mRNA差异显示RT-PCR技术在昆虫学研究中的应用

mRNA差异显示RT- PCR是近 1 0年广泛使用的用于克隆和分析差异表达基因的有效技术。该文简要介绍了差异显示RT -PCR技术的原理、优缺点及其优化方法 ,重点综述了mRNA差异显示RT -PCR技术在昆虫学研究中的应用。     

mRNA差异显示技术中特异条带回收方法的比较

目的：建立简化的mRNA差异显示技术中特异条带的回收方法。方法：用单个小鼠早期发育的胚胎构建mRNA差异显示技术,用一步法和煮沸法分别从银染的聚丙烯酰胺凝胶中回收差异显示的特异条带,并进行再扩增、回收、克隆及酶切鉴定。结果：两种不同的回收方法经过mRNA差异显示技术程序环节,证明其具有相同的实验效果。结论：应用简化的一步法和煮沸法对单胚构建的mRNA差异显示技术中的特异条带进行回收,具有有效性和可靠性。     

六种回收纯化差异显示PCR产物方法的比较

目的:建立mRNA差异显示PCR产物回收纯化方法。方法:采用了6种方法对干旱东亚砂藓mRNA差异显示技术的特异PCR产物进行分离回收纯化。结果:6种不同回收方法,显示不同的结果。结论:冻融法简单、方便、经济、有效,对东亚砂藓构建的mRNA差异显示技术中特异条带进行回收,具有有效性和可靠性。     

差异显示技术及其研究进展

差异显示技术是分离差异表达基因的重要方法与手段,同其它研究基因差异表达的方法如RDA,SSH,SAGE相比,差异显示技术是其中使用频率较高的方法。该技术自1992年创立以来,经过各国研究者不断完善与改进,现已大大克服以往诸多不足,扩大了应用领域。本文就差异显示技术的原理及主要优缺点作以简要概述,并着重就引物设计、降低假阳性、鉴定差异表达基因及差异显示技术的衍生技术这4个方面的研究进展作以详尽介绍。     

差异显示技术及其进展

差异显示技术是在转录水平上研究基因表达差异的有效方法。它通过一系列的锚定引物与随机引物组合把不同种细胞的ｍＲＮＡ进行分组反转录及ＰＣＲ扩增,在相邻泳道上显示扩增结果,通过比较电泳图谱找出差异。差异显示技术建立至今仅五年时间便在分析基因表达差异、绘制遗传图谱、分离特异性表达基因、临床诊断遗传疾病等方面被广泛应用,并不断得到改进和完善。     

差异显示技术及其进展

差异显示技术是在转录水平上研究基因表达差异的有效方法。它通过一系列的锚定引物与随机引物组合把不同种细胞的ｍＲＮＡ进行分组反转录及ＰＣＲ扩增,在相邻泳道上显示扩增结果,通过比较电泳图谱找出差异。差异显示技术建立至今仅五年时间便在分析基因表达差异、绘制遗传图谱、分离特异性表达基因、临床诊断遗传疾病等方面被广泛应用,并不断得到改进和完善。     

正交法整体优化差异显示反应体系

mRNA 差异显示PCR( mRNA differential display PCR,DDRT-PCR)是分离差异表达基因的有效方法,但该方法的准确性极易受到外部因素和内部因素的影响。本研究采用正交法优化DDRT-PCR反应条件,充分考虑到模板浓度、锚定引物浓度、随机引物浓度、dNTPs浓度、镁离子浓度以及Taq酶用量等因素在差异显示反应过程中的交互作用,一次PCR反应即可确定最佳反应组合。将筛选出的条件用于DDRT-PCR,得到差显结果假阳性率低,重复性和稳定性好,而且简化了反应条件的优选程序,这表明正交法是优化差异显示反应条件的理想方法。为了进一步简化整个差异显示反应系统的操作程序,降低假阳性率,研究采用了非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gel electrophoresis,PAGE)和银染显示差异带的方法,并用反向Northern法来验证回收条带,从而更加优化了差异显示反应体系。     

降低差异显示-PCR假阳性和提高重复性的几种策略

简要介绍了几种提高mRNA差异显示重复性和降低假阳性的策略. mRNA差异显示技术从建立时起就引起了科学家的广泛兴趣, 是克隆不同生理或病理过程中差异表达基因的一种高灵敏度、简单、有效的方法.但mRNA差异显示因其假阳性率高和重复性低,限制了其在生命科学中的应用.     

限制性酶切片段差异显示及其应用

差异显示技术(DD)-PCR是一种研究基因表达差异的重要而应用广泛的方法,传统的差异显示法由于在PCR时采用Poly（T）引物和随机引物而导致较高的假阳性率和产物的近Poly(A)非编码区的大量扩增。改进后的限制性酶切片段差异显示技术(RFDD)-PCR采用ToqI酶切双链cDNA,连上特殊设计的接头,再用经特殊设计的特异性配对于接头的引物来扩增,因此能重点扩增编码区并能极大地消除假阳性率。由于扩增时引物就带有荧光或放射性核素标记,还使得差异显示条带的检测更为方便、灵敏。本简要介绍了该法的原理、步骤、应用及其优缺点。     

用改进的DDRT-PCR技术进行人胚差异基因筛选

介绍一种从不同类型细胞或不同生长状态细胞中分离差异表达基因的快速高效mRNA差异显示技术,其特点是利用Ready-To-Go RT-PCR反应珠和Ready-To-Go RAPD分析珠进行mRNA差异显示分析,使取样步骤降至最低程度,减少了潜在的取样误差和外源DNA污染,并确保每次反应的高度重复性.通过银染测序胶分析差异显示的cDNA带,便于DNA回收和进一步克隆.用此方法分析人胚发育早期不同阶段基因的差异表达,选用6条随机引物对3、4和5周龄人胚进行mRNA差异显示分析,从2 000多条带中共分离出14个差异产物,经二次扩增及反向RNA印迹确证其中6个片段为发育不同阶段差异表达基因.     

差异显示技术在橡胶树分子生物学研究中的应用

差异显示技术是从分子水平研究细胞、组织、器官中基因结构和表达变异的手段之一,在巴西橡胶树研究中也已有应用。本文从DNA、RNA和蛋白质水平上介绍了近年来差异显示技术在橡胶树分子生物学研究中的进展,并对其前景作了展望。     

用银染mRNA差异显示进行基因筛选

介绍一种简便、快速的mRNA差异显示法银染法。并对在逆转录时总RNA加入的量、dNTP的浓度、银染的条件、差异条带的回收及再扩增等方面作了探讨和改进。实验表明,用银染进行mRNA差异显示具有快速、简便、经济、可靠性高等优点。为新基因的发现和克隆提供了有用的手段。     

SHR与WKY大鼠肾脏组织基因表达差异分析

为了观察SHR与WKY大鼠肾脏组织的基因表达的差异,用T11G、AP6引物对12周龄的SHR与WKY大鼠肾脏mRNA进行了差异显示,得到了一条在SHR大鼠肾脏组织中高表达的差异显示条带,进一步分析证明这一差异显示条带含有170 bp,与GenBank 收录的已知的核苷酸序列的同源性低于80%,可能为未知基因的cDNA片段,并定位于SHR大鼠的肾小管上皮细胞内.     

快速、有效筛选新的功能基因——差异显示技术

真核生物mRNA差异显示技术 (DifferentialDisplay)的创立及其对该技术的一系列改进 ,为研究与生殖、发育、细胞分化、癌变、病变、衰老、程序化死亡及抗逆性与抗病性等生命过程有关的基因的差异表达 ,以及有关基因的分子克隆提供了有效工具。本文将简要叙述差异显示技术的优越性、主要缺陷、技术改进等方面的研究进展 ,和具体操作的注意事项。     

高浓度琼脂糖电泳分离差异显示PCR产物方法探讨

荧光差异显示技术（fluorescent differential display,FDD）的操作成本及对仪器和试剂盒的依赖性高,限制了该技术的应用。介绍一种使用高浓度琼脂糖电泳方法显示荧光差异显示PCR扩增结果的简便方法,该方法在筛选低钙与足钙处理条件下花生胚胎的差异表达基因中得到了较好结果。     

反向Northern Blotting对绵羊卵巢组织差异表达 ESTs的鉴定

利用地高辛DNA标记与检测技术反向Northern斑点杂交,对小尾寒羊和滩羊卵巢组织差异显示ESTs进行鉴定,避免同位素放射性污染,安全性很高且操作简单,提高了实验的准确性,一种鉴定差异显示ESTs简单而有效的方法。在研究基因表达、比较不同环境条件下动物组织的mRNA差异表达等方面具有广阔的应用前景。     

用DDRT-PCR方法克隆小鼠精子发生早期相关基因的EST

为了避免差异显示技术中的放射性污染 ,并用之于筛选、克隆精子发生早期的相关基因 ,分离纯化了小鼠的原始精原细胞及B型精原细胞 ,提取其总RNA ,逆转录获得cDNA ,以荧光差异显示方法筛选差异表达基因。利用斑点杂交技术对差异片段进行快速鉴定以排除假阳性。选取 16条差异显著的片段做克隆测序 ,通过Gen Bank/Blast比较 ,有 7个片段属于新的EST ,且均表现为在B型精原细胞中表达强度高于原始精原细胞。提交Gen Bank获得注册号。从中选取较有意义的 3条基因片段通过半定量RT PCR方法进一步验证其表达特征。和传统的差异显示方法比较 ,文中所采用的mRNA差异显示技术可快速排除假阳性结果 ,避免同位素标记带来的放射性污染。结果表明所获得的 7个新EST均表现为B型精原细胞中高表达 ,这些表达升高的基因可能与其后精子发生过程中的一系列特殊现象 (如减数分裂、变态成形 )有关 ,为生精细胞的分化做物质上的准备。     

荧光标记mRNA差异显示技术

目的：应用荧光标记的ｍＢＮＡ差异显示技术。方法：提取未经过／经过ＩＦＮ－ＬＰＳ处理的三组人单核细胞系Ｕ９３７的总ＲＮＡ并以此为模板,采用荧光标记的锚定引物,通过逆转录、差异显示ＰＣＲ反应,经５．６％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离差异条带,回收后将其再扩增。结果：三组样本的ＤＤ－ＰＣＲ产物电泳显示长３００ｂｐ￣２．０ｋｂ不等的扩增片段,条带清晰、明亮,背景低,各样本相互间的差异不仅呈有无的变化,亦表现出     

东亚砂藓取材部位对提取其总RNA及DDRT-PCR的影响

分别采用新鲜东亚砂藓植物体先端、基部及中部作为材料,采用改良的SDS法,提取及纯化三部分的总RNA。比较RNA产率、纯度及分析电泳图谱来确定适于东亚砂藓RNA分离的最佳部位。并运用mRNA差异显示方法比较了东亚砂藓不同部位的差异。实验结果显示,东亚砂藓植物体的先端适于其总RNA提取及mRNA差异显示的研究。     

基因克隆的常用方法介绍

为能快速、准确地克隆出有意义的基因,本文介绍了目前常用的一些基因克隆方法,如差异显示ＰＣＲ、抑制性差减杂交、ＲＡＰ－ＰＣＲ、代表性差异显示、酵母双杂交系统、ｃＤＮＡ直接捕捉法等;并对这些方法作了简要的评价,以利于大家选择适合自己的方法。