（α－ａｃｅｔｏｌａｃｔａｔｅ ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ,α－ＡＬＤＣ）基因。将α－ＡＬＤＣ基因重组到质粒,ｐＢＶ２２０后,转化大肠杆菌,经筛选获得的高效表达的重组子菌株。     

人碱性成纤维细胞生长因子基因克隆,cDNA5‘端修饰及在大 …

采用ｃＤＮＡ－ＰＣＲ技术,从人胎盘ｃＤＮＡ文库ＤＮＡ中克隆了人碱性成纤维在子（ｈｂＦＧＦ）基因,用ＰＣＲ突变法对其５＆端序列进行修饰,奖天然和修饰后的ｈｂＦＧＦ基因分别克隆至表达载体ｐＢＶ２２１,免疫抑迹和ＳＤＳ－ＰＡＧＥ结果证明,经修饰后的基因在大肠杆菌ＤＳ５α中获得了表达,表达量占菌体总蛋白９％。     

人肿瘤坏死因子受体I死亡域融合蛋白基因的克隆与表达

通过设计４个引物进行重叠ＰＣＲ,由此克服了人肿瘤坏死因子受体Ｉ死亡域与氯霉素乙酰转移酶（ＣＡＴ）的融合蛋白基因（ＤｄＬｃａｔ）。该融合蛋白基因经测序,证明与设计的序列相同。构建成的重组表达质粒ｐＬＴ１０ＤｄＬｃａｔ转化大肠杆菌后发酵,ＩＰＴＧ诱导２ｈ,ＳＤＳ－ＰＡＧＥ测定ＤｄＬｃａｔ蛋白质的分子量为３９ｋＤ。Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹实验进一步作了鉴定。表达产物大部分为包涵体。ＤｄＬｃａｔ经Ｑ－Ｓｅｐｈａ