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1.
D.radiodurans CatB基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达 总被引:1,自引:0,他引:1
通过生物信息学方法从耐辐射奇球菌(D.radiodurans)全基因组居库中查鼠并克隆了编码过氧化氢酶(Cartalase,Cat)的1611bp长CatB基因,将CatB基因连人pKK223-3表达载体,转化Cat酶链陷型大肠杆菌(E.coli UM2)。转化菌裂解液PAGE酶活性染色分析实物具有Cat酶活性,电泳过移位置与CatB位置相符。D.radiodurans CatB基因的表达可使E. 相似文献
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点状产气单胞菌脯氨酰内肽酶在大肠杆菌中的高效表达 总被引:1,自引:0,他引:1
采用PCR分段克隆法将点状产气单胞菌点状亚种(Aeromonas puctata subsp.jpuctata)脯氨酰内肽酶(prolyl endopeptidase,apPEP)的编码区基因分成3段扩增并拼接成编码690个氨基酸的完整基因apPEP,将其克隆在表达载体pBL和pKKH上,构建成温度和IPTG诱导型高效表达apPEP的重组大肠杆菌BL21/pBL-PEP和BL21/pKKH-PEP 相似文献
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植物表达载体pKC—3的构建及大分子DNA连接策略 总被引:5,自引:1,他引:5
以根癌农杆菌双元载体pCAMBLA1300为基础,先后连接含有马铃薯蛋白酶抑制剂-Ⅱ基因(PⅡ)、苏云金杆菌毒蛋白基因(B.t cryI(A))及雪花莲外源凝集素基因(GNA)的完整表达片段,构建了抗多种稻田害虫的表达载体pKC-3,将其导入根癌农杆菌LBA4404,可进一步用于水稻抗虫基因转化的研究。载体构建进程采用多次的大分子DNA片段连接,总结出了一套适合大片段连接转化的可行策略。 相似文献
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地中海拟无枝菌酸菌(Amycolatopsismediterranei)U32是一种临床上重要的抗生素———力复霉素SV的产生菌。研究表明,在地中海拟无枝菌酸菌的力复霉素生物合成过程中,3氨基5羟基苯甲酸合成酶(AHBAS)是合成中间体C7N母核(又称AHBA)的关键酶。通过筛选以广宿主粘粒(Cosmid)pLAFR3为载体构建的地中海拟无枝菌酸菌U32的基因文库,获得6个阳性克隆子。将含有AHBAS基因的约25kb的片段克隆到pBluescriptⅡSK和KS上,进行酶谱分析得到其在染色体上的初步定位。序列测定表明地中海拟无枝菌酸菌U32中的AHBA合成酶基因,由1167bp组成,起始密码子为ATG,终止密码子为TGA,共编码388个氨基酸,所克隆到的AHBA合成酶基因在大肠杆菌的启动子控制下获得诱导表达,蛋白分子量约为43kD。 相似文献
6.
利用合成的寡聚核苷酸片段,从质粒pOS1000中分离出具有适合克隆位点的苏云金芽孢杆菌(Bacilusthuringiensis)δ内毒素cryIA(c)全长基因。将该基因与大肠杆菌表达载体pKK2233重组,并引入大肠杆菌JM109中,经IPTG诱导,获得了超量表达的CryIA(c)蛋白。将cryIA(c)全长基因插入链霉菌表达载体pHZ1272中,得到重组质粒pHZ1256,将该质粒引入变铅青链霉菌(Streptomyceslividans)JT46中,经硫链丝菌素诱导,通过Westernbloting测定表明,重组变铅青链霉菌JT46(pHZ1256)已表达出相应的CryIA(c)蛋白。杀虫试验表明,大肠杆菌和链霉菌所表达出的δ内毒素CryIA(c)对小菜蛾均有毒杀作用,其致死率分别为93%和57%。 相似文献
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将大鼠酰胺化酶的信号肽及前导肽编码序列引入昆虫核多角体病毒转移表达载体,构建PABChGRF(Gly)、PABCIGFI融合基因的昆虫细胞分泌表达质粒pBacPAG2、pBacPAI,并与经修饰的银纹夜蛾核多角体病毒BacPAK6线性化DNA共转染秋粘虫细胞Sf21,通过同源重组、筛选和鉴定,得到它们的重组病毒BacPAG、BacPAI。将重组病毒感染Sf21细胞,PABChGRF(Gly)和PABCIGFI均得到有效外泌表达,表达产物通过IgGSepharose柱可获得快速纯化。 相似文献
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大肠杆菌精氨酰—tRNA合成酶的变种ArgRS306KR的纯化… 总被引:1,自引:1,他引:0
本文从含ArgRS306KR基因args306KR的pUC18重组质粒的大肠杆菌TG1转化子中经DEAE-Sephacel和Blue-Sepharose两步柱层析,得到电泳一条带的ArgRS306KR。纯酶的比活为2790单位/毫克。该酶氨酰化和ATP-PPi交换活力的最适PH分别为PH8.3和PH7.5。氨酰化活力对ATP、Arg和tRNA的Km分别2.6mmol/L、14.0μmol/L和5. 相似文献
9.
葡萄糖异构酶(glucoseisomerase,GI)是使用量最大的工业酶之一,可用于高果糖浆的生产,也可以用含木聚糖物质及废料为底物发酵生产乙醇,具有重要的经济价值.本文选择了表达载体pBV220[1],利用PCR方法删除了原表达质粒pTKDGI1中GI结构基因5′端多余的核苷酸,并添加了合适的酶切位点,重新构建了能在大肠杆菌DH5α中高效表达GIG138P的表达质粒pBZGI1.传代实验表明,新表达体系的稳定性明显优于原表达体系.粗酶液经热处理、DEAESepharoseFF和分子筛Se… 相似文献
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对pGEX系列表达载体的多克隆位点(MCS)进行了改造,改造前MCS上仅有BamHI、SmaI和EcoRI三个酶切位点。改造后的MCS上含有8个酶切位点,它们分别是BamHI、SacI、AvaI、XhoI、BglⅡ、pstⅠ、KpnI和EcoRI,改造后构建形成的pGEX-L系列载体对目的基因的插入有更强的适应性。 相似文献
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青蒿转杜松烯合成酶基因发根系的培养 总被引:10,自引:2,他引:8
将已克隆的棉花杜松烯合成酶的cDNA(cadC14)插入到植物表达载体pBI121中,构建含CaMV35S启动子驱动下的杜松烯合成酶基因的植物表达载体pBIC14。用含pBIC14质粒的发根农杆菌(Agrobacteriumrhizogenes)15834感染青蒿(ArtemisiaannuaL.)叶片并诱导发根,共建立121个生长迅速的发根系。经浓度为20mg/L的Kan筛选,获得12个抗Kan阳性根系。PCR和Southernbloting分析表明,外源杜松烯合成酶基因已整合到青蒿基因组中,其转基因频率为3%。RTPCR分析表明,外源杜松烯合成酶基因在C37根系中,在转录水平上已有表达。 相似文献
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欧文氏菌2-酮基醛糖还原酶基因敲除的研究 总被引:4,自引:0,他引:4
根据已知基因序列,利用PCR技术,从克隆质粒和欧文氏菌(Erwinia sp.)SCB125染色体中重新扩增得到含有2-酮基醛糖还原酶A和B(2-KRA和B)基因的片段,分别用于基因表达和敲除。用于表达的片段定向连接到表达载体pBL并转化大肠杆菌BH5α后,获得高酶活表达。在证实发生了突变的基因表达产物仍具有酶活的基础上,对其进行基因敲除的研究。在体外将链霉素抗性基因插入到tkrA内部使其突变失活 相似文献
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噬菌体T7溶菌酶及其融合蛋白在大肠杆菌中的表达 总被引:3,自引:0,他引:3
以噬菌体T7DNA为模板,PCR扩增T7溶菌酶基因,插入pBluescriptSK载体中,DNA序列分析表明,克隆的T7溶菌酶基因和已报道的序列无氨基酸水平上的差异。将T7溶菌酶基因分别拼接在烟草病原相关蛋白(PR1b)信号肽编码序列的3’末端和马铃薯卷叶病毒外壳蛋白(PLRVCP)基因靠近3’末端处,构建成两个融合蛋白基因。将T7溶菌酶及其融合蛋白基因插入大肠杆菌表达载体pBV221,蛋白电泳及溶菌实验表明,T7溶菌酶基因在大肠杆菌中高效表达,其产物的表达量占菌体可溶性蛋白的20%以上,PLRVCP的表达量并没有因C端融合T7溶菌酶而提高,高等植物的信号肽在大肠杆菌中也能起分泌信号作用。 相似文献
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对酵母NMT基因在大肠杆菌中表达进行较详细的研究,进而构建了复制子为p15A并含卡那霉素抗性基因的相容性表达质粒pKZMT,将其与表达质粒pCZmCα1共转化进大肠杆菌BL21(DE3)F′,进行双质粒表达偶联加工修饰研究,其中pCZmCα1表达底物蛋白小鼠cAMP依赖的蛋白激酶催化亚基α(PKA-mCα)。SDSPAGE及Westernblot分析表明,双质粒表达系统中,PKA-mCα都得到了稳定的高表达,尤其在23℃低温诱导表达时,表达产物的可溶性部分明显增多;而酵母NMT被控制在有利于活性功能的可溶性低水平表达。[3H]myristicacid标记测定及放射自显影的结果显示,在大肠杆菌中表达的重组PKA-mCα被豆蔻酰化修饰。 相似文献
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大鼠甘氨肽α—羟化单氧酶在昆虫细胞中的活性表达 总被引:2,自引:0,他引:2
将编码大鼠甘氨肽α-羟化单氧酶(PHM)cDNA基因,插入昆虫杆状病毒转移表达载体pBacPAK8,构建成表达质粒pBacPHM2,与修饰的银纹夜蛾核多角体病毒BacPAK6线性化DNA共转染秋粘虫细胞Sf21,通过同源重组,得到在核多角体蛋白基因启动子控制下的PHM基因的重组病毒BacPHM。用BacPHM感染Sf21细胞,无血清培养上清在72小时后检测到酰胺化酶最高活力;用细胞免疫组化法和免疫 相似文献
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大肠杆菌精氨酰—tRNA合成酶的Lys306为酶活力所必需 总被引:2,自引:2,他引:0
将大肠杆菌精氨酰tRNA合成酶(ArgRS)上Lys306用基因点突变的方法分别变为Ala和Arg的密码子,得到变种基因args306KA和args306KR。变种基因重组在pUC18上,转化到大肠杆菌TG1中,转化子中ArgRS及其变种ArgRS306KA和ArgRS306KR所表达的蛋白量生活为TG1表达ArgRS蛋白量的100倍。细胞粗抽提液中ArgRS的比活TG1,转化子pUC18-arg 相似文献
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将大肠杆菌精氨酰tRNA合成酶(ArgRS)上Lys306用基因点突变的方法分别变为Ala和Arg的密码子;得到变种基因args306KA和args306KR。变种基因重组在pUC18上,转化到大肠杆菌TG1中,转化子中ArgRS及其变种ArgRS306KA和ArgRS306KR所表达的蛋白量至少为TG1表达ArgRS蛋白量的100倍。细胞粗抽提液中ArgRS的比活TG1、转化子pUC18-args、pUC18-args306KA和pUC18-args306KR分别为1.65、210、1.8和38单位/毫克。结果表明ArsRS的Lys306为Ala取代使活力完全丧失;若被Arg取代,则活力丧失80%以上。Lys306为ArgRS活力所必需。 相似文献
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芝田硫化叶菌麦芽寡糖基海藻糖合酶基因在大肠杆菌中的克隆和表达 总被引:6,自引:0,他引:6
用PCR 方法从芝田硫化叶菌中扩增了编码一种新酶,即麦芽寡糖基海藻糖合酶( MTSase) 的基因,扩增的2-2kb DNA 插入到原核表达载体pBV220 中,构建成重组质粒pSBGT1 。pSBGT1 中MTSase 基因在大肠杆菌中得到表达。SDSPAGE 分析表达产物MTSase蛋白的分子量约为74kDa ,同核苷酸序列测定所推导的值相符。表达产物占细胞总蛋白约4-4 % 。pSBGT1 产生的重组酶作用于淀粉部分水解物,使DE 值降低,得到非还原糖或低还原糖。 相似文献
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东亚钳蝎神经毒素在大肠杆菌中的表达 总被引:2,自引:0,他引:2
以山西风陵渡东亚钳蝎(ButhusmartensiKarsch)的尾腺总RNA为模板,根据已知的蝎神经毒素保守氨基酸序列设计引物,利用PCR技术,扩增并克隆了两个蝎神经毒素基因.序列分析表明,由两个基因导出的氨基酸序列(BmKMm1和BmKMm2)与已知的蝎神经毒素BmKⅠ、BmKⅡ、BmKⅢ、BmKM1、BmKM9有很高的同源性.将BmKMm2基因重组到大肠杆菌分泌型表达载体pExSec1中进行表达.SDS-PAGE证明表达产物被分泌到细胞周间质及培养液中.经IgG-Sepharose纯化后的蛋白质注射小白鼠表明表达产物有生物学活性 相似文献
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抗结肠癌相关抗原单链抗基因的构建和表达 总被引:3,自引:2,他引:1
通过PCR扩增和酶切分别得到抗结肠癌相关抗原抗体的重链可变区序列,轻链可变区序列及连接肽序列,将它们构建成为VH-linker-VL形式的单链抗体基因片段,并在大肠杆菌中进行了表达,SDS-PAGE分析结果表明,以pComb3为载体,在大肠杆菌JM83中,scFv未获得有效表达,而以pET-22b(+)为载体的scFv在大肠杆菌BL21(DE3)中,30℃诱导培养获得了高效表达,表达水平占全菌蛋白 相似文献