重组人白细胞介素4的纯化及N端氨基酸序列分析

本文对重组人白细胞介素4高效表达克隆pBV220/hIL-4a的表达产物进行了纯化,升对纯化的人IL-4进行了N端氨基酸序列分析。人IL-4基因表达产物在大肠杆菌中以不溶性包涵体形式存在,经过超声破菌、包涵体抽提、复性浓缩、离子交換和凝胶过滤层析一系列纯化步骤,终产物纯度达98％以上,按蛋白总量计算回收率为14％,比活性达2×10~6单位/mg蛋白。通过测定纯化人IL-4的N端16个氮基酸序列,与由其DNA序列推导的氨基酸序列完全一致。本文为重组人IL-4的批量生产奠定了基础。     

注射用重组人干扰素βser17的分离纯化及鉴定

重组人干扰素βser17(rhIFN βser17)工程菌经发酵培养后,采用高压匀浆破菌、离心分离包涵体、有机抽提、酸沉淀、SephacrylS -200、SephadexG -75等进行分离纯化,通过各种方法对终产品进行鉴定。结果显示,纯化的rhIFN- βser17比活性超过 2×107IU/mg,纯度超过 99%,其它各项质量指标均符合质量标准。通过研究建立了大规模制备rhIFN- βser17的纯化工艺,研制出了符合规程要求的注射用rhIFN -βser17纯品,为临床研究奠定了基础。     

重组人干扰素α2b的提取和纯化

为了提高重组人干扰素α2b的质量 ,增加产量 ,降低成本 ,通过破菌 ,包涵体提取 ,离子交换层析 ,凝胶过滤等纯化方法制备干扰素纯品。结果表明干扰素纯度可达 95%以上 ,比活达到 1.2× 10 8IU/mg以上。结果提示 ,采用本方法收率高 ,纯度好 ,工艺稳定 ,适合大规模生产     

大肠杆菌表达的重组人GM-CSF的纯化

本文对重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-CSF)高效表达克隆pZW.GM的表达产物进行纯化,并对纯化的人GM-CSF进行了N端氨基酸序列分析。人GM-CSF基因表达产物在大肠肝菌中以不溶性包涵体形式存在,经超声破菌、包涵体抽提、凝胶过滤层析、复性、离子交换一系列纯化步骤,终产物纯度达99％,按蛋白总量计算回收率达10％,比活性达1×10~7u/mg蛋白质。通过测定纯化人GM-CSF的N端16个氨基酸序列,与由其DNA序列推导的氨基酸序列完全一致。     

重组人α8型干扰素的纯化与鉴定

采用酵母表达载体进行重组人α８型干扰素（ＨｕＩＦＮα８）的表达,该表达菌株可将重组α８型干扰素分泌进入培养基中,回收培养基进行纯化,然后利用超滤浓缩,先过Ｓ．ＳｅｐｈａｒｏｓｅＦＦ柱,再进行ＤＥＡＥ-ＳｅｐｈａｒｏｓｅＦＦ层析和Ｇ-２５脱盐,最后用高效液相ＨＰＬＣ,ＳＤＳ-ＰＡＧＥ丙烯酰胺凝胶电泳及肽图等方法对纯化产品进行鉴定。采用以上两步纯化方法纯化酵母分泌表达的重组人α８型干扰素纯度可达９５％以上,其比活性为３.０×１０^８ｕ／ｍｇ。     

人γ－干扰素生产工艺的研究

采用高密度发酵法发酵重组人γ－干扰素产生菌SW－INF／DH5α并成功地获得高表达、高产量的菌体,表达的γ－干扰素蛋白占菌体总蛋白的60％以上,20L发酵液可收获2kg(湿重)菌体。纯化过程中采用尿素抽提、稀释、复性、浓缩后通过Sephacryl S-200柱的纯化方法。简化了纯化步骤,缩短周期,提高了蛋白回收率。纯化中来采用单抗亲和层析技术,使产品更为安全可靠。最终产品经SDS－PAGE检测纯度达100％,核酸含量和热原均合格,A280／A260>1．5．比活性达1×10⁷IU／mg,总回收率达40％。这说明整个工艺适宜大规模生产的需要,具有实际应用价值。     

人γ－干扰素生产工艺的研究

采用高密度发酵法发酵重组人γ干扰素产生菌ＳＷＩＮＦ／ＤＨ５α并成功地获得高表达、高产量的菌体,表达的γ干扰素蛋白占菌体总蛋白的６０％以上,２０Ｌ发酵液可收获２ｋｇ（湿重）菌体。纯化过程中采用尿素抽提、稀释、复性、浓缩后通过ＳｅｐｈａｃｒｙｌＳ２００柱的纯化方法,简化了纯化步骤,缩短周期,提高了蛋白回收率。纯化中未采用单抗亲和层析技术,使产品更为安全可靠。最终产品经ＳＤＳＰＡＧＥ检测纯度达１００％,核酸含量和热原均合格,Ａ２８０／Ａ２６０＞１５,比活性达１×１０７ＩＵ／ｍｇ,总回收率达４０％。这说明整个工艺适宜大规模生产的需要,具有实际应用价值。     

在毕赤酵母中表达的重组人血管内皮生长因子(rhVEGF121)为氨基端4个氨基酸缺失的异构体

为获得重组人血管内皮生长因子 ,采用重叠PCR扩增出含Kozak顺序、α因子前导肽和hVEGF12 1的融合基因 ,经DNA测序无误后 ,插入Pichiapastoris酵母载体 ,并体外构建 4拷贝表达单元质粒pAO81 5 4KαVEGF12 1。表达载体转化酵母宿主菌GS1 1 5 ,筛选出高效表达hVEGF的转化子。摇瓶培养并 1 %甲醇诱导 80h的VEGF分泌性表达量可达 30mg L。表达产物经S Sepharose离子交换层析纯化后测活表明表达产物二聚体具有良好生物活性。SDS PAGE分析、Western印迹表明表达产物具有适宜的分子量和抗原性。VEGF蛋白经氨基端氨基酸测序证实纯化后的不同糖化程度产物为同一蛋白质 ,但均为氨基端缺失了 4个氨基酸的全长为 1 1 7个氨基酸的VEGF。     

大肠杆菌表达的重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子的纯化

对重组人粒细胞－巨噬细胞集落刺激因子（ｒｈＧＭ－ＣＳＦ）高效表达克隆ｐＺＷ．ＧＭ的表达产物进行了纯化,并对纯化的ＧＭ－ＣＳＦ进行了Ｎ端氨基酸序列分析。人ＧＭ－ＣＳＦ基因表达产物在大肠杆菌中以不溶性包涵体形式存在,经过超声破菌、包涵体抽提、凝胶过滤层析、复性、离子交换一系列化步骤,终产物纯度达９９％,按蛋白总量计算回收率达１０％,比活性达１×１０＾７ｕ／ｍｇ蛋白质。通过测定纯化人ＧＭ－ＣＳＦ的Ｎ端１     

无标签重组人硫氧还蛋白的大规模表达、纯化及活性检测

目的:利用基因工程的方法原核表达无标签的重组人硫氧还蛋白(rhTrx)并对其进行大规模表达、纯化和鉴定.方法:从人胚胎肾HEK293细胞中提取总RNA,反转录合成cDNA,经PCR扩增、酶切后连入pET-22b(+)载体构建重组质粒,重组质粒转化大肠杆菌BL21( DE3)感受态细胞,IPTG诱导表达,经两步离子交换层析纯化重组蛋白,采用SDS-PAGE、Western blotting、HPLC、MALDI-TOF-MS及经典的胰岛素二硫键还原法对重组蛋白进行鉴定.结果:构建成功了rhTrx基因表达载体;实现了rhTrx在原核细胞中的可溶性表达;纯化出的蛋白经SDS-PAGE和Western blotting分析证实为rhTrx;HPLC和MALDI-TOF-MS分析表明,纯化出的目的蛋白纯度大于95％;胰岛素二硫键还原法证实纯化出的rhTrx具有生物学活性.结论:成功构建了rhTrx的原核表达体系,建立了rhTrx的纯化和鉴定方法,为其进一步的理论研究和生产开发提供了有效基础数据.     

蛋壳内膜分解菌所产蛋白酶的纯化及其N-末端氨基酸序列测定

从土壤中分离得到的1株产蛋壳内膜分解酶(ESM protease)的铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa).通过对其发酵液进行饱和硫酸铵盐析,二次离子交换层析得到蛋壳内膜分解活性达到304.5 U/mg的目标蛋白,SDS-PAGE电泳显示该酶分子量约为32 kD,通过测定其N-末端15个氨基酸残基为:Ala、Glu、Ala、Gly、Gly、Val、Ala、Gly、Lys、Glu、Asp、Ala、Ala、Glu和Leu.     

聚乙二醇重组人干扰素及其药品通用名称命名

越来越多的聚乙二醇修饰蛋白研发上市。为适应这类制品的发展,与之相关的中国药品通用名命名原则也需要不断更新。介绍了PEG修饰蛋白技术的发展以及WHO国际非专利药品名（INN）命名委员会对这类制品的命名情况,讨论了我国对这类制品的命名原则和方法。     

Purification and Amino Terminal Sequencing of Human Melanoma Nerve Growth Factor Receptor

Abstract: The nerve growth factor (NGF) receptor, solubilized with Triton X-100 detergent, has been purified from human melanoma cell line A875. Purification to near-homogeneity was achieved by chromatography on wheat germ agglutinin-agarose, followed by immunoaffinity chromatography on Sepharose columns coupled with anti-NGF receptor monoclonal antibody (MAb). The purified receptor, a 75, 000-dalton protein, retains the capacity to bind NGF as well as anti-receptor MAbs. Final purification was achieved by sodium dodecyl sulfate-polyacryiamide gel electrophoresis. The sequence of amino acid residues at the amino terminus has been determined. Possible sequence homology between the NGF receptor and several other proteins is discussed. Using the purified receptor as immunogen, new MAbs to the NGF receptor have been produced. The NGF receptor was visualized by immunoperoxidase staining in tissue sections of dorsal root ganglia from monkeys.     

重组人促红细胞生成素中试纯化工艺研究

采用堆积床生物反应器,用无血清培养基培养分泌ｒｈＥＰＯ的工程细胞株ＸＰ９５０１。所收集的上清液,经过快速离子交换层析—反相—分子筛层析纯化后,所得ＥＰＯ纯度达９９％以上,比活性为１－５×１０５ＩＵ／ｍｇ。整个纯化全过程的ＥＰＯ体内活性回收率为４６％。所纯化的ＥＰＯ分子量为３６ｋｄ,等电点为３－５。免疫印迹证明其有天然ＥＰＯ的免疫原性,Ｎ端１５个氨基酸序列分析与文献报道一致。本纯化工艺路线简单,时程短,重复性好,适合于大规模生产重组人促红细胞生成素。     

分泌型重组人生长激素工程菌发酵及其产物纯化

在 5L发酵罐中将工程菌pET-ompA3-hGH/BL21(DE3)进行补料式发酵 ,诱导表达分泌型重组人生长激素。通过对发酵培养基成分、补料成分、补料体积、补料时机和滴加流速的选择 ,分泌表达rhGH的量可达到 250mg/L ,占周质蛋白的 44%～ 54% ,发酵周期缩短为8h。用rhGH纯蛋白免疫动物制备的多克隆抗体制成的抗体亲和层析柱 ,一步纯化大肠杆菌周质中分泌表达的rhGH ,产物纯度达到96%以上 ,纯化产物在分子质量大小、免疫活性和二硫键的形成与天然生长激素相一致 。     

Characterization of Human Brain S100 Protein Fraction: Amino Acid Sequence of S100β

Two major components of human brain S100 fraction were purified by HPLC and an amino acid sequence was elucidated for the S100 beta component. Human S100 proteins showed absorption spectra and amino acid compositions similar to S100 alpha and S100 beta from bovine brain. However, the relative amounts of the human proteins were 4% S100 alpha and 96% S100 beta by weight, while the bovine protein distribution was 47% S100 alpha and 53% S100 beta by weight. An amino acid sequence of human S100 beta was established by analysis of overlapping fragments generated by cyanogen bromide and trypsin cleavage. Three amino acid sequence differences between the human and bovine S100 beta were found at residues 7, 62, and 80. These differences were chemically conservative and compatible with minimum single base changes in the codon structures. These results document that S100 beta is a conserved protein among mammals and provide the necessary foundation for current clinical studies.