从大容量噬菌体抗体库中筛选抗DNA-PKcs单链抗体

目的：从单链大容量噬菌体抗体库中筛选特异性的抗DNA-PKcs的人源抗体,用于肿瘤治疗或诊断目的。方法：经抗原性分析及BLAST比对,选定人DNA-PKcs蛋白中抗原性高且与其他蛋白没有同源性的片段,进行原核表达及纯化后将其固定在抗原管上,通过4轮“吸附－洗脱－扩增”过程从大容量抗体库中筛选特异性抗体,转化HB2151菌,制备抗DNA-PKcs的可溶性单链抗体;ELISA检测抗原-抗体结合活性。结果：经生物信息学分析,确定抗原性高且与其他蛋白没有同源性的DNA-PKcs片段DPK3（250个AA）、DPK4（257个AA）。经过4轮筛选,获得26个特异性结合DPK3及31个特异结合DPK4的克隆,指纹分析分别有5种和21种不同的可变区片段;成功制备了可溶性抗体。并做了抗原结合活性鉴定。结论：利用单链大容量抗体库获得抗DNA-PKcs的噬菌体抗体基因并且成功制备成可溶性抗体,为今后的研究和应用奠定了基础。     

从大容量噬菌体抗体库中筛选抗Acr蛋白人源单链抗体

目的:从天然的大容量噬菌体抗体库中筛选特异的抗结核分枝杆菌晶体蛋白( alpha-crystallin Acr)的人源抗体.方法:以结核分枝杆菌Acr蛋白包被免疫管,通过对噬菌体抗体库进行4轮“吸附-洗脱-扩增”的过程从大容量抗体库中筛选特异性抗结核分枝杆菌Acr蛋白的抗体,并对可变区序列进行了测序分析.将特异性的噬菌体抗体感染HB2151菌,经IPTG诱导表达,制备了抗结核分枝杆菌Acr蛋白的可溶性单链抗体;对其序列和抗原结合活性进行分析鉴定.结果:经过4轮筛选,获得了43个与结核分枝杆菌Acr蛋白结合的阳性克隆,其中29个特异结合的克隆;测序分析有26不同的可变区片段;通过可溶性单链抗体(scFv)表达筛选到14株特异性结合Acr蛋白的可溶性单链抗体克隆;经过基因测序,分析了可变区基因的亚群.成功制备了可溶性单链抗体.Westren blotting分析证实筛选的人源单链抗体能与天然蛋白结合.结论:利用单链大容量抗体库获得抗结核分枝杆菌Acr蛋白的噬菌体抗体并且成功制备抗结核分枝杆菌Acr天然蛋白的可溶性单链抗体,为今后的研究和应用奠定基础.     

噬菌体抗体库的构建及抗乳腺癌细胞单链抗体的筛选

构建抗人乳腺癌细胞MCF 7的噬菌体单链抗体库 ,从中筛选MCF 7细胞特异性单链抗体。用MCF-7细胞免疫BALB C小鼠 ,取脾脏 ,提取总RNA ,用RT-PCR技术扩增小鼠抗体重链 (V_H)和轻链 (V_L)可变区基因 ,经重叠PCR(SOE-PCR) ,在体外将V_H和V_{L连接成单链抗体 (scFv)基因 ,并克隆到噬菌粒载体pCANTAB5E中 ,电转化至大肠杆菌TG1,经辅助噬菌体超感染 ,构建噬菌体单链抗体库。从该抗体库中筛选特异性识别MCF-7细胞的噬菌体单链抗体 ,将表面展示单链抗体的单克隆噬菌体转化大肠杆菌TOP10进行可溶性表达。成功地构建了库容为12×10⁶ 的抗MCF-7乳腺癌细胞的单链抗体库 ,初步筛选到了与MCF 7细胞特异性结合的scFv,Westernblot检测表明 ,在大肠杆菌TOP10中实现了单链抗体可溶性表达}     

全人源抗结肠癌噬菌体单链抗体库的构建及筛选鉴定

采用体外致敏法和EBV转化技术联合噬菌体展示技术构建噬菌体呈现型单链抗体库.从中筛选获得阳性克隆,并进行ELISA、免疫组化及测序鉴定.结果得到了库容为4.0×109的初级噬菌体抗体库,全长ScFv(Single-chain Fv)基因的插入率为90%.筛选获得两个克隆对HT-29呈强阳性反应,而与HFF等人正常细胞系呈弱阳性或阴性反应.免疫组织化学鉴定表明克隆F12与结肠癌组织和结肠癌旁组织阳性率的差别有统计学意义.由上述结果可见构建库容量达4.0×109的全人源抗结肠癌噬菌体单链抗体库是完全可行的,经筛选及鉴定获得了特异性较强的噬菌体克隆,为结肠癌的临床导向诊断和治疗奠定了基础.     

天然兔源噬菌体单链抗体库的构建与鉴定

目的:构建天然兔源噬菌体单链抗体库。方法:采用RT-PCR法从未免疫的兔子脾脏中克隆得到抗体重链可变区(VH)与轻链可变区(VL)基因,重叠PCR将VH和VL拼接成scFv片段,将scFv连接到噬菌粒pComb3XSS上,电转入XL1-Blue菌中,得到单链抗体库,并用此抗体库筛选抗肌酸激酶抗体。结果:构建了容量为4×108,基因重组率95%的单链抗体库,DNA指纹图谱显示抗体库多样性良好。以肌酸激酶为抗原,从该库中筛到3株抗肌酸激酶的抗体。结论:分析表明构建的天然兔源单链抗体库质量良好,可用于快速筛选、制备多种单链抗体。     

全人源抗肝癌噬菌体单链抗体库的构建与筛选鉴定

体外致敏并用EBV转化肝癌患者的PBMC．用PCR分别扩增VH和VL基因并组成ScFv基因．将ScFv基因与载体fuse5连接后,电击转化大肠杆菌MC1061,构建噬菌体呈现型ScFv库．用人肝癌细胞及人肝细胞对初级噬菌体抗体库进行亲和富集及phage-ELISA筛选．筛选获得的阳性克隆进行ELISA及免疫组化鉴定并测序．结果表明,经EBV转化的4例肝癌患者PBMC,ELISA检测均有抗肝癌抗体产生,经多次PCR,扩增出6种VH（γ、μ）和9种VL（κ、λ）基因,经连接组成54种ScFv基因．将ScFv基因与载体连接后,导入大肠杆菌MC1061,得到库容为1．0×10^8的初级噬菌体抗体库,全长ScFv基因的插入率为80％．用人肝癌细胞系HepG2和人肝细胞系QSG-7701对抗体库进行三轮正负淘选和富集后,从中随机挑取533个克隆进行ELISA筛选,得到179个阳性克隆,阳性率为33．6％．将179个阳性克隆进一步进行其他细胞系的鉴定,发现克隆A82对肝癌细胞系HepG2、人胚肾上皮细胞系HEK293呈强阳性反应,免疫组织化学结果显示与人肝细胞癌组织有特异性反应,而不与正常肝组织反应．且A82的相对亲和力为2．4mol／L,解离常数Kd为5．32×10^-9mol／L,显示其亲和力较高．对克隆A82进行测序分析,结果表明：A82全长742bp,含linker cDNA序列45bp,重链可变区基因与人胚系IgVH3-23有94.3％的同源性,轻链可变区基因与人胚系IgV4-2有94．9％的同源性,V．D．J分别属于VH3-23-D2-21-JH6-linker-V4-2-JL2．由上述结果可见,应用体外抗原致敏方法和EBV转化技术联合噬菌体抗体库技术,构建了库容量达1×10^8的全人源抗肝癌单链抗体库,通过细胞ELISA和免疫细胞化学鉴定,获得的噬菌体抗体克隆A82具有较强的特异性,为肝癌的临床诊断及导向治疗奠定了基础．     

鼠源E型肉毒毒素免疫噬菌体单链抗体库的构建及筛选

目的:构建鼠源E型肉毒毒素(BoNT/E)免疫噬菌体单链抗体库,筛选BoNT/E特异性抗体。方法:从E型肉毒类毒素免疫小鼠的脾细胞中提取总RNA,反转录成cDNA,分别扩增出小鼠重链可变区基因和轻链可变区基因;通过重叠延伸PCR将重链可变区基因和轻链可变区基因组装成scFv基因,重组于噬粒pS100中,电转化大肠杆菌TG_1,合并所有克隆成初级库;随机挑取克隆进行核苷酸序列测定,对初级库序列多样性进行分析;在辅助噬菌体M_(13)K_(07)的拯救下,构建成scFv噬菌体抗体库;用纯化的BoNT/E对鼠源BoNT/E免疫噬菌体单链抗体库进行3轮富集筛选,制备单克隆的噬菌体抗体颗粒进行酶联免疫吸附试验,阳性克隆进行核苷酸序列测定。结果:鼠源BoNT/E免疫噬菌体单链抗体库的库容为7.09×10~7,随机挑取的20个克隆序列各不相同,序列正确率为85%,基本覆盖了IgHV、IgKV、IgLV的优势家族;纯化的BoNT/E作为抗原通过3轮筛选,噬菌体抗体富集了66倍,第3轮筛选后随机挑取90个克隆制备噬菌体抗体颗粒,酶联免疫吸附试验分析有88个呈现阳性反应,序列比对得到了24个不同序列的BoNT/E特异性抗体。结论:构建了库容量达7.09×10~7的鼠源BoNT/E免疫噬菌体单链抗体库,筛选得到了24个不同序列的BoNT/E特异性抗体。     

噬菌体抗体库技术

噬菌体抗体库技术用ＰＣＲ扩增出抗体的全套可变区基因,通过噬菌体表面表达技术,把Ｆａｂ段或单链抗体表达在噬菌体表面,经过“吸附－洗脱－扩增”过程筛选并富集特异性抗体。     

噬菌体单链抗体文库的构建及筛选

噬菌体抗体是继多克隆抗体、单克隆抗体之后兴起的第3代基因工程抗体.噬菌体抗体库技术是抗体基因文库技术和噬菌体表面展示技术相结合形成的一项新技术与方法,在生物科学领域极具潜力.现主要就近年来该技术在抗体基因扩增、抗体库的构建、筛选方法等方面的进展进行综述.     

抗松材线虫纤维素酶单链抗体库的构建及筛选

构建鼠源性松材线虫纤维素酶（Bursaphelenchus xylophilus cellulase, BXC）的噬菌体单链抗体库,从中筛选特异性BXC的单链抗体。以BXC为抗原免疫BALB/C小鼠,从脾脏提取总RNA,用RT-PCR技术扩增小鼠抗体重链（V_H）和轻链(V_L)可变区基因。经重叠PCR(SOE-PCR)在体外将V_H和V_L连接成单链抗体(scFv)基因,并克隆到噬菌粒载体pCANTAB5E中,电转化至大肠杆菌TG1,经辅助噬菌体超感染,成功构建了库容为5×10⁴的Anti-BXC单链抗体库,并从该抗体库中初步筛选到了特异性识别BXC的噬菌体单链抗体scFv。将表面展示单链抗体的单克隆噬菌体转化大肠杆菌HB2151进行可溶性表达,SDS-PAGE及Western blot分析结果显示,可溶性scFv获得表达,且与BXC具有结合活性,为松材线虫的检验检疫以及病理学研究奠定了基础。     

抗EGFRvIII噬菌体抗体库的构建和筛选

目的：应用噬菌体展示技术筛选针对表皮生长因子受体突变体Ш (epidermal growth factor receptor variant type Ⅲ, EGFRvIII)的单链抗体 (single chain Fv, scFv)。方法：利用原核表达纯化的人EGFRvIIIex蛋白和高表达EGFRvIIIex的小鼠成纤维细胞系NIH3T3免疫小鼠,扩增VH和VL片段并拼装成scFv 基因,连接至噬菌粒pCANTAB 5E,电击转化Hpd3cells,构建噬菌体单链抗体库,并进行3轮富集筛选。在第4轮筛选时,采用了降低抗原浓度的方法。然后将筛选得到的阳性克隆测序分析,转化E.coli HB2151,IPTG 诱导可溶性scFv 的表达。结果：构建了库容为7.9×107 的噬菌体单链抗体库。经过第4轮低浓度抗原筛选,得到了较高亲和力的克隆。取单个阳性克隆测序分析结果表明,该抗EGFRvIII scFv 基因序列长807 bp,编码268个氨基酸。IPTG诱导后表达的可溶性scFv 可分别与纯化的EGFRvIIIex抗原以及细胞表面的EGFRvIIIex结合。结论：利用噬菌体抗体库筛选得到了高亲和力的抗EGFRvIII scFv,为开发针对EGFRvIII的抗体药物提供了靶向载体分子。     

应用噬菌体抗体库技术制备特异抗人纤维蛋白鼠单链抗体

应用Pharmacia公司的重组噬菌体抗体系统,从经过人交联纤维蛋白特异抗原D二聚体(DD)免疫过的鼠脾细胞mRNA中构建出组合单链抗体(ScFv)cDNA文库。文库cDNA克隆到噬菌粒载体pCANTAB5E,转化大肠杆菌TG1,得到2.5×10~5个氨苄抗性菌落。通过噬菌体表面呈现,用DD对表达的重组噬菌体单链抗体文库进行三轮亲和富集获得一株特异抗DD的噬菌体单链抗体(ScFvA11)。经Phage-ELISA鉴定,呈现在噬菌体表面的ScFvA11与DD结合的ELISA阳性滴度小于10~7tfu/ml,而与人纤维蛋白原结合的ELISA滴度大于10~(10)tfu/ml,两者相差1000倍以上。表明ScFvA11具有较好的DD结合特异性。经序列分析,ScFvA11cDNA全长729bp,其中Vh基因354bp,编码118个氨基酸;Vl基因327bp,编码108个氨基酸;Vh与Vl之间为(Gly_4Ser)_315个氨基酸连接肽。     

抗EGFRvⅢ噬菌体抗体库的构建和筛选

目的:应用噬菌体展示技术筛选针对表皮生长因子受体突变体Ш(epidermal growth factorreceptor variant typeⅢ,EGFRvIII)的单链抗体(single chain Fv,scFv)。方法:利用原核表达纯化的人EGFRvIIIex蛋白和高表达EGFRvIIIex的小鼠成纤维细胞系NIH3T3免疫小鼠,扩增VH和VL片段并拼装成scFv基因,连接至噬菌粒pCANTAB5E,电击转化Hpd3cells,构建噬菌体单链抗体库,并进行3轮富集筛选。在第4轮筛选时,采用了降低抗原浓度的方法。然后将筛选得到的阳性克隆测序分析,转化E.coliHB2151,IPTG诱导可溶性scFv的表达。结果:构建了库容为7.9×107的噬菌体单链抗体库。经过第4轮低浓度抗原筛选,得到了较高亲和力的克隆。取单个阳性克隆测序分析结果表明,该抗EGFRvIII scFv基因序列长807bp,编码268个氨基酸。IPTG诱导后表达的可溶性scFv可分别与纯化的EGFRvⅢex抗原以及细胞表面的EGFRvⅢex结合。结论:利用噬菌体抗体库筛选得到了高亲和力的抗EGFRvⅢ scFv,为开发针对EGFRvⅢ...     

噬菌体抗体库的优化

噬菌体抗体组合文库技术作为噬菌体展示和抗体组合文库两种技术的集成,由于它具有库容量大、特异性高、和敏感性强的优点而被誉为抗体技术的第三次革命。但是由于一些技术上的原因,使得它无法得到广泛的应用,本文就其优化进行综述。     

抗大肠癌噬菌体单链抗体的筛选及初步鉴定

 应用 3种方法 (肿瘤细胞膜表面和胞内、裸鼠体内和组织切片 ) ,从全人源化的抗大肠癌噬菌体初级抗体库中筛选肿瘤特异性的噬菌体单链抗体 (Sc Fv) .在肿瘤细胞经过 3轮亲和选择 ,回收结合胞膜和内化进入胞内的噬菌体 ,得到抗肿瘤噬菌体单链抗体的富集倍数为 430倍 ;荷瘤裸鼠体内注入初级抗体库后 ,在不同时刻点处死裸鼠 ,回收肿瘤组织内的噬菌体 ,其回收率在 2 4 h时最高 ;初级抗体库与大肠癌组织切片亲和选择后 ,从冰冻组织切片上比从石蜡组织切片上回收得到的噬菌体高出约 1 .6倍 .从上述方法挑选单克隆 ,经 ELISA筛选抗大肠癌阳性噬菌体克隆株 ,分离得到 5个对大肠癌细胞反应较好的单克隆噬菌体单链抗体 .进一步用细胞 ELISA检测对各种肿瘤细胞的特异性反应 ,其中 4个对大肠癌细胞有很好的特异性 ,1个克隆对所有肿瘤细胞均有反应 .因此 ,3种方法用于筛选抗大肠癌噬菌体初级抗体库是有效的 ,具有推广和应用价值 .     

噬菌体抗体库筛选技术

噬菌体展示技术（Ｐｈａｇｅ Ｄｉｓｐｌａｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）为制备高亲和性抗体提供了有力的工具。噬菌体抗体库的筛选是其中关键的环节,为了提高筛选效率,用包被在固体表面的抗原进行筛选的传统方法不断地被改进,如宿主菌直接洗脱和双层膜筛选系统和抗抗体替代抗原筛选系统。将噬菌体感染宿主菌的过程与筛选过程相关联,产生了选择性感染筛选系统。     

人源天然ScFv噬菌体抗体库的构建及鉴定

噬菌体抗体库技术是获得治疗性抗体的一条重要途径。以20份健康人外周血为样本,通过提取淋巴细胞、逆转录－PCR（RT PCR）、抗体可变区基因的扩增、重叠PCR获得单链抗体（ScFv）基因,将ScFv克隆入噬粒载体,通过近300次的电转化获得了库容量为1.3×109的全人源天然ScFv噬菌体抗体库。通过随机挑克隆测序和用5种不同抗原筛选对抗体库进行了初步验证。随机测序表明抗体库具有较好的多样性,用5种不同抗原对其进行筛选,均获得了特异性噬菌体抗体的不同富集,表明成功构建了一个多样性良好的人源天然ScFv噬菌体抗体库。     

从构建的噬菌体抗体库中筛选抗甲肝人单抗

用固相化甲肝抗原,对所构建的噬菌体抗体库进行了3轮淘筛。第3轮淘筛后洗脱下来的噬菌体,较第l轮增加了近100倍。含有抗体重链基因和轻链基因的重组克隆．也由淘筛前的25％增至100％。说明甲肝抗原对抗体库的淘筛,富集了表面呈现甲肝人单抗的噬菌体。经夹心ELISA法筛选到抗甲肝病毒噬菌体抗体,并以竞争抑制实验进一步证实了这些抗体的特异性。