接种发酵和自然发酵中酿酒酵母菌株多样性比较

【目的】探究自然发酵和接种发酵两种发酵方式,对霞多丽葡萄发酵中酵母菌种多样性和酿酒酵母菌株遗传多样性的影响。【方法】以霞多丽葡萄为原料,分别进行自然发酵和接种不同酿酒酵母菌株(NXU17-26、UCD522和UCD2610)的发酵,利用26S rDNA D1/D2区序列分析和Interdelta指纹图谱技术分别进行酵母菌的种间及种内水平的区分,通过聚类分析及多样性指数对不同发酵方式下酿酒酵母菌株的多样性进行分析和比较。【结果】自然发酵的发酵曲线较平缓,接种发酵的发酵速度显著快于自然发酵。26S rDNA D1/D2区序列分析将4个发酵中分离到的酵母菌鉴定为6属11种,自然发酵中分离的酵母有5属6种,均为非酿酒酵母(non-Saccharomyces);而接种发酵中的酵母多样性远低于自然发酵,均由酿酒酵母和两种非酿酒酵母组成。Interdelta指纹图谱分析表明,接种UCD2610的发酵中,发酵后UCD2610是优势菌株,其基因型占比为48.78%;接种NXU17-26和UCD522的发酵中,未发现与NXU17-26和UCD522相同的基因型。聚类分析表明,分离自接种UCD522发酵中的酿酒酵母菌株间的遗传差异性较小;而分离自NXU17-26和UCD2610发酵中的酿酒酵母菌株间遗传差异性较大。多样性指数结果表明,接种UCD2610发酵中的优势菌株(UCD2610)在发酵过程中占据更加突出的地位;接种UCD522发酵中分离的酿酒酵母具有更高的多样性,影响其菌株多样性的未知因素较多,且不同基因型酿酒酵母的集中度较高。【结论】发酵方式对霞多丽葡萄发酵中酵母菌种多样性、以及酿酒酵母菌株遗传多样性的影响显著,研究结果对葡萄酒发酵中的微生物控制具有指导意义。     

云南香格里拉葡萄酒产区酿酒相关酵母菌的生物多样性

【背景】云南香格里拉高原葡萄酒产区位于云南三江并流世界自然遗产保护区内,微生物资源丰富,其中与葡萄酒酿造相关的野生酵母种类也非常多样。【目的】研究香格里拉葡萄酒产区酿酒相关酵母菌的种类多样性和酿酒酵母的遗传多样性。【方法】从香格里拉金沙江和澜沧江两岸选取5个葡萄园进行成熟葡萄样品的采集,分别对葡萄果皮和自然发酵过程中的酵母菌进行分离,运用WL营养琼脂鉴定培养基(Wallerstein laboratory nutrient agar)和26S rDNA D1/D2区序列分析法对酵母的种类进行鉴定,用SSR分子标记的方法研究酿酒酵母的遗传多样性。【结果】从香格里拉葡萄酒产区成熟浆果上共分离到230株野生酵母,鉴定为13属18种,其中有10种酵母为香格里拉地区首次发现。用SSR分子标记的方法对香格里拉分离到的47株酿酒酵母进行遗传多样性分析,47株酿酒酵母被分为24种基因型,11个微卫星位点共检测到70个等位基因,平均多态信息含量(PIC)为0.640,平均观测杂合度(Ho)为0.166,平均期望杂合度(He)为0.693。【结论】香格里拉葡萄酒产区酵母菌资源丰富,表现出较高的物种多样性和中等程度的酿酒酵母遗传多样性。研究该产区酵母菌的多样性,为香格里拉酵母资源多样性的保护和利用奠定基础。     

贵州紫云刺葡萄自然发酵中野生酿酒酵母基因型多样性分析

[目的] 研究贵州紫云县刺葡萄自然发酵过程中野生酿酒酵母的基因型多样性,分析不同基因型酵母在不同发酵时期的动态变化,为优良酿酒酵母资源的开发利用提供理论依据。[方法] 采用Interdelta指纹图谱分析方法和微卫星分子标记法,研究贵州紫云县刺葡萄自然发酵中野生酿酒酵母的基因型多样性,并通过DPS软件分析不同基因型之间的遗传关系。[结果] 贵州紫云县刺葡萄自然发酵中共分离野生酿酒酵母75株,经Interdelta指纹图谱分析方法和微卫星分子标记法鉴定为10个基因型,其中基因型6、9、10、11、14、15、16为野生酿酒酵母独有的7个基因型,7、17和18为野生与商业酿酒酵母共有的3个基因型,此外,本研究所用其他商业酿酒酵母另有独有的9个基因型（1、2、3、4、5、8、12、13和19）。75株野生酿酒酵母中基因型17的占比最高为36%,其次为基因型10占比为13.3%。在自然发酵过程中不同基因型呈现此消彼长的变化,每一种基因型的菌株细胞密度在10⁴-10⁷ CFU/mL之间。[结论] 贵州紫云县刺葡萄自然发酵样品展现了丰富的酿酒酵母菌株基因型多样性,其中基因型10和17为主导基因型,该研究为贵州刺葡萄优良野生酿酒酵母资源的开发奠定了基础。     

贺兰山东麓优良本土酿酒酵母筛选及发酵特性分析

【背景】商业酵母的使用造成葡萄酒同质化问题严重,发掘优良本土酿酒酵母具有十分重要的意义。【目的】从168株宁夏本土酿酒酵母菌株中筛选出性能优良、具有出色葡萄酒发酵能力的菌株。【方法】基于杜氏管发酵试验和乙醇、高糖等耐受性试验分析产H2S能力及生长曲线测定的方法,筛选出发酵力好、耐受性强、低产H2S的本土酿酒酵母进行赤霞珠葡萄酒发酵试验,测定葡萄酒样基础理化指标、酚类物质和挥发性成分,探究筛选出的酿酒酵母发酵特性。【结果】初步筛选出发酵快速,能适应13%乙醇、350 g/L葡萄糖、250 mg/L SO2、pH 1.0的生存环境且低产H2S的4株本土酿酒酵母YC-E8、QTX-D17、QTX-D7、YQY-E18。菌株YC-E8产甘油能力强,所发酵酒样香气与商业酵母XR、F33最为接近,适用于赤霞珠葡萄酒的发酵。菌株QTX-D17发酵酒样中酒精、单宁、总酚和花色苷含量最高,表现出本土酿酒酵母优良的发酵特性。菌株QTX-D7所发酵酒样香气中乙酸乙酯、辛酸乙酯、1-壬醇等物质含量较高,赋予了葡萄酒香蕉味、苹果味、菠萝味、椰子味等愉悦花果香。【结论】最终筛选出3株优良本土酿酒酵母QTX-D17...     

赤霞珠葡萄酒自然发酵中酿酒酵母的菌株区分

采用Interdelta指纹图谱分析, 对分离自宁夏地区赤霞珠葡萄自然发酵过程中的45个酿酒酵母单菌落进行菌株区分, 研究发酵过程中酿酒酵母菌株的变化, 为发酵的有效控制及选育优良酿酒酵母菌株提供依据。结果发现, 本研究分离到的45个酿酒酵母单菌落中, 产生5种指纹图谱, 代表5种不同的基因型, 基因型I-V分别占所分离单菌落的71%、13%、9%、5.0%、2.0%, 基因型I是发酵过程中的优势菌株。本研究中, 二氧化硫处理影响自然发酵过程中酿酒酵母菌株的类型、数目及比例, 但其影响不是很大。     

刺梨自然发酵过程中非酿酒酵母多样性分析

【目的】分析刺梨果实自然发酵过程中非酿酒酵母菌群特征,为筛选优质刺梨非酿酒酵母提供参考。【方法】基于Illumina MiSeq高通量测序技术和WL营养琼脂鉴定培养基纯种分离技术,分析刺梨果实自然发酵1 d (F1)、3 d (F3)、5 d (F5)和15 d (F15) 4个阶段及YPD培养基富集培养样本中非酿酒酵母种群组成和多样性。【结果】高通量测序分析结果共获得182个OTUs (operational taxonomic units,OTUs),归属于81个属107个种;物种多样性分析结果表明,刺梨果实自然发酵前期,优势非酿酒酵母为汉逊酵母(Hanseniasporasp.)和伯顿丝孢毕赤酵母(Hyphopichiaburtonii),二者在样本F1中分别占42.59%和26.85%;随着自然发酵的不断进行,二者的比例逐渐降低,在第15天(F15),Hanseniaspora sp.和H. burtonii比例降低至7.73%和0.52%。相反,Pichia sporocuriosa和未培养的酵母,随着自然发酵不断进行所占比例逐渐增大,分别由F1中的0.23%和0.33%增至F15中的37.26%和32.62%。此外,采用WL营养琼脂鉴定培养基纯种分离和鉴定技术,从刺梨上分离到Hanseniasporasp.、H.burtonii、克鲁维毕赤酵母(Pichia kluyveri)、P. sporocuriosa和异常威克汉姆酵母(Wickerhamomyces anomalus) 5种类型的可培养非酿酒酵母。【结论】刺梨果实上存在着丰富的非酿酒酵母菌资源,研究刺梨自然发酵过程中非酿酒酵母多样性,为酵母资源开发和利用奠定基础。     

宁夏贺兰山东麓葡萄酒酵母菌的筛选及应用

【背景】宁夏贺兰山东麓是中国生态最佳、酿酒葡萄质量最优产区之一,也是中国“葡萄酒地理标志产品”保护区域之一。【目的】筛选宁夏本土优良酵母菌株,比较分析各个酿酒酵母菌株对赤霞珠葡萄酒香气质量的影响,并结合感官评价筛选对葡萄酒风味影响较大的酿酒酵母菌株。【方法】将筛选出的11株起酵速度快,而且对高浓度酒精、SO₂和葡萄糖及低酸环境有较强耐受力的酵母菌株进行26S rDNA鉴定,确定酵母种类。不同酿酒酵母发酵的赤霞珠葡萄酒通过顶空固相微萃取和气相色谱-质谱联用技术测定其香气化合物。【结果】筛选出11株可在15%酒精度、500 g/L葡萄糖、350 mg/L SO₂和pH 3.0环境下生长的酵母菌株,对其进行26S rDNA鉴定,确定10株酵母菌株H5、G9、G3、X8、G14、L10、H3、X11、Z17、Z24为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae),一株酵母菌L1为发酵毕赤酵母(Pichia fermentans)。测定的所有香气化合物中,酯类物质是赤霞珠葡萄酒香气物质的主要组分,其次是醇类。其中,乙酸乙酯、乙酸异戊酯、正...     

本土酵母NX11424对赤霞珠葡萄酒发酵中酵母菌多样性及香气成分的影响

【背景】NX11424酵母是一株具有良好发酵特性且能赋予赤霞珠葡萄酒浓郁果香的宁夏本土酿酒酵母。【目的】解析NX11424酵母发酵的赤霞珠葡萄酒中的水果香气特征。【方法】以赤霞珠为材料,设置3个发酵处理：自然发酵、灭菌接种NX11424的发酵和直接接种NX11424的发酵,利用26S rDNA D1/D2区测序分析法鉴定发酵过程中酵母菌的种类,并通过顶空固相微萃取和气相色谱-质谱联用技术定量测定不同发酵处理下赤霞珠葡萄酒的香气成分及含量。【结果】三个发酵处理下赤霞珠葡萄酒各理化指标无显著性差异。所分离到的酵母菌鉴定为2属3种：萄葡汁有孢汉逊酵母(Hanseniaspora uvarum)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和布拉迪酵母(Saccharomyces boulardii,S. boulardii);这2属3种均存在于自然发酵中,接种发酵中仅存在H. uvarum和S. cerevisiae两种酵母。三个发酵处理下的赤霞珠葡萄酒中香气物质种类无差异,均为69种;其中,酯类28种,醇类25种,有机酸5种,萜烯类2种和其他类化合物9种;但各发酵处理下香气物质的含量存在显著差异。聚类分析表明,69种香气成分被聚为3类。第1类香气物质包括香茅醇、丙醇等9种成分,其中7种香气物质的含量在灭菌接种发酵中较高;第2类香气物质包括己酸乙酯、棕榈酸乙酯等31种成分,其含量均在直接接种发酵中较高;第3类香气物质包括丁酸乙酯、乳酸乙酯等29种成分,其中27种香气物质的含量在自然发酵中较高。虽然直接接种发酵处理中酵母菌的多样性低于自然发酵处理,但是该处理的赤霞珠葡萄酒中酯类香气物质含量较多,水果香气浓郁,对赤霞珠葡萄酒香气的改善更明显。【结论】NX11424与发酵中的其他本土酵母间的相互作用可以改善葡萄酒的质量,为宁夏本土酵母NX11424在赤霞珠葡萄酒酿造过程中改善葡萄酒质量奠定了坚实的基础。     

采用新型药物抗性选育高效黄酒酵母菌株

【目的】黄酒酵母菌种是影响大罐黄酒生产效率的关键因素之一,高发酵性能黄酒酵母的选育对于提升黄酒生产效率具有重要的实用意义。【方法】以一种药物抗性为基础设计快速初筛方法,对黄酒酿酒酵母XY进行诱变筛选得到克霉唑(CTZ)抗性的黄酒酵母突变株,进一步以酵母发酵性参数为指标筛选得到发酵速率提高的黄酒酵母新菌株XY-3。【结果】比较突变菌株与原始菌株酿造性能发现,XY-3菌株最大发酵速率较原始菌株提高5.21%。黄酒酿造小试结果显示发酵前4天XY-3菌株乙醇生成速率明显高于原始菌株,其最大乙醇生成速率从XY菌株的14.77 g/d提高到15.30 g/d。XY-3酵母菌株发酵速率的提高能够缩短黄酒发酵周期1-2天,有助于提高发酵设备的利用效率。进一步研究发现XY-3发酵速率的提升可能与XY-3菌株多药物抗性(PDR)有关。【结论】联合使用传统诱变和药物抗性筛选策略选育得到高效黄酒酵母新菌株,这种筛选策略也为发酵食品行业优良菌株的选育提供了一种新的思路。     

中条山野生葡萄产香酵母的筛选及其混菌发酵对葡萄酒香气成分的影响

【背景】产香酵母可赋予葡萄酒独特的香气,因此,分离筛选优良产香酵母对酿造具有地域风味的特色葡萄酒具有重要意义。【目的】从中条山野生葡萄中筛选产香酵母,进行种群鉴定和生理生化特性研究,并将其应用于葡萄酒发酵过程,研究其对葡萄酒香气成分的影响。【方法】采用稀释涂布平板法从中条山野葡萄中分离筛选酵母菌,对其进行分子生物学鉴定。优选其中具有显著香气的产香酵母,与酿酒酵母F15进行混合发酵,采用气相色谱质谱联用(gas chromatograph-mass spectrometer,GC-MS)对香气成分进行分析,采用半定量法测定香气成分含量。【结果】共分离获得各种菌株13株,26S rRNA基因D1/D2区序列分析表明它们分布于Issatchenkia、Torulaspora、Pichia、Saccharomyces和Rhodotorula等5个不同属内。优选其中一株香气较为浓郁的酵母菌株Issatchenkia orientalis strain XS-6开展研究,结果发现该菌株最高耐受乙醇浓度为8%,最高耐受NaCl浓度为6%,最适生长温度为38℃。与酿酒酵母F15混菌发酵的葡萄酒中共检测出31种香气成分。香气物质总含量较单菌发酵增加19.8%,其中11种香气成分含量增加明显,尤其是具有玫瑰香气的苯乙醇。醇类与酯类物质含量较单菌发酵增加19.6%,并发现了香草酸乙酯(ethyl vanillate)、邻苯二甲酸二丁酯(dibutyl phthalate)等7种新的酯类物质。【结论】产香酵母XS-6对乙醇、NaCl、温度等具有良好的耐受性,而且与酿酒酵母F15混菌发酵对西拉葡萄酒香气成分具有明显的影响,可能在改善葡萄酒风味方面具有潜在的应用价值。     

商业酵母在不同品种葡萄酒工业化生产中的定殖差异

[背景]酵母菌在葡萄酒酿造中起到重要的作用,接种商业活性干酵母(active dry yeast,ADY)进行葡萄酒酿造在国内较为普遍,然而商业酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)对我国本土酵母菌资源的影响及二者竞争关系的相关报道不多.[目的]比较商业酿酒酵母在不同品种葡萄酒工业化生产中的定殖差...     

Genetic diversity in commercial wineries: effects of the farming system and vinification management on wine yeasts

Aims: Analysis of the diversity and distribution of wine yeasts isolated from organically and conventionally grown grapes, and during the subsequent fermentation with or without starter cultures in six different commercial wineries. Methods and Results: PCR‐RFLP screening of isolates revealed the involvement of ten different species. Saccharomyces cerevisiae, scarcely isolated from grapes, was the dominant species during the latter phases of fermentation, identifying 108 different genotypes by means of SSR analysis. Species and strains’ diversity and presence were strongly influenced by the farming system used to grow the grapes and the system of vinification. Conclusions: Organic farming management was more beneficial in terms of diversity and abundance than the conventional one. Induced fermentation generated a great replacement of native yeasts. Although winery‐resident yeasts resulted to be predominant in the process, some noncommercial strains originally in the vineyard were found in final stages of the fermentation, confirming that autochthonous strains of S. cerevisiae are capable to conduct the fermentation process up to its end. Significance and Impact of the Study: The study of natural yeast communities from commercial vineyards and wineries is an important step towards the preservation of native genetic resources. Our results have special relevance because it is the first time that the real situation of the yeast ecology of alcoholic fermentation in commercial wineries belonging to the relevant wine‐producing Appellation of Origin ‘Vinos de Madrid’ is shown.     

松萝内生酿酒酵母菌株耐酸生理特性与分子机制探究

【目的】对我国西藏地区来源的不同酵母菌株进行有机酸发酵性能测试,此外,对具有良好产酸性能的分离自松萝内部的酿酒酵母菌株Saccharomy cescerevisiae 2-2进行耐酸性能分析,并探究其耐酸较强的分子机制。【方法】比较不同糖浓度培养基液体发酵培养过程中pH的变化,并比较低pH胁迫条件下菌株的生长,检测酿酒酵母菌株的产酸潜力和耐酸特性;对菌株2-2和模式酵母菌株S288C进行比较基因组分析,并利用实时荧光定量聚合酶链式反应(real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)分析关键基因的转录,探究菌株2-2耐酸分子机制。【结果】松萝内生酿酒酵母2-2在所有检测的菌株中产酸潜力较大,耐酸性能较好。在菌株2-2中与胁迫耐受性相关的基因PDR15、PDR12和SUR1在低pH胁迫条件下存在显著的上调或下调,但这些基因转录变化趋势与菌株S288C相反。【结论】松萝内生酿酒酵母2-2是一株产酸耐酸性能较好的菌株,对其独特的调节机制进行深入分析,有希望选育性能更好的产酸酵母菌株。     

酒醅来源酵母菌合成异戊醇能力与途径解析

【背景】异戊醇是酵母菌在白酒发酵过程中通过氨基酸合成代谢途径和氨基酸分解代谢途径合成的主要高级醇,其含量影响白酒饮用的舒适度。【目的】分析和比较分离自浓香型白酒酒醅中的酵母菌合成异戊醇的能力,揭示酵母菌合成异戊醇的途径。【方法】从酒醅中分离具有异戊醇合成能力的酵母菌株,比较不同生长时期酵母菌合成异戊醇的能力,通过前体物代谢分析它们合成异戊醇的途径。【结果】分离自酒醅的5株酵母的异戊醇合成能力从强到弱依次为Naumovozyma castellii JP3-1、Saccharomyces cerevisiae JP3、Pichia fermentans JP22、Pichia kudriavzevii JP1和Naumovozyma dairenensis CBS421。这些酵母合成异戊醇的时期主要在对数生长期,N. castellii JP3-1、P. fermentans JP22和N. dairenensis CBS421在稳定生长期也合成异戊醇。S. cerevisiae JP3、N. castellii JP3-1和N. dairenensis CBS421在整个生长时期主要通过Harris途径合成异戊醇;P. kudriavzevii JP1在整个时期主要通过Ehrlich途径合成异戊醇;P. fermentans JP22在对数生长期通过Harris途径和Ehrlich途径合成异戊醇的能力接近,在稳定生长期主要通过Harris途径合成异戊醇。【结论】本研究揭示了酒醅来源5个属种酵母合成异戊醇的途径、能力与其生长时期的关系,研究结果可为解析浓香型白酒发酵过程异戊醇合成、积累机制及实施白酒发酵过程异戊醇合成的精准调控提供理论依据。     

Truth in wine yeast

Evolutionary history and early association with anthropogenic environments have made Saccharomyces cerevisiae the quintessential wine yeast. This species typically dominates any spontaneous wine fermentation and, until recently, virtually all commercially available wine starters belonged to this species. The Crabtree effect, and the ability to grow under fully anaerobic conditions, contribute decisively to their dominance in this environment. But not all strains of Saccharomyces cerevisiae are equally suitable as starter cultures. In this article, we review the physiological and genetic characteristics of S. cerevisiae wine strains, as well as the biotic and abiotic factors that have shaped them through evolution. Limited genetic diversity of this group of yeasts could be a constraint to solving the new challenges of oenology. However, research in this field has for many years been providing tools to increase this diversity, from genetic engineering and classical genetic tools to the inclusion of other yeast species in the catalogues of wine yeasts. On occasion, these less conventional species may contribute to the generation of interspecific hybrids with S. cerevisiae. Thus, our knowledge about wine strains of S. cerevisiae and other wine yeasts is constantly expanding. Over the last decades, wine yeast research has been a pillar for the modernisation of oenology, and we can be confident that yeast biotechnology will keep contributing to solving any challenges, such as climate change, that we may face in the future.     

谷物蛋白对白酒发酵过程中微生物群落及其代谢多样性的调控

[背景] 在白酒发酵过程中,原料中的谷物蛋白可为微生物的生长提供氮源等营养物质,进而形成多种代谢产物。谷物蛋白可分为清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白。然而,谷物蛋白对微生物多样性及其代谢产物多样性的调控尚不明确。[目的] 揭示白酒发酵过程中与微生物多样性及其代谢产物多样性显著相关的关键谷物蛋白种类及其调控作用。[方法] 通过Osborne法测定不同品种高粱中谷物蛋白的组成;采用多组学联用技术解析4种高粱在发酵过程中的微生物菌群多样性及代谢产物多样性;通过模拟发酵揭示原料中影响微生物群落及其代谢多样性的关键蛋白。[结果] 4种高粱中的谷物蛋白组成存在显著差异（ANOSIM：R=0.85,P=0.001）;4种高粱在发酵第5天时,S4高粱的细菌多样性显著（P<0.05）高于其他3种高粱,S3高粱中微生物的代谢产物多样性显著（P<0.05）高于其他3种高粱;清蛋白和球蛋白含量与发酵第5天的优势细菌多样性（R²=0.34,P<0.05;R²=0.58,P<0.05）和代谢产物多样性呈显著正相关（R²=0.58,P<0.05;R²=0.36,P<0.05）,被定义为关键蛋白;模拟发酵实验验证了优势细菌多样性和代谢产物多样性可随着2种关键蛋白即清蛋白和球蛋白含量的升高而升高。当清蛋白含量在3.0 g/L时,优势细菌多样性及代谢产物多样性可分别达到0.72和0.65;当球蛋白含量在3.0 g/L时,优势细菌多样性及代谢产物多样性可分别达到0.66和0.81。[结论] 研究揭示了酿造原料中的清蛋白和球蛋白对发酵过程中细菌多样性及代谢产物多样性的调控作用,为提高白酒发酵的可控性及质量提供了依据。     

Killer phenotype of indigenous yeasts isolated from Argentinian wine cellars and their potential starter cultures for winemaking

Of 31 yeasts, from different surfaces of two cellars from the northwest region of Argentina, 11 expressed killer activity against the sensitive strain Saccharomyces cerevisiae P351. Five of these killer yeasts were identified as S. cerevisiae by phenotypic tests and PCR-RFLP analysis. Two S. cerevisiae killer strains, Cf5 and Cf8, were selected based on their excellent kinetic and enological properties as potential autochthonous mixed starter cultures to be used during wine fermentation. They could dominate the natural microbiota in fermentation vats and keep the typical sensorial characteristics of the wine of this region.