生物膜能量偶联ATP酶的比较研究——Ⅰ.鼠肝线粒体内膜与ATP酶(F_1)的人工重组及ANS萤光探针与ATP酶的结合

本文报导了大鼠肝线粒体内膜ATP酶的析离和重组,以及膜对ATP酶的结构和功能的影响。用(1)胰蛋白酶-尿素、(2)硅钨酸盐和(3)枯草杆菌蛋白酶三种方法分别制备的去ATP酶(F_1)的线粒体内膜与可溶性的F_1重组后,完全恢复或部分恢复到天然线粒体内膜的ATP酶活力水平。寡霉素敏感性测定、ANS结合的发射萤光光谱测定、电镜负染标本观察和低温处理试验等都一致证明,ATP酶与膜重组后表现了一系列与天然膜相似的性质。ANS萤光探针与线粒体内膜结合的萤光增强效应主要在于ANS与ATP酶(F_1)的结合并与F_1的分子构象有密切关系。经胰蛋白酶-尿素处理去掉F_1的线粒体内膜基本上丧失了ANS的萤光增强效应。可溶性F_1经0℃处理2小时后,丧失酶水解活力的84%和ANS萤光增强效应的96.4%。F_1与膜结合后,则表现了对0℃低温的稳定性。结果提示,ANS可能与ATP酶分子的疏水微区相结合;ATP酶分子疏水结构的存在对于表现酶的水解活力和ANS的萤光增强效应是必要的条件;低温处理破坏了酶分子内的疏水结构;膜与ATP酶结合则有稳定酶分子的疏水结构和分子构象的作用。     

生物膜能量偶联 ATP 酶的研究:鼠肝线粒体 ATP 酶(F_1)的解离和重组

纯化的鼠肝线粒体ATP 酶(F_1)在1MKCl-TEA 缓冲液(Tris-SO_4~-,50mM;EDTA,1mM;ATP,2mM;pH=7.6)中,2～3℃下处理40～90分钟丧失ATP 水解活力,比活力从70～100下降到0.5～1.0。7%聚丙烯酰胺凝胶电泳证明,随着酶活力的下降和F_1的电泳酶带的消失,在凝胶柱上出现三条F_1的解离蛋白带。解离后的F_1于30℃对TEA(pH5.7)介质透析脱盐能重新出现有活力的F_1,活力恢复到原来酶活力的19～22%,此种重组的F_1在pH 中性偏碱条件下保持稳定。重组过程不需外加Mg~( )的促进和SH 基的保护。重组的F_1与去F_1的Tu 膜可重新结合,完全恢复原来线粒体内膜的ATP 酶水解活力和对DCCD 的敏感性。     

生物膜能量偶联ATP酶的研究:鼠肝线粒体ATP酶(F_1)~*的解离和重组

纯化的鼠肝线粒体ATP酶(F_1)在1MKCl-TEA缓冲液(Tris-So_4~-,50mM;EDTA,1mM;ATP,2 mM;pH=7.6)中,2～3℃下处理40～90分钟丧失ATP水解活力,比活力从70～100下降到0.5～1.0。7%聚丙烯酰胺凝胶电泳证明,随着酶活力的下降和F_1的电泳酶带的消失,在凝胶柱上出现三条F_1的解离蛋白带。解离后的F_1于30℃对TEA(pH5.7)介质透析脱盐能重新出现有活力的F_1,活力恢复到原来酶活力的19～22%,此种重组的F_1在pH中性偏碱条件下保持稳定。重组过程不需外加Mg~( )的促进和SH基的保护。重组的F_1与去F_1的Tu膜可重新结合,完全恢复原来线粒体内膜的ATP酶水解活力和对DCCD的敏感性。     

昆虫线粒体发生的生化和亚显微结构的研究

线粒体在细胞中的发生目前有各种观点的争论,其理论意义涉及到真核细胞的起源和进化、染色体和线粒体两个遗传体系之间的相互关系以及生物膜合成和组装机理等。我们对处于分化中的昆虫胸肌线粒体的观察结果是:(1)对粘虫变态期的呼吸和细胞色素氧化酶活力测定表明蛹期第8天的组织形成阶段是胸肌细胞分化和其线粒体发生的开始。电镜观察表明,线粒体形成分两个阶段:由颗粒结构(可能是酶蛋白与脂的复合体)装配成膜片和膜泡;由膜泡分化出内嵴,进而发育为线粒体。(2)QO₂值,P/O比和ATP酶活力的出现与膜结构的分化发育相平行。α-甘油磷酸氧化酶系统比谷氨酸氧化酶系统装配早;电子传递酶系比磷酸化酶系装配早。(3)蝗虫胸肌分化过程的电镜观察证明;先形成内膜小泡(直径约0.1微米左右),后形成外膜,组成简单线粒体;后者进一步分化发育为成熟线粒体。(4)QO₂值,P/O比和ATP酶活力与膜结构分化发育相平行。ATP酶的出现与能量转涣功能呈平行关系。膜形成早期和“幼稚”线粒体阶段,ATP酶尚未装配。(5)综合上述结果:线粒体膜由非膜结构逐步组装形成,线粒体内膜的各酶系组装次序不同步,线粒体DNA控制合成的膜蛋白在膜结构形成中似乎起核心和骨架作用;线粒体总组装过程在不同细胞中表现为多种途径和方式。     

外源胆固醇对水稻根端线粒体ATP酶活力的影响

外源胆固醇无论是通过根系吸收或是直接与离体线粒体一起温育的方式,在试验浓度范围内均能提高水稻根端线粒体ATP酶的活力,同时观察到外源胆固醇能明显降低ATP酶表现活化能(Apparent activation energy,AEa)在Arrhenius图上的折点温度。其中通过根系吸收进入线粒体膜内后,其线粒体ATP酶AEa的两个折点温度由对照的27.7℃和15.5℃分别降低到24.5℃和12.7℃;直接与离体线粒体一起温育的两个折点温度分别降低到18.8℃和9.6℃。试验结果证明,适量的外源胆固醇不仅对水稻根端线粒体ATP酶活力具有明显的促进作用,而且对降低线粒体膜脂的相变温度也有明显的调节作用。     

线粒体ATP合酶抑制因子(ATPIF1)在能量代谢中的作用

线粒体是真核细胞中动态双层膜结构的细胞器,由外至内可以划分为四个功能区,分别是线粒体外膜(OMM),线粒体膜间隙,线粒体内膜(IMM)和线粒体基质。在线粒体内膜上的复合体V(complex V)即为ATP合酶,其主要功能是合成ATP。实际上,ATP合酶既合成也水解ATP,对细胞ATP水平有双向调节作用。ATP合酶的活性受抑制因子(ATPIF1)的调节。ATPIF1与ATP合酶结合后,对其ATP合成和水解功能进行抑制,从而影响线粒体和细胞内ATP水平。ATPIF1活性受到组氨酸质子化状态和丝氨酸磷酸化修饰的调节。在缺氧,交感神经兴奋和肿瘤等条件下,ATPIF1发挥重要代谢调节作用,但其在代谢紊乱疾病中的作用尚不明确。本文在综述ATPIF1文献的基础上,对其在糖脂代谢紊乱疾病中的作用进行分析及展望。     

生物膜组分对膜功能和膜脂相变的调控 Ⅰ.吐温表面活性剂对玉米根端线粒体ATP酶活力的影响

膜脂流动性和膜结合酶的关系极为密切,同时膜脂组分也明显地制约着膜的流动性。本试验选用了三种不同脂肪酸碳链的吐温表面活性剂(Tween 20,Tween40,Tween 80)作为线粒体的添加物,观察对玉米根端线粒体ATP酶活力的调节作用。结果看到玉米根端线粒体ATP酶在8～32℃范围内活化能在15.5℃处出现了一个折点。添加吐温20、40、80后在8～32℃范围内都出现了二个活化能的折点,分别为26.5℃和12.3℃;25.4℃和15.3℃;22.8℃和12.8℃。清洗吐温后ATP酶活化能的转折点温度与添加吐温时没有明显差异,表明吐温的脂肪酸链可能与线粒体膜相结合,因而改变了线粒体ATP酶的活化能的折点温度。     

生物膜组分对膜功能和膜脂相变的调控——Ⅰ.吐温表面活性剂对玉米根端线粒体ATP酶活力的影响

膜脂流动性和膜结合酶的关系极为密切,同时膜脂组分也明显地制约着膜的流动性。本试验选用了三种不同脂肪酸碳链的吐温表面活性剂(Tween 20,Tween40,Tween 80)作为线粒体的添加物,观察对玉米根端线粒体ATP 酶活力的调节作用。结果看到玉米根端线粒体ATP酶在8～32℃范围内活化能在15.5℃处出现了一个折点。添加吐温20、40、80后在8～32℃范围内都出现了二个活化能的折点,分别为26.5℃和12.3℃;25.4℃和15.3℃;22.8℃和12.8℃。清洗吐温后ATP 酶活化能的转折点温度与添加吐温时没有明显差异,表明吐温的脂肪酸链可能与线粒体膜相结合,因而改变了线粒体ATP 酶的活化能的折点温度。     

生理病理状态下线粒体合成ATP的动态调控机制

线粒体是细胞的代谢中心之一,不仅产生大量的ATP为细胞提供能量,还参与多种生物分子(例如核酸、氨基酸、胆固醇和脂肪酸)合成及代谢废物的处理。ATP是细胞重要的"能源货币",是能量载体和信号分子,参与调节细胞的各种生命活动。动物与人在激烈运动时,ATP消耗速率增加数十倍,但细胞内的ATP仍维持在"设定点"水平,不出现降低。因此,传统生理学观点认为,动物细胞内ATP水平保持恒定。但新的研究结果表明,生物细胞内ATP水平存在波动。生理条件下,增加能量物资(糖、脂和氨基酸等)和氧供,促进线粒体ATP合成,可使细胞内ATP水平出现一过性升高。新的研究证明,在肥胖情况下,由于能量物质的过多供应,细胞内ATP水平出现持续性升高,构成代谢紊乱的源头信号。线粒体ATP合成受多种因素影响,如氧化应激、钙超载、缺氧、线粒体膜通透性增加和线粒体DNA突变等。这些因素与疾病条件下细胞内ATP水平持续降低相关,常见的疾病包括阿尔茨海默症、帕金森疾病、精神分裂症、肿瘤、心衰、全身炎症反应综合征等。本综述简要概述线粒体调节细胞内ATP水平的研究进展,重点讨论造成ATP波动的因素、机制及病理生理学意义。     

生理病理状态下线粒体合成ATP动态调控机制

线粒体是细胞的代谢中心之一,不仅产生大量的ATP为细胞提供能量,还参与多种生物分子（例如核酸、氨基酸、胆固醇和脂肪酸）合成及代谢废物的处理。ATP是细胞重要的“能源货币”,是能量载体和信号分子,参与调节细胞的各种生命活动。动物与人在激烈运动时,ATP消耗速率增加数十倍,但细胞内的ATP仍维持在“设定点”水平,不出现降低。因此,传统生理学观点认为,动物细胞内ATP水平保持恒定。但新的研究结果表明,生物细胞内ATP水平存在波动。生理条件下,增加能量物资（糖、脂和氨基酸等）和氧供,促进线粒体ATP合成,可使细胞内ATP水平出现一过性升高。新的研究证明,在肥胖情况下,由于能量物质的过多供应,细胞内ATP水平出现持续性升高,构成代谢紊乱的源头信号。线粒体ATP合成受多种因素影响,如氧化应激、钙超载、缺氧、线粒体膜通透性增加和线粒体DNA突变等。这些因素与疾病条件下细胞内ATP水平持续降低相关,常见的疾病包括阿尔茨海默症、帕金森疾病、精神分裂症、肿瘤、心衰、全身炎症反应综合征等。本综述简要概述线粒体调节细胞内ATP水平的研究进展,重点讨论造成ATP波动的因素、机制及病理生理学意义。     

生理病理状态下线粒体合成ATP动态调控机制

线粒体是细胞的代谢中心之一，不仅产生大量的ATP为细胞提供能量，还参与多种生物分子（例如核酸、氨基酸、胆固醇和脂肪酸）合成及代谢废物的处理。ATP是细胞重要的“能源货币”，是能量载体和信号分子，参与调节细胞的各种生命活动。动物与人在激烈运动时，ATP消耗速率增加数十倍，但细胞内的ATP仍维持在“设定点”水平，不出现降低。因此，传统生理学观点认为，动物细胞内ATP水平保持恒定。但新的研究结果表明，生物细胞内ATP水平存在波动。生理条件下，增加能量物资（糖、脂和氨基酸等）和氧供，促进线粒体ATP合成，可使细胞内ATP水平出现一过性升高。新的研究证明，在肥胖情况下，由于能量物质的过多供应，细胞内ATP水平出现持续性升高,构成代谢紊乱的源头信号。线粒体ATP合成受多种因素影响，如氧化应激、钙超载、缺氧、线粒体膜通透性增加和线粒体DNA突变等。这些因素与疾病条件下细胞内ATP水平持续降低相关，常见的疾病包括阿尔茨海默症、帕金森疾病、精神分裂症、肿瘤、心衰、全身炎症反应综合征等。本综述简要概述线粒体调节细胞内ATP水平的研究进展，重点讨论造成ATP波动的因素、机制及病理生理学意义。     

质膜钙离子ATP酶

钙离子(Ca2+)是重要的第二信使,通过与效应蛋白的结合和解离,以及在不同细胞器之间的穿梭运动而精确调控细胞活动,参与多种重要生命过程。细胞内具有精确调节Ca2+时空分布的调控系统。在静息状态下,细胞内的游离Ca2+浓度约为100 nmol/L;而当细胞受到信号刺激后,胞内的Ca2+浓度可上升至1000 nmol/L甚至更高。细胞中存在多种跨膜运送Ca2+的膜蛋白,以精确调节Ca2+浓度的时空动态变化,其中,细胞质膜上的多种Ca2+通道(包括电压门控通道、受体门控通道、储存控制通道等),以及内质网/肌质网和线粒体等胞内"钙库"膜上的雷诺丁受体、三磷酸肌醇受体等膜蛋白复合物,均可提升胞内Ca2+浓度,而细胞质膜上的钠钙交换体、质膜Ca2+-ATP酶、"钙库"膜上的内质网Ca2+-ATP酶、线粒体Ca2+单向转运体等,可将Ca2+浓度降低至静息态水平。质膜钙ATP酶是向细胞外运送Ca2+的关键膜蛋白,本文将对其结构、功能及其酶活性的调控机制做一简要综述。     

V型H＋－ATP酶的分子结构及其药理学意义

V型ATP酶广泛存在于细胞内膜系统,如溶酶体,内膜体,高尔基体,分泌颗粒等,V-ATP酶水解ATP,建立跨膜质子电化学梯度(△μH^＋),酸化细胞内外环境.研究证明△μH^＋和酸化作用为细胞的内吞、外泌、膜流和物质转运等生理生化反应提供了必需的条件.V-ATP酶在生命活动中的重要性和它的实际意义,日益引起人们的兴趣与关注,是当前H^＋-ATP酶家族中一个异常活跃的研究分支.     

杂交鹅掌楸体胚发生过程中ATP酶活性的超微细胞化学定位

利用透射式电镜,通过胚性细胞的超微切片观察,对杂交鹅掌楸体细胞胚胎发生和发育过程中ATP酶活性进行了超微细胞化学定位.结果表明,非胚性细胞的质膜、液泡膜等膜系统当中存在ATP酶活性,质体、核膜、细胞壁以及细胞间隙上有少许沉积;早期胚性细胞ATP酶反应产物主要沉积于质膜、液泡膜上、淀粉粒、细胞壁加厚处;胚性细胞后期ATP酶活性从质膜逐渐转移入细胞内,细胞质、壁旁体、胞间连丝、细胞膜与细胞间隙、细胞核等处均有ATP酶活性反应.随着胚性细胞的发育及分裂,包裹细胞的厚壁、细胞核、核仁与染色质等处也出现ATP酶活性反应沉淀物.说明杂交鹅掌楸体细胞胚胎发生及发育过程中存在丰富的能量代谢.     

酞菁类光敏剂对肝癌细胞线粒体和微粒体的光辐射效应

酞菁(Phthalocyanin,PC)化合物结构类似卟啉,是一种新的光敏剂。它的四个苯环上各取代一个磺酸基成为四磺酸酞菁(phthalocyanine tetrasulfonate, TSPC)。TSPC-30μg/ml合并照光30分钟,肝癌细胞线粒体ATP酶和微粒体G-6-P酶明显受抑,对线粒体单胺氧化酶(MAO)没有明显影响。在上述剂量和照光条件下,线粒体和微粒体膜蛋白巯基含量显著减少,而膜脂质过氧化产物增多,线粒体膜通透性改变,导致线粒体肿胀。     

水稻白化苗质体中光合磷酸化偶联因子的存在

用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离水稻白化苗质体EDTA提取物的蛋白,在偶联因子的位置有一带出现;白化苗质体具膜上(Mg~(++)—Ca~(++))—ATP酶活力,质体膜与菠菜类囊体残缺膜重组后有光合磷酸化活力。分部离心和电镜观察的结果表明,活力检测中所用的600～1500×g之间的沉降部分确属质体部分,证明白化苗质体中有光合磷酸化偶联因子的存在。     

一种简便纯化肾钠钾ATP酶的方法

本文描述了一个简便的从猪肾外髓迅速纯化(Na~ -K~ )ATP 酶的方法。避免了超离心机的使用。所得制剂的比活力为440～600微克分子磷/毫克蛋白/小时,37℃。主要纯化过程包括用两价阳离子Mg~( )沉淀微粒体组份,SDS 溶解微粒体杂蛋白及Sepharose 2B 柱层析。     

一种简便纯化肾钠钾ATP酶的方法

本文描述了一个简便的从猪肾外髓迅速纯化(Na~ -K~ )ATP酶的方法。避免了超离心机的使用。所得制剂的比活力为440～600微克分子磷/毫克蛋白/小时,37℃。主要纯化过程包括用两价阳离子Mg~( )沉淀微粒体组份,SDS溶解微粒体杂蛋白及Sepharose 2B柱层析。     

NG-硝基-L-精氨酸对大鼠局灶性缺血脑区线粒体损伤的影响

目的:观察非选择性一氧化氮合酶抑制剂NG-硝基-L-精氨酸(NG-nitro-L-arginine,L-NA)对局灶性脑缺血大鼠脑线粒体的损伤作用,以探讨其改善缺血性脑损伤的作用机制。方法:将大鼠随机分为假手术组、缺血对照组、L-NA治疗组,采用线栓法阻断大鼠大脑中动脉(MCAO)复制局灶性脑缺血模型,分别于缺血后2h、6h、12h给药治疗3d,迅速断头取脑,差速离心法提取缺血侧脑组织线粒休,迅速测定线粒体膜肿胀度及线粒体活力,测定线粒体总ATP酶、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性,以及线粒休一氧化氮(NO)、丙二醛(MDA)含量:电镜观察缺血后皮层神经元超微结构的改变及L-NA对其影响。结果:在大鼠MCAO后线粒体膜肿胀度增加,线粒体活力下降,线粒体NO、MDA含量明显增加,线粒体总ATP酶、SOD、GSH-Px活性均明显下降:缺血后2h、6h、12h给予L-NA治疗3d与缺血对照组相比NO含量明显下降,缺血后12h治疗组线粒体膜肿胀度、线粒体活力、总ATP酶、SOD、GSH-Px活性均显著升高、MDA含量下降。电镜结果显示脑缺血后皮层神经元水肿,线粒体肿胀、嵴断裂、溶解、消失,且随缺血时间延长损伤加重;缺血后12h给予L-NA治疗能明显改善脑缺血引起的神经元水肿、线粒体肿胀和空泡化。结论:L-NA能明显抑制脑缺血后线粒体NO生成,在缺血早期给予L-NA对缺血性脑损伤无改善作用:缺血后期给予L-NA,能明显降低线粒体膜肿胀程度,改善线粒体能量供应,增强线粒体抗氧化作用及其活力,从而减轻脑缺血损伤。     

利用萤光素酶标记的肿瘤细胞建立肝癌原位移植模型及其活体成像

目的：利用生物发光成像技术非侵入性地监测活体裸鼠原位肝癌发展过程。方法：将包含有萤火虫萤光素酶基因的pCI-neo-Luc载体转染人肝癌HepG2细胞系,筛选获得具有高萤光素酶活性的细胞克隆;利用流式细胞仪对萤光素酶表达的稳定性进行初步研究,并分析细胞的生物发光情况;持续表达萤光素酶的肿瘤细胞培养扩增后被植入裸鼠皮下,2周后以形成的异体瘤作为供体瘤,进行肝脏原位移植手术;对建立的肝癌原位移植模型,用影像学资料显示肿瘤部位,用IVIS成像系统动态监测肿瘤生长情况。结果：体外影像的结果显示,表达萤光素酶细胞的数量与发光强度呈正相关;活体成像的结果显示。成功地建立了萤光素酶标记的原位肝癌动物模型。结论：生物发光成像可以监测活体内肝癌演进过程,为抗肿瘤药物的筛选和评价提供了新的手段和工具。