CRISPR/Cas基因编辑系统研究进展

规律性成簇间隔的短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats, CRISPR)的发现和工程技术对生命科学的发展带来巨大的推动作用。RNA引导的Cas(CRISPR-associated)酶已被用作操纵细胞、动物和植物基因组的工具。这加速了基础研究的步伐,并使其在临床和农业上的应用成为可能。CRISPR/Cas9对在实验系统中进行的功能基因组学的研究有重大影响。CRISPR/Cas9系统自发现以来,因其操作便捷、成本低、特异性高、可同时打靶任意数量基因等优点而被广泛应用。经过近几年研究发现,Cas9变异体(Cas12a、Cas13)有利于突破和克服CRISPR/Cas9应用中的一些限制,Cas12a极大地扩展了基因编辑靶位点的选择范围,同时其介导的多基因编辑具有明显的优势;Cas13等蛋白能特异性结合和编辑RNA,开启了转录组研究的新篇章。本文主要就CRISPR/Cas的研究背景以及Cas9、Cas12a和Cas13系统研究进展和应用进行综述,并对其应用前景和发展方向进行了展望。     

植物中CRISPR/Cas系统的应用研究进展

成簇规律间隔短回文重复—CRISPR(clustered regularly interspaced short palindromic repeat)是近年来新兴的基因组编辑技术,因其操作简便、靶向效率高和应用范围广而备受关注。国内外关于CRISPR/Cas系统在细菌和动物研究中的应用报道较多,但对其在植物研究中的应用报道较少。该文综述了CRISPR/Cas系统的发现、结构、作用机制及其在植物研究中的应用,以期为CRISPR/Cas系统在提高农作物产量及培育抗性品种等方面的应用研究奠定基础。     

CRISPR/Cas系统的研究进展及前沿应用

CRISPR/Cas系统作为一种高效的基因组编辑工具,已经被广泛地研究和应用于各个领域。CRISPR/Cas系统已从最初的CRISPR/Cas9发展到现在的CRISPR/Cas12a、CRISPR/Cas13a、CRISPR/dCas等十多种基因编辑系统;从原来的靶向作用于DNA到现在的除了靶向作用于DNA和RNA外,还能应用于转录调控、DNA循环等无需基因编辑的领域。CRISPR/Cas系统以往存在的诸多局限性正在被一个一个突破,该系统的应用已经进入了一个新的时代。本文对CRISPR/Cas系统近些年的发展情况以及新发现的各种CRISPR/Cas系统做了一个总结,并列举了各个系统最新的应用情况。     

空肠弯曲菌感染动物模型的研究进展

空肠弯曲菌是一种全球关注的人兽共患病原菌,感染后可引起人和动物多种疾病。动物模型是开展致病机理、疫苗评价和药物开发等研究的基础。空肠弯曲菌由于培养条件苛刻以及感染实验动物的疾病相似性、经济性和重复性等因素,仍缺乏良好的感染动物模型,其致病机理迄今尚不清楚。本文对已报道的空肠弯曲菌感染实验动物模型进行综述。     

CRISPR/Cas系统的分类及研究现状

CRISPR技术作为一种新型的基因编辑技术,被广泛应用于微生物、动物和植物领域。对CRISPR/Cas系统的起源、分类特点等进行了阐述,重点梳理了CRISPR/Cas系统分类的发展历程,并根据最新分类方法,介绍了不同类型的CRISPR/Cas系统的作用机制、内部不同蛋白的作用特点及应用与发展,以期探寻更多的CRISPR/Cas系统,扩大该系统的应用领域。     

CRISPR/Cas9系统研究进展

CRISPR/Cas9系统的发展彻底改变了人们编辑DNA序列和调控目标基因表达水平的能力,从而为生物体的精确基因组编辑提供了有力的工具。简化后的CRISPR/Cas9系统由两部分组成:Cas9蛋白和sgRNA。其作用原理为sgRNA通过自身的Cas9把手与Cas9蛋白形成Cas9-sgRNA复合体,Cas9-sgRNA复合体中sgRNA的碱基互补配对区序列与目标基因的靶序列通过碱基互补配对原则进行配对结合,Cas9利用自身的核酸内切酶活性对目标DNA序列进行切割。与传统的基因组编辑技术相比,CRISPR/Cas9系统具有几大明显的优势:易用性、简便性、低成本、可编程性以及可同时编辑多个基因。CRISPR/Cas9基因组编辑技术以及衍生出来的CRISPRi和CRISPRa基因表达调控技术已经广泛应用于多种真核和原核生物中。综述了CRISPR/Cas9系统的起源、作用机理、在生物体中的应用和其衍生出的技术,并概述了其脱靶效应和未来前景。     

基于CRISPR/Cas系统的DNA碱基编辑研究进展

基于CRISPR/Cas的基因编辑是近年发展起来的一项变革性生物技术。其过程包括在目标DNA位点引入双链断裂(double strand break,DSB)以及其后续的细胞修复。细胞修复DSB主要有两种方式：非同源末端连接(non-homologous end joining,NHEJ)以及同源重组介导的修复(homology-directed repair,HDR)。前者是大多数细胞修复DSB的主要方式,其特点在于修复简单、效率高但极易出错,往往会引发难以预测的核苷酸插入或删除。点突变是自然界中最常见的遗传突变类型,引起了超过半数的人类遗传疾病以及许多重要农艺性状变异。碱基编辑能够实现单个碱基的替换,既不需要引入DSB,又无需修复模板参与,具有高效、编辑结果可控等优点,在基因治疗、作物育种及生物技术研究等方面具有重大的应用潜能。自首个碱基编辑工具开发以来,碱基编辑相关技术得到快速发展及广泛应用。本文综述了目前DNA碱基编辑研究进展,重点阐述了碱基编辑器及其在编辑效率、精度以及特异性提高和编辑范围扩展等方面的最新进展以及仍存在的瓶颈,并展望其研究和应用前景。     

空肠弯曲菌Ⅵ型分泌系统研究进展

Ⅵ型分泌系统(Type Ⅵ Secretion System,T6SS)是一种倒置于细胞膜上的类噬菌体样结构,能够输送效应蛋白并在定殖和生态位建立中发挥作用.近年来,在空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni)中发现了T6SS同源基因且能够表达组装成结构完整的T6SS,但T6SS对空肠弯曲菌的毒力影响尚不清...     

空肠弯曲杆菌生物膜形成和调控机理研究进展北大核心CSCD

空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)分泌胞外多糖和各种胞外蛋白和核酸等相互交联在一起构成生物膜,可增强其在不利环境下的生存率,尤其是对各种洗涤剂、抗生素和消毒剂的耐受力。本文从介质表面性质、温度、气体环境、以及基因的调控等多方面阐述了空肠弯曲杆菌生物膜结构及形成调控机制,同时对各种去除生物膜的实际应用做了分析和展望,为探寻生物膜的控制方法提供参考。     

鞭毛介导的空肠弯曲菌氧应激机制研究进展

空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni)是世界范围流行的食源性人兽共患病原菌,是革兰氏阴性微需氧菌。其对氧气、温度、pH和胆汁酸盐等环境条件极其敏感,在环境传播和宿主定殖过程中会遭受许多不利条件,包括致命的活性氧自由基(reactive oxygen species,ROS),因此,抵抗活性氧自由基是空肠弯曲菌进化的一种重要策略。空肠弯曲菌为抵抗氧应激进化出了多种响应机制,其中,鞭毛及其介导的运动力也参与氧应激。本文对国内外有关空肠弯曲菌氧应激研究进展及鞭毛介导的氧应激机制进行综合阐述,以期为进一步完善空肠弯曲菌氧应激调控系统奠定基础,并为弯曲菌源头防控提供思路。     

宿主菌富集空肠弯曲菌噬菌体培养条件的优化

【背景】开发噬菌体产品是一种防控空肠弯曲菌有潜力的策略,但是面临噬菌体分离的挑战。【目的】运用响应面法对宿主菌富集空肠弯曲菌噬菌体的培养条件进行优化。【方法】通过单因素试验分析培养基、培养温度、培养转速、离子添加剂对噬菌体富集效果的影响,以噬菌体回收率为评价指标,采用响应面法优化了空肠弯曲菌噬菌体的富集培养条件。【结果】在37℃条件下进行静置培养时,噬菌体富集培养效果最佳,回收率为354.12%。分离噬菌体的过程包括采样并制备滤液、宿主菌与样品滤液共培养及噬菌体分离与鉴定等环节。应用此方法从鸡粪便中分离空肠弯曲菌噬菌体,与传统的单斑法相比,噬菌体分离率提高了269.23%。【结论】研究优化的宿主菌富集噬菌体培养方法可提高空肠弯曲菌噬菌体的分离效率,为噬菌体的研究提供思路。     

47株空肠弯曲菌湖北禽源株的多位点序列分型

【目的】为了解湖北地区家禽空肠弯曲菌的流行状况及其分子特征,应用多位点序列分型方法对2013–2014年的47株禽源空肠弯曲菌湖北分离株进行分子分型研究。【方法】以空肠弯曲菌的7个管家基因aspA、glnA、gltA、glyA、pgm、tkt和uncA为目的基因,提取样本基因组后PCR扩增,测序和分析。将测序结果上传数据库进行比对,制作成多位点序列分型(Multilocus sequence typing,MLST)遗传进化树。【结果】分离株共有38个ST型,10个克隆群,其中最多的克隆群为ST-353CC和ST-464CC,发现2个新的等位基因编号和25个新的ST型。遗传进化树显示,不同家禽宿主中空肠弯曲菌序列型存在一定的差异,不同地区和来源的空肠弯曲菌呈现出遗传多样性。【结论】本研究对湖北分离的47株禽源空肠弯曲菌进行了MLST分析,其结果显示菌株多样性较为丰富,将为我国家禽空肠弯曲菌的流行病学调查提供科学的数据。     

谷氨酸棒杆菌中基于CRISPR/Cas9的多位点碱基编辑系统的优化

作为新型的基因组编辑工具,碱基编辑技术结合了CRISPR/Cas系统的定位功能和碱基脱氨酶的编辑功能,可实现特定位点的碱基突变,具有不产生双链DNA断裂,无需外源模板且不依赖染色体DNA同源重组的优势.目前,研究者们已在重要的工业生产菌株谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)中开发了多种碱...     

基于CRISPR/Cas9系统构建绵羊VASA基因敲入载体及验证

本研究旨在探索VASA基因在绵羊睾丸发育中的表达变化,并通过构建VASA基因敲入载体,为下一步进行绵羊生殖细胞体外诱导分化研究提供基础。采集性成熟前后即3月龄（3-month-old,3M）和9月龄（9-month-old,9M）绵羊睾丸组织,利用实时荧光定量PCR （quantitative real-time PCR,qPCR）和Western blotting技术分析VASA基因的差异表达,并利用免疫组织化学技术对VASA基因的表达定位进行分析。设计靶向VASA基因的向导RNA （guide RNA,gRNA）,并构建同源重组载体,进行质粒转染绵羊耳成纤维细胞。结合CRISPR/dCas9技术对VASA基因进行激活,进一步验证载体效率。结果表明,VASA基因随着绵羊睾丸发育,表达水平极显著增加（P<0.01）,且主要定位在精母细胞和圆形精子细胞中。利用CRISPR/Cas9系统构建了VASA基因敲入载体,联合pEGFP-PGK puro-VASA载体转染耳成纤维细胞,CRISPR/dCas9系统激活后,耳成纤维细胞成功表达VASA基因。结果提示,VASA基因在绵羊睾丸发育和精子发生中发挥潜在功能,且通过CRISPR/Cas9系统可在体外构建VASA基因敲入载体,为下一步探究VASA基因对绵羊雄性生殖细胞的发育和分化提供有效的研究手段。     

CRISPR/Cas9介导靶向敲除拟南芥GGB基因突变体的鉴定

GGB是抗旱负调控基因。为了获得拟南芥ggb突变体材料,构建了以拟南芥U6启动子驱动GGB sgRNA的CRISPR/Cas9基因组编辑载体。将构建好的编辑载体利用农杆菌介导的浸花法转化野生型拟南芥。对转基因后代GGB基因的测序结果分析发现,在靶位点处有缺失4个碱基和增加1个T碱基的2种突变体产生。分别对野生型拟南芥和上述2种ggb突变体进行半定量RT PCR分析结果显示,突变体材料中几乎检测不到GGB基因表达,说明获得了GGB基因敲除突变体。对野生型和ggb突变体叶片失水率、耐旱表型及单株种子量的测定结果表明,与野生型相比,拟南芥GGB基因突变后,叶片失水率显著减少,抗旱性明显增强,而单株种子量却并没有改变。研究表明,GGB是一种理想的作物分子育种的候选靶基因,获得的突变体为今后从农作物中克隆的GGB同源基因进行功能互补验证提供了有用的遗传材料。     

利用CRISPR/Cas9系统构建稳定敲除anxa6基因的Caco-2细胞株

【目的】利用CRISPR/Cas9系统构建稳定敲除anxa6基因的Caco-2细胞株,为研究大肠杆菌O157:H7效应蛋白Esp F与宿主膜联蛋白A6 (ANXA6)相互作用及其致病机制奠定基础。【方法】根据CRISPR/Cas9靶向原理设计并合成3个特异性识别anxa6基因的向导RNA (single guide RNA,sgRNA),基于Lenti CRISPRv2载体构建Lenti CRISPRv2-sg RNA重组质粒,转入293T细胞中,制备sgRNA-Cas9慢病毒,将慢病毒感染Caco-2细胞,经嘌呤霉素筛选阳性细胞,有限稀释法分离培养单克隆细胞,提取单克隆细胞基因组DNA,并对敲除位点附近的DNA片段进行PCR扩增,测序并进行脱靶效应评估;免疫印记法检测ANXA6蛋白表达情况,细胞计数试剂盒8 (cell counting kit 8,CCK8)试剂盒检测细胞增殖能力,免疫荧光法检测细胞紧密连接分布情况。【结果】Western blotting及序列测序表明anxa6基因敲除单克隆细胞构建成功;脱靶效应评估结果显示预测的10个脱靶位点均无脱靶现象;基因敲除对细胞增殖能力...