发展中的mRNA差别显示技术

随着PCR技术的出现（1985）,在分子生物学界又相继出现了两个很有影响的新技术－PAPD技术（1990）和mRNA差示法（1992）,前者用于分子标记,后者用于基因分离。mRNA差示法的生物学基础是基因的差别表达,即：单个细胞中表达的基因仅占基因总数的15％,这种基因的差别表达决定了生命的所有过程,如：发育和经、对逆境的反应、细胞分裂、老化等。图一给出了该方法最初的技术路线。提取要比较的两种或两种以上样品的mRNAs,分别逆转录成cDNAs,经过PCR扩增后,直接进行测序胶电泳即可识别差别的mRNA。其中、关键是的PCR扩增时两个引物的设计。3′端引物Oligo(dT)MN很容易与具有N′M′－poly(A)-3′末端的大多数mRNA结合,进行cDNA的逆转录合成。M、N提供锚定位点,防止3′端引物在poly(A)序列不同位置上的随机结合。5′端为10个碱基的随机引物。这个经验上的碱基数较理论的6－7个碱基（表一）更能满足测序胶电泳要求的条件：分子大小在500bp左右,每条泳道上条带数在100条左右。该方法近年来又有如下改进：一、PCR退火温度由42℃改为40℃,可在保持特异性的同时,增加泳道上的条带数。cDNA合成的底物改用总RNA,可避免poly(dT）柱纯化mRNA时的污染,造成电泳抹带（smear）现象。二、第二代引物3′端的M位（3′端倒数第二位）碱基改用4个简单碱基,减少了引物的组合数,提高该法的效率和经济性。第三代引物在两种引物的5′端加HindIII酶切位点,3′端引物改为单随机碱基,既：5′－AAGCT11N－3′;5′端引物为5′－AAGCTT＋（AP）7。大大提高了克隆效率和克隆cDNA的可操作性。三、可能由于10个碱基随机引物的特异性还不够,泳道上出现的cDNA条带数多得超过了不可分辨的程度,造成了假阳性现象。有人尝试用不变性凝胶代替变性凝胶、或用Northern亲和层析加以解决。收效不大。也许,还是需要在引物设计上下功夫。四、经比较,^33P的半衰期和放射性强度介于^32P和^35S之间,价格最贵,但效果最好。通过对正常细胞与病变细胞、处理与未处理细胞、不同生理状态和不同发育时期的细胞,以及抗逆性强弱所作的mRNA差别显示分析,在动植物生理、病理以及抗性研究中取得了大量成果。但是,由于该技术要求底物有poly(A）尾,只能限于真核生物核基因组差异表达的研究。而且,所选择的研究材料除要求目的的基因有差异外,其它基因差异要尽可能小。GenHunter公司已推出了方便的专用试剂盒,但使用的是与人有害的、需要较长曝光时间的放射性同位素,这些都是需要进一步改进的,还包括向技术的自动化改进。     

mRNA差别显示技术及其应用

真核生物一般具有１０万个不同的基因,但同时表达基因只有很小一部分,约１５％,而且不同发育阶段、不同生理状态和不同类型的细胞中表达的基因也不尽相同。这种基因表达的差异决定了所有的生命过程：发育和分化、内环境的平衡、细胞周期、对刺激的反应、衰老和死亡等。...     

mRNA差别显示技术及其在生命科学中的应用

ｍＲＮＡ表达水平的变化决定细胞的功能状态,个体发育、细胞增殖分化与凋谢、生理刺激和药物治疗等过程,都会出现ｍＲＮＡ 表达水平的变化。阐明这种变化有助于揭示细胞生理过程的分子机制。该技术无需更多的背景资料,可快速有效地分离表达水平出现差别的基础,这些基因编剧编码的功能多肽在细胞生理过程中扮演着重要角色。     

mRNA差别显示技术在植物发育研究中的应用

mRNA差别显示技术是近年发展起来的研究基因表达差异的有效方法,它不仅可比较基因表达差异、追踪已知基因的表达情况,而且可作为寻找特异表达基因的重要手段。本文介绍此方法在植物春化作用、光周期反应、花发育、雄性不育、成熟、衰老、种子发育和休眠及根发育等研究领域的应用概况。     

mRNA差别显示技术在植物发育研究中的应用

mRNA差别显示技术是近年发展起来的研究基因表达差异的有效方法。它不仅可比较基因表达差异、追踪已知基因的表达情况,而且可作为寻找特异表达基因的重要手段。本文介绍此方法在植物春化作用、光周期反应、花发育、雄性不育、成熟、衰老、种子发育和休眠及根发育等研究领域的应用概况。     

差异显示反转录PCR技术研究进展

分析一对细胞或组织在不同状态下基因表达的差异,已成为分子生物学研究领域的热点之一.近年来,用于识别差异表达基因的方法已发展起来多种.DDRT-PCR是近年来较为广泛应用的一种技术.理论上,DDRT-PCR技术比较简单,但实施起来却存在着假阳性率高,凝胶中单条cDNA带成分不均一, 所获cDNA仅代表着mRNA 3′UT区(约300 bp)以及一些低拷贝数mRNA不能有效被呈现等问题.对DDRT-PCR技术的改良也主要集中在解决这些问题方面.     

水稻雄性不育与可育花药的mRNA差别显示和cDNA差别片段的分析

用mRNA差别显示 ,对水稻细胞质雄性不育系、保持系和F1杂种的花药mRNA和叶片mRNA进行了比较和分析 ,以研究雄性不育花药在花粉败育时期的基因表达方式 .花药在不育与可育间显示的cDNA差别带数多于叶片 ,表明在花药中育性基因的表达比叶片中活跃和充分 .不同类型花药的基因转录方式既与花药育性程度有关也与花药败育早晚有关 ,不育、部分不育和早期败育的花药所显示的cDNA差别带数多于可育和晚期败育的花药 .在回收的 1 2个cDNA差别片段中 ,有2个可能与雄性不育相关 ,AB₄A₅ 片段只在不育花药中专一表达 ,另一片段AB₃ B₂ 含有与线粒体基因coxⅡ同源的序列 ,在不育花药中的表达受到部分抑制     

壳寡糖诱导植物抗性相关基因mRNA差别显示分析

壳寡糖是一种天然的信号分子,可以诱导植物产生各种防御反应。该文利用mRNA显示技术。研究壳寡糖引起的植物抗性相关基因的变化。以50mg/l壳寡糖喷洒的烟草叶片为材料,分别提取处理8h、7d和对照的叶片总RNA,利用一个锚定引物和三个随机引物组合,通过mRNA差别显示技术共获得壳寡糖处理后发生变化的8h差别条带22条,7d后的差别条带为74条。将壳寡糖处理8h得到的17条差别条带克隆到载体上后,进行反向Northern鉴定,有6条可能为真实条带。测序结果表明：其中一条差别片段与烟草热激蛋白90基因具有97％的核苷酸同源性。说明50mg/l壳寡糖处理的烟草叶片在mRNA水平上发生了明显的变化,烟草的热激蛋白90基因可能参与到壳寡糖诱导的抗性信号传导通路中。     

研究基因表达的新方法—mRNA差别显示（DifferentialDisplay）：原理和应用

研究基因表达的新方法──ｍＲＮＡ差别显示（ＤｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌＤｉｓｐｌａｙ）：原理和应用何祖华,李德葆（浙江农业大学生物技术研究所杭州３１００２９）１原理和方法高等生物一般具有１０’个不同的基因,在单个细胞或个体中仅有约１５％的基因得到表达,产...     

mRNA差别显示技术对肝再生调控基因的研究

以正常肝和再生肝为对比材料,利用mRNA差别显示技术,研究肝再生过程中基因的差别表达,旨在从基因选择性表达水平上探讨肝再生调控机理。得到4种未知肝再生相关cDNA,完成其克隆与序列分析,其一在再生肝中的表达低于正常肝,余者则高于正常肝。这些序列均已在EMBL(Europe Molecular Biology Laboratory)数据库中登录,登录号分别为X95721、X95722、X95723、X97973。     

mRNA差别显示研究肝再生调控基因

以正常肝和再生肝为对比材料,利用mRNA差别显示技术,研究肝再生过程中基因的差别表达,旨在从基因选择性表达水平上探讨肝再生调控机理. 得到4种未知肝再生相关cDNA,完成其克隆与序列分析,一例在再生肝中的表达低于正常肝,余者则高于正常肝. 这些序列均已在EMBL(Europe Molecular Biology Laboratory)数据库中登录,登录号分别为X95721、X95722、X95723、X97973.     

mRNA差别显示技术分离草菇低温诱导基因

本文报道采用改良的mRNA差别筛选法,通过选用3’锚定引物和18-25碱基的PCR随机引物组合,以琼脂糖凝胶电泳,EB显色替代聚丙烯酰胺凝胶电泳和放射自显影,对低温处理草菇（Volvariella volvacea)及正常草菇基因表达进行筛选、分析,结合RNA斑点杂交技术加以验证,分离得到70个草菇低温诱导DNA片段。     

mRNA差别显示技术分离草菇低温诱导基因

本文报道采用改良的mRNA差别筛选法,通过选用3'锚定引物和18-25碱基的PCR随机引物组合,以琼脂糖凝胶电泳,EB显色替代聚丙烯酰胺凝胶电泳和放射自显影,对低温处理草菇(Volvariella volvacea)及正常草菇基因表达进行筛选、分析,结合RNA斑点杂交技术加以验证,分离得到70个草菇低温诱导DNA片段。     

mRNA差别显示技术研究进展及其在水稻中的应用

随着基因组计划的顺利实施,大量的生物信息被解析,分离和鉴定差异表达基因已成为分子生物学研究的热点.mRNA差别显示技术(DDRT-PCR)是目前有效筛选、分离差异表达基因的方法之一.就DDRT-PCR的基本原理、存在的问题及相应的改进方法作了简要概述.阐明了该技术在水稻生长发育、杂种优势、抗逆性基因研究中的应用、取得的成绩,最后对该技术在水稻突变体及抗药性上的应用前景做了有益探讨.     

利用mRNA差别显示技术分离盐胁迫下红树植物白骨壤耐盐相关cDNA

从福建龙海红树林自然保护区采集白骨壤的隐胎生果实 ,在实验室分别置于 0‰盐度海水和 50‰盐度海水进行沙培。分别取叶片 ,提取纯化RNA。通过锚定引物OligodT₁₂ GC反转录和 8个 10核苷酸随机引物进行PCR扩增 ,经 8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳后发现了 3个差异DNA片段只在高盐培养条件的白骨壤基因组中表达 ,而在无盐培养条件中没有出现。这 3个差异cDNA片段分别命名为csrg1(600bp)、csrg2(550bp)、csrg3(480bp)。3个差异cDNA片段的RNA杂交结果显示 ,只有csrg1片段存在明显差异 高盐中有杂交斑点 ,无盐中无杂交斑点 ;而其余 2个片段在高盐和无盐条件下都没有杂交斑点出现。从而表明csrg1就是耐盐相关cDNA。进一步将csrg1片段克隆 ,并进行DNA序列分析。全序列在GenBank中查询后 ,未发现相关同源片段。耐盐相关cDNA片段的获得 ,将为分离全长耐盐基因 ,搞清该基因表达调控的机理提供条件.     

棉花洞A雄性不育系花药发育的mRNA差别显示

应用cDNA-AFLP(Amplified fragment length polymorphism）技术,分析了棉花洞A雄性不育和可育材料在花药发育过程中花粉发育相关基因表达的差异。结果表明：在花药发育的相同时期,不育和可育花粉cDNA-AFLP的谱带在单核期的差异大于减数分裂期。在花粉发育过程中,花粉发育相关基因的表达具有时空特异性。共回收了64条差异cDNA片段,随机选择3个片段标记为探针,RNA斑点杂交分析表明,GHA27具有花器官组织特异性,仅在花器官中表达;GHA28、GHA47则具有花药组织特异性且仅在可育花药中表达。序列相关性比较表明：GHA27与植物ADP-ribosylation factor(ARF）基因有较高的相似性,而GHA28、GHA47与已知序列的相似性很低。     

探寻mRNA的新方法——差别显示法

差别显示法是近年来国外发展起来的寻找和克隆新基因的有效方法,本文介绍了它的原理、方法及应用进展。提示该方法具有良好的发展前景。     

mRNA差别显示技术分离草菇低温诱导基因*

本文报道采用改良的mRNA差别筛选法,通过选用3'锚定引物和18-25碱基的PCR随机引物组合,以琼脂糖凝胶电泳,EB显色替代聚丙烯酰胺凝胶电泳和放射自显影,对低温处理草菇(Volvariella volvacea)及正常草菇基因表达进行筛选、分析,结合RNA斑点杂交技术加以验证,分离得到70个草菇低温诱导DNA片段。